Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem
9 stycznia 2020
Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.
Protokół ten umożliwił opracowanie modeli raka głowy i szyi ze specyficzną operacją genomiczną, znacząco wpływając na nasze zrozumienie roli określonych mutacji genów w procesie nowotworu. Główną zaletą tej techniki jest łatwość, z jaką linia komórkowa może zostać opracowana z praktycznie każdego narządu. Procedurę zademonstruje Manu Prasad, doktorant z mojego laboratorium.
Zacznij od użycia nożyczek chirurgicznych, aby pobrać język od sześciotygodniowego samca lub samicy transgenicznej myszy B6. Użyj skalpela, aby zmielić tkankę na bardzo małe fragmenty i zbierz kawałki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 4,5 mililitra zwykłego podłoża RPMI bez surowicy. Dodaj 200 mikrolitrów potrójnej mieszanki enzymów do probówki i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, stukając w probówkę co 10 minut, aby zwiększyć dysocjację enzymatyczną tkanki.
Pod koniec inkubacji zatrzymaj reakcję z 5% FBS w PBS i przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o rozmiarze 70 mikrometrów, aby oddzielić komórki od większych fragmentów tkanki. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach kompletnego podłoża. Następnie umieść komórki w trzech mililitrach kompletnego podłoża na 16-milimetrowe naczynie.
Przenieś agregaty komórek zatrzymane na górze filtra do oddzielnej 16-milimetrowej płytki hodowlanej i dodaj trzy mililitry kompletnej pożywki. Trzymaj obie szalki w inkubatorze, aż utworzą się odrębne kolonie komórek. Po tygodniu hodowli zbadaj mikroskopowo pierwotne hodowle komórkowe pod kątem obecności zanieczyszczenia fibroblastami, traktując komórki 25% trypsyną w 02% EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę i usuń wszelkie fibroblasty.
W 10 dniu hodowli użyj 25% trypsyny w 02% EDTA przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zebrać komórki z zawiesiny komórkowej lub kultur agregacji komórkowych i zobaczyć dwa razy od 10 do piątego komórek pierwotnych w dwóch mililitrach pożywki na studzienkę do każdego dołka 6-dołkowej płytki. Następnego dnia transdukuj komórki z jednym razy 10 do 12 genomów wirusa na mililitr i inkubuj komórki w pożywce zawierającej cząsteczki wirusa przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty hodowli dwoma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki na studzienkę i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli komórkowych.
Po dwóch tygodniach ekspansji hodowli wysiewaj komórki do walidacji i eksperymentów rakotwórczych in vivo. Korzystając z wektora AAV CAS9, określono od 10 do 12 genomów wirusa na mililitr wirusa, aby skutecznie przekształcić pierwotne komórki metamfetaminy w mapy rakotwórcze przy użyciu protokołu, jak pokazano. Transdukowane komórki wyrażają Cre, CAS9 i białko zielonej fluorescencji.
Wstrzyknięcie pięciu razy 10 do piątych pierwotnych map transdukowanych AAV do języka, wargi i skóry myszy NOD SCID powoduje powstawanie guza u tych zwierząt, w przeciwieństwie do wstrzykiwania pierwotnych map, które nie wywołują guzów. Transformację nowotworową pierwotnych komórek nabłonka języka można potwierdzić za pomocą immunofluorescencji i western blot. Analiza genomiczna poprzez głębokie sekwencjonowanie DNA, wyizolowanego z transformowanych komórek, potwierdza skuteczną edycję genów i przesunięcie ramki ramki genu nowotworowego 53 i APC przez system AAV CAS9.
Ponadto przekształcone komórki języka skutecznie tworzą guzy u dzikich myszy czarnych C57. Analiza immunohistochemiczna komórek nowotworowych ujawnia cytoplazmatyczną ekspresję E-kadheryny i keratyny 14, markerów tkanki nabłonkowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy zawsze pamiętać, że zbyt duże mielenie lub zbyt intensywna reakcja enzymatyczna prowadzą do zmniejszenia żywotności komórek, co prowadzi do zmniejszenia wydajności transakcji wirusa.
Za pomocą tej procedury linie komórkowe mogą być genetycznie modyfikowane, aby uzyskać wgląd w potencjał rakotwórczy i przerzutowy komórek rakowych z dowolnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia opracowanie modeli raka głowy i szyi ze specyficznymi zmianami genomicznymi, co pogłębia nasze zrozumienie mutacji genowych w neoplazji. Technika ta pozwala na łatwe generowanie linii komórkowych z różnych organów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Genetyka
Wprowadzenie
- Modele mysie są niezbędne do badania nowotworów głowy i szyi.
- Specyficzne mutacje genów odgrywają krytyczną rolę w neoplazji.
- Obecne metody opracowywania modeli nowotworowych mogą być złożone.
- Niniejszy protokół upraszcza proces tworzenia linii komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie mysich linii komórkowych raka głowy i szyi.
- Zbadanie wpływu specyficznych zmian genomicznych.
- Przedstawienie przejrzystego protokołu dla badaczy.
Zastosowane metody
- Pobieranie tkanki języka od myszy transgenicznych B6.
- Siekane tkanki na małe fragmenty.
- Wykorzystanie mieszaniny trzech enzymów do dysocjacji enzymatycznej.
- Inkubacja próbek w temperaturze 37 °C.
Główne wyniki
- Skuteczna transformacja pierwotnych komórek języka myszy.
- Generowanie linii komórkowych ze specyficznymi zmianami genomicznymi.
- Pogłębienie wiedzy na temat mutacji genowych w neoplazji.
- Wykazana łatwość zastosowania dla badaczy.
Wnioski
- Protokół ten dostarcza niezawodnej metody tworzenia modeli nowotworowych.
- Ułatwia on badania nad rolą mutacji genetycznych w nowotworach.
- Podejście to może zostać dostosowane do różnych tkanek narządowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe raka głowy i szyi myszy, stworzone za pomocą AAV-Cas9, umożliwiają precyzyjne modelowanie mutacji onkogennych, co wspiera rzetelną walidację celów orazB minimalizację ryzyka mechanistycznego na wczesnym etapie odkrywania leków. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w ocenie potencjału nowotworowego i ułatwia ciągłość translacyjną z systemów in vitro do modeli in vivo. Powtarzalność oraz adaptowalność tej metody w różnych tkankach sprawiają, że stanowi ona strategiczny atut w rozwoju portfolio onkologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie czynników onkogennych oraz utraty supresorów nowotworowych w kontrolowanym tle genetycznym.
- Wspiera funkcjonalną walidację potencjalnych celów poprzez wprowadzanie zaprojektowanych mutacji.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie istotnych dla ludzi mutacji w komórkach mysich.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie transformacji nowotworowej i analizy szlaków sygnałowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane, genetycznie zdefiniowane linie komórkowe do późniejszego screeningu związków.
- Gwarantuje powtarzalność i standaryzację w opracowywaniu testów z wykorzystaniem tła izogenicznego.
- Umożliwia ilościową ocenę zmian fenotypowych po manipulacjach genetycznych.
- Wspiera skalowalną generację modeli istotnych dla danej choroby w wysokoprzepustowych procesach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Pozwala na zestawienie wyników in vitro z tumorigenicznością in vivo w syngeneicznych modelach mysich.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od odkryć genetycznych po badania nad skutecznością przedkliniczną i biomarkerami.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez odtwarzanie mutacji nowotworowych charakterystycznych dla ludzi w systemach mysich.
- Wspiera ocenę odpowiedzi terapeutycznej oraz mechanizmów oporności w modelach inżynieryjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesną fazę odkryć, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną, umożliwiając szybkie generowanie genetycznie zdefiniowanych modeli nowotworowych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez ukierunkowaną edycję genów.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, specyficzne pod kątem mutacji linie komórkowe, gotowe do przeprowadzenia testów i zapewniające wyniki ilościowe.
- Analityka: Zapewnia odczyty molekularne i fenotypowe do analizy porównawczej komórek zmodyfikowanych i typu dzikiego.
- Badania translacyjne: Łączy manipulacje genetyczne in vitro z tworzeniem nowotworów in vivo oraz dopasowaniem biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje platformę do generowania różnorodnych modeli nowotworowych dla różnych typów tkanek i tło genetycznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje generowanie modeli i zwiększa powtarzalność w zespołach badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie portfela.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów onkologicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pierwotnych hodowlach komórkowych, transdukcji wirusowej oraz edycji genomu.
- Wymaga dostępu do infrastruktury służącej do produkcji AAV, walidacji molekularnej oraz badań tumorigeniczności in vivo.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do różnych typów tkanek, lecz zależy od specyficznych dla danej tkanki protokołów oraz jej żywotności.
- Wydajność i żywotność mogą być zależne od parametrów obróbki tkanki oraz dysocjacji enzymatycznej.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Primary Cell Isolation and Culture
2:35
Adeno-Associated Virus (AAV) Primary Cell Transduction
3:37
Results: Representative In Vitro Transformation of Primary Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) and Tongue Epithelial Cells Using the AAV-Cas9 System
5:10
Conclusion
