Wykrywanie ustalenia wspólnego dopływu krwi u myszy parabiotycznych przez wstrzyknięcie glukozy do żyły ogonowej

Nasz protokół zapewnia ulepszoną metodę weryfikacji chimeryzmu krążenia oraz metodę udanego tworzenia modelu parabiozy dla badań biomedycznych. W porównaniu z istniejącymi metodami wykrywania chimeryzmu krwi w parabiozie, które często są śmiertelne lub uciążliwe, nasz protokół jest bezpieczny i prosty, umożliwiając szybką i wiarygodną weryfikację. Chociaż metoda ta jest specyficzna dla wykrywania chimeryzmu krwi w modelach parabiozy, może być stosowana do wszelkich badań biomedycznych obejmujących procedury parabiotyczne.

Najtrudniejszym krokiem jest wstrzyknięcie glukozy. Dlatego przed wykonaniem procedury eksperymentalnej należy przećwiczyć wstrzykiwanie żyły ogonowej lub użyć żylnego wizualnego stabilizatora ogona myszy. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, umieść dwie 20 do 25-gramowe, znieczulone C57 czarne 6 myszy w pozycji leżącej na plecach i użyj golarki elektrycznej, aby dokładnie ogolić lewą stronę jednej myszy i prawą stronę drugiej myszy od około jednego centymetra powyżej łokcia do jednego centymetra poniżej kolana.

Usuń wszelkie pozostałe włosy kremem do depilacji przed wykonaniem podłużnych nacięć skóry w oczyszczonej skórze każdego zwierzęcia, zaczynając od 0,5 centymetra powyżej łokcia do 0,5 centymetra poniżej stawu kolanowego, i delikatnie oderwij skórę od powięzi podskórnej. Połącz łokć i kolano parabiontu szwem 3-0, a ogoloną skórę zszyj ciągłym szwem 5-0. Następnie wstrzyknij podskórnie 0,5 mililitra 0,9% chlorku sodu, aby zapobiec odwodnieniu, i wstrzyknij domięśniowo 10 miligramów tramadolu na 25 gramów myszy w celu złagodzenia bólu, każdej myszy dziennie przez trzy dni.

Aby zweryfikować pomyślną konstrukcję krążenia między chimeryzmem między parabiontami przez fluktuację glukozy, w 10 dniu po operacji parabiozy zabezpiecz myszy dawcy w żylnym wizualnym stabilizatorze ogona myszy i użyj wacika nasączonego 70 do 75% etanolem, aby pocierać żyły ogonowe w boku jednego ogona parabiontu. Włóż jednomililitrową igłę strzykawkową do żyły ogonowej w odległości od dwóch do czterech centymetrów od końcówki ogona i tak równolegle do żyły, jak to możliwe, i wstrzyknij dawcy od jednego do dwóch gramów na kilogram glukozy w 100 mikrolitrach roztworu soli fizjologicznej przez okres 10 sekund. Następnie użyj nożyczek, aby usunąć palce u nóg zwierząt dawcy i biorcy, aby umożliwić pobranie kropli krwi w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu.

Następnie dodaj kroplę każdej próbki krwi do środka paska testowego glukometru w celu wykrycia poziomu glukozy. Aby zweryfikować pomyślną konstrukcję krążenia przez absorbancję niebieskiego barwnika Evansa, wstrzyknij 200 mikrolitrów 0,5% niebieskiego barwnika Evansa dootrzewnowo do myszy dawcy i zbierz krew z obu parabiontów przez nakłucie serca po dwóch godzinach. Oddzielić surowicę przez odwirowanie i przenieść surowicę do stożkowej probówki w celu rozcieńczenia w stosunku jeden do 50 w 0,9% chlorku sodu.

Następnie zmierz absorbancję rozcieńczonych próbek surowicy przy 620 nanometrach na spektrofotometrze. W tej reprezentatywnej analizie poziomu glukozy we krwi u sześciu myszy dawców, poziom glukozy we krwi gwałtownie wzrósł do 26,5 mikromola na litr średnio po jednej minucie po wstrzyknięciu 100 mikrolitrów glukozy przez żyłę ogonową. Poziom glukozy we krwi stopniowo spadał do 13,3 mikrolitrów na litr po 60 minutach.

U myszy biorców poziom glukozy we krwi powoli wzrastał po wstrzyknięciu, osiągając pierwszy szczytowy poziom po 15 minutach. Stężenie niebieskiego barwnika Evansa w surowicy parabiontów również wskazywało na udaną konstrukcję chimeryzmu krążenia, a podskórne połączenia naczyniowe między parabiontami można było wyraźnie zaobserwować. U parabiontów, u których nie stwierdzono chimeryzmu krwi 15 dni po operacji parabiozy, myszy biorcy nie wykazywały podwyższonego poziomu glukozy we krwi w ciągu 60 minut po wstrzyknięciu glukozy zwierzęciu dawcy.

Stężenie niebieskiego Evansa we krwi u dwóch biorców również nie było podwyższone, co pokazuje, że metoda fluktuacji glukozy jest tak samo czuła jak metoda niebieskiej Evansa. Co więcej, poziom insuliny we krwi uległ znacznemu obniżeniu godzinę po wstrzyknięciu glukozy z powodu szybkiego wzrostu poziomu glukozy i powrócił do normalnego poziomu w ciągu trzech godzin, co wskazuje, że wpływ wstrzykniętej glukozy na metabolizm insuliny jest możliwy do przywrócenia. Należy upewnić się, że igła jest wprowadzona bezpośrednio do żyły ogonowej.

Po potwierdzeniu tą metodą chimeryzmu krwi parabiontów, można badać zmiany fizjopatologiczne u żywych zwierząt parabiotycznych.