Name: Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę tworzenia genetycznie modyfikowanych linii komórkowych raka głowy i szyi u myszy przy użyciu systemu AAV-Cas9. Technika ta umożliwia badanie mutacji genowych w neoplazji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Dr. Danielowi Gitlerowi za dostarczenie nam plazmidu pAd Delta 5 Helper. Ta praca została sfinansowana przez Izraelską Fundację Naukową (ISF, 700/16) (dla ME), Amerykańsko-Izraelską Dwunarodową Fundację Naukową (BSF, 2017323) (dla ME i MS), Izraelskie Stowarzyszenie Raka (ICA, 20170024) (dla ME), Izraelską Fundację Badań nad Rakiem (ICRF, 17-1693-RCDA) (dla ME) oraz Concern Foundation (#7895) (dla ME). Stypendium: stypendium Alon dla ME i stypendia BGU Kreitman dla SJ i MP.

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Ben Guriona w Negev. Doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez IACUC (IL.80-12-2015 i IL.29-05-2018(E)). Wszystkie aspekty testów na zwierzętach, pomieszczeń i warunków środowiskowych wykorzystanych w tym badaniu były zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych13.
1. Produkcja wirusów związanych z adenowirusem
<ol>
	<li>Dzień 1: Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Wysiew 4 x 106 HEK293T komórek na płytkę 14,5 cm w 15 ml DMEM. Przygotować 10 płytek do transfekcji polietyleniną (PEI) (1 μg/μL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 2: Transfekcja komórek HEK293T za pomocą PEI
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i ponownie podaj ciepłym DMEM na 1 godzinę przed transfekcją.</li>
		<li>Podgrzewane odczynniki do transfekcji i DMEM.</li>
		<li>Użyć 10 μg plazmidu będącego przedmiotem zainteresowania zawierającego AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 μg plazmidu kapsydu AAV 2/9n (z genem rep AAV2 i genem kapsydu AAV9 oraz 10 μg plazmidu pomocniczego (pAdDelta F5 helper) na płytkę (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Dostępna jest nowa generacja plazmidu pomocniczego - pAdDeltaF614,15,16, który może być również używany do produkcji AAV.</li>
		<li>Wymieszaj plazmidy w 1 ml zwykłego DMEM na płytkę. Następnie dodać 90 μl polietyleniminy (całkowity plazmid: stężenie PEI = 1:3) do mieszanki plazmidowej i krótko wirować.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę PEI-plazmidowego DNA przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Dodawać mieszaninę kroplami na HEK293T komórek i przenosić płytki do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 3: Zmiana podłoża po transfekcji
	<ol>
		<li>Całkowicie usuń pożywkę i dodaj 15 ml świeżego DMEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 5: Zbieranie wirusa
	<ol>
		<li>Przygotować kąpiel z suchym lodem i etanolem.</li>
		<li>Zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do probówek o pojemności 50 ml (2 płytki na probówkę o pojemności 50 ml).</li>
		<li>Wiruj probówki o gramaturze 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant ze wszystkich probówek. Dodać 0,5 ml buforu do lizy (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) na płytkę (tj. 5 ml na 10 płytek) tylko do pierwszej probówki. Ponownie zawiesić ogniwa i przenieść całkowitą objętość do następnej probówki i kontynuować do ostatniej probówki.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do świeżej probówki o pojemności 50 ml. Przemyć probówki tą samą objętością buforu do lizy (0,5 ml na płytkę) przy użyciu tej samej metody przenoszenia, jak opisano w kroku 1.4.4.</li>
		<li>Zawiesinę komórkową należy poddać trzem rundom ~10-minutowych cykli zamrażania/rozmrażania między kąpielą z suchym lodem/etanolem a łaźnią wodną o temperaturze 37 °C. Wiruj krótko po każdym rozmrożeniu.</li>
		<li>Jeżeli oczyszczanie przeprowadza się w tym samym dniu, należy ustawić bufor równoważący i elukcyjny (patrz tabela 1 dla receptury) na RT.</li>
		<li>Dodać 50 jednostek benzonazy na płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 h. 
		UWAGA: Benzonaza służy do trawienia resztkowych kwasów nukleinowych z komórek produkujących gospodarza oraz plazmidowego DNA obecnego w zawiesinie komórki.</li>
		<li>Wirować probówki o masie 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać supernatant do strzykawki za pomocą stalowej igły o sile 18 G i przepchnąć roztwór przez filtr 0,45 μm do probówki o pojemności 15 ml w celu uzyskania surowego lizatu.</li>
		<li>Surowy lizat przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni do czasu oczyszczenia lub kontynuowania oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie AAV
<ol>
	<li>Dzień 5 lub później
	<ol>
		<li>Umieścić bufor równoważący i elukcyjny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć kolumny chromatograficzne 10 ml buforu równoważącego.</li>
		<li>Dodać 0,5 ml na płytkę heparyny-agarozy do kolumny17, a następnie dodać bufor równoważący (4x objętość heparyny-agarozy). Wymieszaj roztwory, odwracając kolumnę i pozwól agarozie osiąść.</li>
		<li>Eluować bufor równowagi z kolumny grawitacyjnie. 
		UWAGA: Pozostaw trochę buforu równowagi, aby zapobiec wysychaniu agarozy.</li>
		<li>Załadować surowy lizat na kolumnę i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C przy stałym mieszaniu. Ustaw kolumnę w pozycji pionowej i pozwól agarozie osiąść.</li>
		<li>Eluować surowy lizat grawitacyjnie.</li>
		<li>Przemyć kolumnę buforem równoważącym (4 razy objętość heparyny-agarozy).</li>
		<li>Umieścić odśrodkowy filtr białkowy o sile 100 kDa pod kolumną i wymyć wirusa za pomocą buforu elucyjnego (3 razy większa objętość heparyny-agarozy) do filtra. 
		UWAGA: Bufor elucyjny nie powinien przekraczać 15 ml.</li>
		<li>Odwirować filtr przy 3,000 x g przez ~30 minut, aż w filtrze pozostanie mniej niż 1 ml.</li>
		<li>Napełnij filtr PBS i odwiruj przy 3,000 x g przez ~30 minut, aż w filtrze pozostanie mniej niż 1 ml. Powtórz ten krok 2 razy, aby usunąć wszystkie sole.</li>
		<li>Zagęścić roztwór wirusa w filtrze przez odwirowanie przy 3 000 x g, aby uzyskać jak najmniejszą objętość (mniej niż 200 μl).</li>
		<li>Odessać roztwór wirusa za pomocą igły i strzykawki i przepchnąć roztwór przez filtr 0,22 μm do probówki.</li>
		<li>Przygotuj porcje skoncentrowanych cząstek wirusa do przechowywania. 
		UWAGA: Podwielokrotności powinny wynosić ~20 μL do krótkotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C i ~5 μL do długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Określ miano wirusa i skuteczność transdukcji wirusa zgodnie z wcześniejszym opisem14,18,19,20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja i hodowla komórek pierwotnych
<ol>
	<li>Dzień 1
	<ol>
		<li>Poddanie eutanazji 6-tygodniowego chłopca lub samicy witaminy B6; 129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J przez uduszenie CO2 lub dowolny inny protokół zatwierdzony przez IACUC. 
		UWAGA: Te myszy knockin CRISPR / Cas9 mają zależną od rekombinazy Cre ekspresję endonukleazy cas9 i EGFP kierowaną przez promotor CAG. Sekwencja Lox-Stop-Lox (LSL) obecna w genomie tych myszy zapobiega ekspresji Cas9 i EGFP przy braku rekombinazy Cre. W połączeniu z pojedynczymi przewodnikami RNA (sgRNA) i źródłem Cre, umożliwiają edycję jednego lub wielu genów myszy in vivo lub ex vivo14.</li>
		<li>Wypreparuj język myszy poddanych eutanazji za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
		<li>Ręcznie rozdziel tkankę, mieląc tkankę języka na bardzo małe fragmenty za pomocą skalpela. Zbierz fragmenty tkanek w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 4,5 ml zwykłej pożywki RPMI (bez surowicy).</li>
		<li>Dodać potrójną mieszaninę enzymów (200 μl) (receptura patrz tabela 1) do fragmentów tkanki.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę tkankowo-enzymatyczną w temperaturze 37 °C przez 30 minut i stukać w probówkę co 10 minut, aby zwiększyć dysocjację enzymatyczną tkanki.</li>
		<li>Dodać 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej HBSS/PBS do mieszaniny tkankowo-enzymatycznej, aby zatrzymać działanie enzymu.</li>
		<li>Przefiltruj powyższą zawiesinę komórek przez sterylną siatkę nylonową o grubości 70 μm, aby oddzielić rozproszone komórki i większe fragmenty tkanek.</li>
		<li>Przefiltrowaną zawiesinę komórkową przepłukać przez odwirowanie przez 300 x g przez 5 minut w HBSS/PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zawiesić osad w pożywce hodowlanej (10% FBS w RPMI/DMEM) i hodować na szalkach hodowlanych o średnicy 60 mm, aż utworzą się odrębne kolonie komórek.
		<ol>
			<li>Agregaty komórek hodowlanych utrzymywane na górze filtra w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm zawierającym 3 ml kompletnej pożywki (10% FBS w RPMI/DMEM) do momentu utworzenia kolonii komórkowych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbadaj mikroskopowo komórki pierwotne pod kątem obecności zanieczyszczenia fibroblastami po 1 tygodniu hodowli. Traktuj pierwotne komórki powstałe z agregatów i zawiesin komórkowych 0,25 trypsyny 0,02% roztworu EDTA w temperaturze 37 °C przez 1 minutę w celu usunięcia fibroblastów. 
		UWAGA: Zwykle pierwotna hodowla z agregatów komórkowych wytwarza więcej kolonii w porównaniu z zawiesinami jednokomórkowymi. Komórki z tych kolonii zapewniają lepszą wydajność transdukcji dzięki transdukcji AAV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Transdukcja AAV komórek pierwotnych
<ol>
	<li>Dzień 10
	<ol>
		<li>Zasiewaj 2 x 105 komórek pierwotnych na studzienkę w 6 dołkach w 2 ml kompletnej pożywki (10% FBS w RPMI/DMEM).</li>
		<li>Następnego dnia należy przeprowadzić transdukcję komórek za pomocą 1012 genomu wirusa/ml (1010 jednostek transdukcyjnych/ml) i inkubować komórki w pożywce zawierającej cząsteczki wirusa przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usuń pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa i nakarm komórki transdukowane AAV kompletną pożywką. 
		UWAGA: Tylko komórki, które przeszły transdukcję, będą wyrażać GFP i zaczną się namnażać. Komórki, które nie przeszły transdukcji, ostatecznie umrą w ciągu 2 tygodni.</li>
		<li>Po 2 tygodniach ekspansji hodowli wysiewaj komórki do walidacji i eksperymentów rakotwórczych in vivo. 
		UWAGA: Genomowe DNA z komórek transdukowanych AAV i normalne komórki pierwotne od myszy Cas9 zostały wyekstrahowane w celu walidacji określonej edycji genomu przy użyciu standardowych protokołów. Sekwencjonowanie wyekstrahowanego DNA i analizę zsekwencjonowanych danych (Tabela 2) przeprowadzono przy użyciu testu sekwencjonowania nowej generacji opartego na wychwytywaniu hybrydyzacji (np. platforma MSK-IMPACT), jak opisano wcześniej21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Walidacja przemiany normalnych komórek w komórki rakotwórcze za pomocą immunofluorescencji i western blottingu
<ol>
	<li>Immunofluorescencji
	<ol>
		<li>Wysiewaj 2 x 105 komórek na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm i umieść je na noc w inkubatorze.</li>
		<li>Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS (pH = 7,4) i proces znakowania immunofluorescencyjnego.</li>
		<li>Inkubować utrwalone komórki z pierwszym pierwszorzędowym przeciwciałem w 1% BSA lub 1% surowicy w PBST w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Głównymi stosowanymi przeciwciałami są królicze przeciwciało monoklonalne anty-KRT 14, królicze przeciwciało monoklonalne anty-E-kadheryny i mysie przeciwciało mAb Cas9.</li>
		<li>Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z szkiełek nakrywkowych, przemłukując komórki 3x przez 5 minut 1x PBS.</li>
		<li>Inkubować komórki z drugorzędowymi przeciwciałami anty-króliczymi IgG Cy3 osła i/lub kozi Cy3 kozi w 5% BSA w PBST przez 1 godzinę w RT w ciemności.</li>
		<li>Usunąć roztwór przeciwciała wtórnego z szkiełek nakrywkowych i umyć komórki 3 razy, jak opisano w kroku 5.1.4.</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą kropli podłoża montażowego zawierającego DAPI (DAPI Fluoromount).</li>
		<li>Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu zobrazowania szkiełek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western blotting (zachodnia plama)
	<ol>
		<li>Nasiona 1 x 106 przekształconych komórek w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm i umieść je na noc w inkubatorze.</li>
		<li>Umyj i zeskrob przekształcone komórki do 200 μl lodowatego PBS.</li>
		<li>Odwirować probówkę zawierającą zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Odessać supernatant i poddać lizie komórki przy użyciu buforu do lizy (patrz tabela 1) zawierającego koktajle inhibitorów fosfatazy i inhibitor proteazy przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odwirować lizaty przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i w temperaturze 4 °C i zebrać oczyszczone lizaty.</li>
		<li>Użyj dostępnego w handlu zestawu testowego Bradforda, aby określić stężenie białka zgodnie z protokołem producenta. Użyj 4 razy bufor do próbek (500 mM Tris pH = 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20%H2O, 0,02% błękitu bromofenolowego), aby dostosować próbki białek do 0,5 lub 1 μg/μL. Gotować w temperaturze 96 °C przez 5 min. 
		UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C lub do czasu przeprowadzenia analizy Western blot.</li>
		<li>Oddzielić równe ilości całkowitego lizatu (30 μg) przez 10% elektroforezę w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Upewnij się, że barwnik dotrze do dna żelu. Przenieść białko do membrany nylonowej przez półsuche blot w temperaturze 25 V przez 30 minut.</li>
		<li>Wlej 5% BSA w soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS)-0,1% Tween (TBST) na membranę, aby całkowicie ją pokryć. Blokować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Inkubować mebrane z pierwszorzędowymi przeciwciałami (anty-Cre, anty-Cas9, anty-GFP, anty-β kateniną, anty p53, anty-fosfo-ERK i anty-β aktyną rozcieńczoną w 5% BSA TBST) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Po inkubacji myć membrany przez 10 minut 1x TBST, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa membranę. Wykonaj to płukanie 3x, a następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczone 1:10 000 w 5% BSA TBST) do membrany. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po inkubacji myć membrany przez 10 minut 1x TBST, upewniając się, że roztwór całkowicie pokrywa membranę. Wykonaj obrazowanie chemiluminescencyjne (patrz Tabela materiałów), aby naświetlić pasma i odpowiednio uchwycić obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja potencjału rakotwórczego transformowanych komórek u myszy immunokompetentnych 
	UWAGA: Myszy były utrzymywane i leczone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi Uniwersytetu Ben-Guriona w Negev. SKINIENIE. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) i myszy C57BL/6 wykorzystano do badań in vivo. Myszy trzymano w przefiltrowanych powietrzem komorach z przepływem laminarnym z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i karmiono je jedzeniem i wodą ad libitum.
	<ol>
		<li>Użyj 6-8 tygodniowej samicy NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) i myszy C57BL/6 do badania.</li>
		<li>Trypsynizuj komórki przekształcone w AAV-Cas9. Zatrzymaj trypsynizację za pomocą DMEM podgrzanego w temperaturze 37 °C i zbierz w probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce DMEM bez FBS. Ponownie przeprowadzić wirowanie i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1x PBS. 
		UWAGA: Nie trzymaj ogniw w 1x PBS zbyt długo. Zawsze utrzymuj zawiesinę komórkową na lodzie, aby zapobiec zbrylaniu się komórek.</li>
		<li>Użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki i rozcieńczyć komórki do pożądanego stężenia (2,5 x 107 komórek/ml) za pomocą 1x PBS. Generuj guzy poprzez podskórne wstrzyknięcie zawiesiny komórkowej przekształconej w AAV-Cas9 w prawą flankę każdego NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) mysz (2 x 106 komórek/mysz). Aby wygenerować model ortotropowy u myszy syngenicznych, wstrzyknij 0,5 × 106 komórek pierwotnych lub komórki przekształcone w AAV-Cas9 do języka myszy immunokompetentnych C57BL / 6.</li>
		<li>Poddaj zwierzęta eutanazji 2 tygodnie po wstrzyknięciu przez uduszenie CO2 i wypreparuj guzy od myszy poddanych eutanazji w celu analizy immunohistochemicznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789(2018).</li>
<li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes & Diseases. 1 (1), 75(2014).</li>
<li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li>
<li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li>
<li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+CRISPR%2FCas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors%3A+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%3A+MCR%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li>
<li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+Project+GENIE%3A+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li>
<li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+update+on+cancer%3A+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death & Disease. 5 (1), e1018(2014).</li>
<li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1361585 321-326 (1992).</li>
<li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21552473 1090-1102 (2011).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li>
<li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li>
<li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%22">Guide for the care and use of laboratory animals</a>. , National Academy Press. (1996).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand-dependent+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes+by+adeno-associated+virus+vectors+in+vivo%3A+role+of+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells.</a> Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
<li>Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Highly+Infectious+and+Pure+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Vectors+with+a+Single-Step+Gravity-Flow+Column%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column.</a> Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Reference+Standard+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1273(2010).</li>
<li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li>
<li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+%28AAV%29+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li>
<li>Cheng, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+%28MSK-IMPACT%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li>
<li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li>
<li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854(2012).</li>
<li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464(2005).</li>
<li>Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li>
<li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li>
<li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li>
<li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+AXL+expression+by+AP-1%2FJNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341(2019).</li>
<li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281(2019).</li>
<li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology-Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495(2007).</li>
<li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490(2016).</li>
</ol>

M.S. jest członkiem Rady Doradczej Instytutu Nauk Biologicznych, a Menarini Ricerche otrzymała fundusze na badania od Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics i Menarini Ricerche. M.S. jest również współzałożycielem Medendi Medical Travel, a w ciągu ostatnich 2 lat otrzymał honoraria od Menarini Ricerche i ADC Pharma. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kilka metod było wcześniej stosowanych do przekształcania komórek pierwotnych w hodowli ze zmiennym stopniem powodzenia 25,26,27,28. Większość z tych metod wykorzystuje mysie komórki fibroblastów do transformacji 14,17,18,19 lub wykorzystuje czynniki rakotwórcze, takie jak tlenek 4-nitrochinolino-1 (4-NQO)</...

HNC jest powszechnym nowotworem złośliwym na całym świecie1. Modelowanie genezy neoplazji HNC znajduje się obecnie w naukowym punkcie zwrotnym2. Chociaż wiele mutacji genetycznych zostało zidentyfikowanych w HNC2,3,4 (np. TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 i RAS), konkretne kombinacje zmian genomowych wymaganych do wywołania HNC pozostają niejasne.
Obecne wykorzystanie ludzkich linii komórkowych HNC znacząco pomogło wyjaśnić mechanizmy związane z patogenezą i leczeniem3. Jednak badanie ludzkich linii komórkowych w mysich systemach z obniżoną odpornością ma swoje ograniczenia, ponieważ systemy te nie zajmują się procesem nowotworowym in vivo, rolą określonych mutacji genowych i odpowiedziami na leczenie w mikrośrodowisku immunologicznym. W związku z tym opracowanie i ustanowienie mysich linii komórkowych ze specyficznymi zmianami genetycznymi ma zasadnicze znaczenie dla zbadania, w jaki sposób różne geny przyczyniają się do procesu transformacji i przetestowania nowych terapii opartych na cząsteczkach na myszach immunokompetentnych.
Badania funkcji genów w badaniach biomedycznych zostały znacząco dotknięte przez postęp w technologiach edycji DNA, poprzez wprowadzenie dwuniciowych pęknięć (DSB), na przykład5. Technologie te, w tym wykorzystanie nukleaz palca cynkowego, nukleaz efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji oraz zgrupowanych regulatorowych krótkich powtórzeń palindromowych (CRISPR/Cas9), pozwalają na manipulowanie dowolnym genem będącym przedmiotem zainteresowania w jego locus. Najnowsze systemy CRISPR/Cas9 składają się z przewodnika RNA (gRNA), który kieruje nukleazą Cas9 w celu wygenerowania DSB w określonym miejscu w genomie. System ten zyskał szerokie uznanie w modyfikowaniu endogennych genów w dowolnej komórce lub tkance docelowej, nawet w najbardziej tradycyjnie trudnych do leczenia organizmach5. Ma wiele zalet w porównaniu z innymi systemami ze względu na swoją prostotę, szybkość i wydajność.
W onkologii, technologia CRISPR/CAS9 zaspokoiła potrzebę skutecznego naśladowania komórek rakowych. Aby ustalić ten system w HNC, manipulowaliśmy silnym onkogenem KRAS i dwoma ważnymi genami supresorowymi nowotworów, APC i p536. Według bazy danych GENIE7, ta kombinacja jest rzadka w HNC. Mutacje RAS (HRAS, NRAS, KRAS) są obecne tylko w ~7% wszystkich populacji HNC. Guzy te są zwykle oporne na terapię8,9.
Dostarczanie Cas9 i jego gRNA odbywa się poprzez transdukcję wirusa za pomocą AAV lub lentiwirusów. Rekombinowany AAV jest często preferowaną metodą dostarczania genów do komórek docelowych ze względu na wysokie miano, łagodną odpowiedź immunologiczną, zdolność do transdukcji szerokiego zakresu komórek i ogólne bezpieczeństwo. Korzystając z systemu AAV, wygenerowano różne linie komórkowe myszy specyficzne dla tkanek, a nowe linie komórkowe są nadal opracowywane10,11,12. Jednak wydajny system edycji genomu, który może generować mysie modele linii komórkowych HNC, nie został jeszcze opracowany. W tym badaniu staraliśmy się opracować system oparty na AAV-Cas9 in vitro do przekształcania pierwotnych komórek języka myszy w stan rakotwórczy. Ten unikalny protokół transformacji CRISPR/Cas9 i ustalona linia komórek nowotworowych mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia biologii HNC indukowanej przez różnorodne zmiany genomowe.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti mysie HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-146</td><td></td></tr><tr><td>Anty królik HRP</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Mysia</td><td>technologia sygnalizacji komórkowej</td> mAb <td>14697</td><td></td></tr><tr><td>Cre</td><td>BioLegend</td><td>900901</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Kozia anty-mysia IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-062</td><td></td></tr><tr><td>Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9996</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td> <td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>Królicza monoklonalna</td><td>technologia</td> <td>sygnalizacji komórkowej anty E kadheryny3195S</td><td></td></tr><tr><td>Królik monoklonalny anty-KRT 14</td><td>Abcam</td><td>AB-ab181595</td><td></td></tr> <tr><td>i beta; aktyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>691001</td><td></td></tr> <tr><td>i beta; katenina</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9582S</td><td></td></tr><tr><td>Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK93T</td><td>ATCC</td><td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td><td></td></tr><tr><td>Podłoża hodowlane, chemikalia i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bradford Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>30015484</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Amresco</td><td>0332-TAM-50G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>ECL (Westar Supernova i Westar Nova 2.0)</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3.0100 i XLS071.0250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna - Agaroza</td><td>Sigma</td><td>H6508</td><td></td></tr><tr><td>Izolat II Zestaw genomowego DNA</td><td>Bioline</td><td>BIO-52066</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Panreac AppliChem</td><td>300283</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Lab Ltd</td><td>1903059100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries Izrael Beit-Haemek Sp. z o.o.</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paciorkowca</td><td>pióra Przemysł biologiczny Izrael Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfataz</td><td>Biotool</td><td>B15001A/B</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Tris</td><td>MERCK Millipore</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><<tr><td>silny>Enzymy</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td><td>03-050-1B</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Wyroby szklane</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Bar Naor BNCB00130RA1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Bar Naor</td><td>BN9308C</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Szczepy myszy</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td><td>Jackson labs</td><td>24857</td><td></td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td><td>Envigo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td><td>Broad Institute of MIT</td><td></td><td>Uprzejmy prezent od dr Randalla J. Platta i dr Josepha Rosenbluha, Broad Institute of MIT i Harvardu, Cambridge, MA 02142, USA</td></tr><tr><td>AAV 2/9 wektor kapsydu</td><td>Addgene</td><td>112865</td><td></td></tr><tr><td>pAD Delta F5</td><td>pomocnik Ben Guriona Uniwersytet Negev</td><td></td><td>Dostarczone przez dr Daniela Gitlera, Wydział Fizjologii i Biologii Komórki, Wydział Nauk o Zdrowiu oraz Złotowski Center for Neuroscience, Uniwersytet Ben-Guriona w Negev, Beer-Sheva 84105, Izrael.</td></tr><tr><td>Wyroby z tworzyw sztucznych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon-ULTRA filtr 100 KDa</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; m filtry sterylne, 4 mm</td><td>Millex</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &; m filtry sterylne, 13 mm</td><td>Millex</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu cas9 związanego z adenowirusem

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

Użycie pierwotnych normalnych komórek nabłonkowych umożliwia powtarzalne wywoływanie zmian genomowych wymaganych do transformacji komórkowej poprzez wprowadzanie specyficznych mutacji w onkogenach i genach supresorowych, przy użyciu technologii edycji genomu opartej na CRISPR (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats) u myszy. Technologia ta pozwala nam dokładnie naśladować zmiany genetyczne zachodzące w nowotworach u ludzi za pomocą myszy. Poprzez genetyczną transformację mysich komórek pierwotnych możemy lepiej badać rozwój, progresję, leczenie i diagnozę raka. W tym badaniu wykorzystaliśmy indukowane przez Cre-indukowane komórki nabłonka języka myszy Cas9, aby umożliwić edycję genomu za pomocą wirusa związanego z adenowirusem (AAV) in vitro. W szczególności, zmieniając KRAS, p53 i APC w normalnych komórkach nabłonka języka, wygenerowaliśmy mysią linię komórkową raka głowy i szyi (HNC) in vitro, która jest rakotwórcza u myszy syngenicznych. Przedstawiona tutaj metoda szczegółowo opisuje, w jaki sposób generować linie komórkowe HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi i wyjaśnia ich przydatność do przewidywania progresji guza u myszy syngenicznych. Przewidujemy, że ta obiecująca metoda będzie pouczająca i przydatna do badania biologii nowotworów i terapii HNC.

Wykorzystanie systemu AAV do transformacji normalnych komórek Cas9 
Rysunek 1 przedstawia szczegółową mapę wektora plazmidu transgenu AAV użytego w niniejszym badaniu. Rysunek 2 przedstawia schemat budowy i zasadę działania systemu opartego na AAV-Cas9. W celu wytworzenia cząstek wirusowych komórki HEK293T przetransfekowano wektorem transgenu AAV oraz innymi wektorami pakującymi wirusa przy użyciu metody trans...

Rozwój modeli mysich z specyficznymi genami zmutowanymi u pacjentów z rakiem głowy i szyi jest niezbędny do zrozumienia nowotworów. W tym miejscu przedstawiamy protokół transformacji in vitro pierwotnych komórek języka myszy przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem do generowania mysich linii komórkowych HNC ze specyficznymi zmianami genomowymi.

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Protokół ten umożliwił opracowanie modeli raka głowy i szyi ze specyficzną operacją genomiczną, znacząco wpływając na nasze zrozumienie roli określonych mutacji genów w procesie nowotworu. Główną zaletą tej techniki jest łatwość, z jaką linia komórkowa może zostać opracowana z praktycznie każdego narządu. Procedurę zademonstruje Manu Prasad, doktorant z mojego laboratorium.Zacznij od użycia nożyczek chirurgicznych, aby pobrać język od sześciotygodniowego samca lub samicy transgenicznej myszy B6. Użyj skalpela, aby zmielić tkankę na bardzo małe fragmenty i zbierz kawałki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 4,5 mililitra zwykłego podłoża RPMI bez surowicy. Dodaj 200 mikrolitrów potrójnej mieszanki enzymów do probówki i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, stukając w probówkę co 10 minut, aby zwiększyć dysocjację enzymatyczną tkanki.Pod koniec inkubacji zatrzymaj reakcję z 5% FBS w PBS i przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o rozmiarze 70 mikrometrów, aby oddzielić komórki od większych fragmentów tkanki. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach kompletnego podłoża. Następnie umieść komórki w trzech mililitrach kompletnego podłoża na 16-milimetrowe naczynie.Przenieś agregaty komórek zatrzymane na górze filtra do oddzielnej 16-milimetrowej płytki hodowlanej i dodaj trzy mililitry kompletnej pożywki. Trzymaj obie szalki w inkubatorze, aż utworzą się odrębne kolonie komórek. Po tygodniu hodowli zbadaj mikroskopowo pierwotne hodowle komórkowe pod kątem obecności zanieczyszczenia fibroblastami, traktując komórki 25% trypsyną w 02% EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę i usuń wszelkie fibroblasty.W 10 dniu hodowli użyj 25% trypsyny w 02% EDTA przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zebrać komórki z zawiesiny komórkowej lub kultur agregacji komórkowych i zobaczyć dwa razy od 10 do piątego komórek pierwotnych w dwóch mililitrach pożywki na studzienkę do każdego dołka 6-dołkowej płytki. Następnego dnia transdukuj komórki z jednym razy 10 do 12 genomów wirusa na mililitr i inkubuj komórki w pożywce zawierającej cząsteczki wirusa przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty hodowli dwoma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki na studzienkę i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli komórkowych.Po dwóch tygodniach ekspansji hodowli wysiewaj komórki do walidacji i eksperymentów rakotwórczych in vivo. Korzystając z wektora AAV CAS9, określono od 10 do 12 genomów wirusa na mililitr wirusa, aby skutecznie przekształcić pierwotne komórki metamfetaminy w mapy rakotwórcze przy użyciu protokołu, jak pokazano. Transdukowane komórki wyrażają Cre, CAS9 i białko zielonej fluorescencji.Wstrzyknięcie pięciu razy 10 do piątych pierwotnych map transdukowanych AAV do języka, wargi i skóry myszy NOD SCID powoduje powstawanie guza u tych zwierząt, w przeciwieństwie do wstrzykiwania pierwotnych map, które nie wywołują guzów. Transformację nowotworową pierwotnych komórek nabłonka języka można potwierdzić za pomocą immunofluorescencji i western blot. Analiza genomiczna poprzez głębokie sekwencjonowanie DNA, wyizolowanego z transformowanych komórek, potwierdza skuteczną edycję genów i przesunięcie ramki ramki genu nowotworowego 53 i APC przez system AAV CAS9.Ponadto przekształcone komórki języka skutecznie tworzą guzy u dzikich myszy czarnych C57. Analiza immunohistochemiczna komórek nowotworowych ujawnia cytoplazmatyczną ekspresję E-kadheryny i keratyny 14, markerów tkanki nabłonkowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy zawsze pamiętać, że zbyt duże mielenie lub zbyt intensywna reakcja enzymatyczna prowadzą do zmniejszenia żywotności komórek, co prowadzi do zmniejszenia wydajności transakcji wirusa.Za pomocą tej procedury linie komórkowe mogą być genetycznie modyfikowane, aby uzyskać wgląd w potencjał rakotwórczy i przerzutowy komórek rakowych z dowolnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.

in-vitro-establishment-genetically-engineered-murine-head-neck-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Source: Prasad, M. et al. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in vitro transformation of murine epithelial cells through viral delivery of Cre recombinase and mutation-inducing components. It outlines the steps for Cas9 activation, cancer-gene modification, and the establishment of a tumorigenic murine cell line.

Establishing a Murine Tumor Cell Line In Vitro Using a Virus-Cas9 System

W tym filmie opisujemy izolację komórek nabłonkowych z mysiego języka. Komórki te mogą być dalej hodowane, aby dać początek koloniom komórkowym.

Izolacja i hodowla komórek nabłonka języka myszy: procedura izolacji i hodowli komórek nabłonka języka z modelu mysiego

Ten protokół opisuje nowo ustaloną metodę dostarczania wirusa do mysiej prostaty. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, nadekspresję genów lub dostarczanie rekombinazy Cre, technika ta umożliwia ortotopową zmianę ekspresji genów i wdraża nowy mysi model raka prostaty.

Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania aktywności sygnalizacyjnej TGF-β/Smad3 na żywo komórek za pomocą systemu reporterskiego adenowirusa. System ten śledzi aktywność transkrypcyjną w czasie rzeczywistym i może być stosowany zarówno do pojedynczych komórek in vitro, jak i do żywychmodeli zwierzęcych.

Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Poznaj metodę tworzenia genetycznie modyfikowanych linii komórkowych raka głowy i szyi u myszy przy użyciu systemu AAV-Cas9. Technika ta umożliwia badanie mutacji genowych w neoplazji.

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal

Ustanowienie in vitro genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej mysiego raka głowy i szyi przy użyciu systemu Cas9 związanego z adenowirusem

Przeglądaj więcej filmów