Name: Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metody ekspresji i oczyszczania heterodimerów SNX-BAR z drożdży oraz ich wiązanie z liposomami. Techniki te umożliwiają badanie właściwości biofizycznych białek remodelujących błony komórkowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem nagrody GM060221 oraz częściowo przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health pod numerem nagrody T32GM007223. R.C. był częściowo wspierany przez UNC-Charlotte Faculty Research Grants Program.

1. Budowa szczepu drożdży
<ol>
	<li>Zacznij od TVY614 (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 jako szczepu macierzystego. Szczep ten ma niedobór proteaz wakuolarnych, które przyczyniają się do większości degradacji białek po lizie komórek, a tym samym pozwala na czystsze i bardziej wydajne oczyszczanie.</li>
	<li>Zaprojektuj primers12 i zintegruj znacznik tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) na C-końcu Atg20 (SNX-BAR ORF 1) za pomocą rekombinacji homologicznej. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby potwierdzić integracje (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
	<li>Wykonaj western blot lizatu komórkowego względem znacznika TAP, aby potwierdzić poprawną integrację13. 
	nuta: Zalecamy pobranie 3 komórek OD (1 OD ≈ 1 x 107 komórek) do weryfikacji SDS-PAGE i western blot. Należy pamiętać, że integracja znacznika TAP powinna nastąpić przed zastąpieniem endogenicznych promotorów promotorem GAL1, aby umożliwić łatwiejszą weryfikację znacznika TAP za pomocą western blot.</li>
	<li>Zastąp endogenne promotory Snx4 (SNX-BAR ORF1) i Atg20 (SNX-BAR ORF 2) nieoznakowanym promotorem GAL1, stosując sekwencyjną homologiczną rekombinację i etapy transformacji każdej indywidualnej klasy ORF14.</li>
	<li>Użyj starterów flankujących poza miejscami integracji, aby PCR potwierdzić udane integracje (Rysunek 2). Spowoduje to zerowy fenotyp docelowych SNX-BAR przy braku galaktozy w pożywce wzrostowej.</li>
</ol>
2. Indukcja drożdży i oczyszczanie dimera SNX-BAR
UWAGA: Komórki drożdży mogą być rozmnażane na standardowych płytkach agarowych YPD (ekstrakt drożdżowy, pepton i 2% glukozy), ponieważ modyfikacje są zintegrowane chromosomalnie.
<ol>
	<li>Zaszczepić duży wacik komórek w 50 ml standardowego podłoża YP (ekstrakt drożdżowy i pepton) z 2% rafinozą i 0,1% glukozą jako źródłem węgla w kolbie o objętości co najmniej 4 razy większej niż objętość kultury i hodować przez noc w wytrząsarce o temperaturze 30 °C, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie. Należy się spodziewać, że wzrost w tym medium będzie wolniejszy w porównaniu ze standardowym YPD.</li>
	<li>Następnego ranka użyj 50 ml kultury wstępnej, aby zaszczepić w 1 l standardowej pożywki YP z 2% rafinozą i 0,1% glukozy i rosnąć przez 4-5 godzin w wytrząsarce o temperaturze 30 °C. 
	nuta: Objętość kultury wstępnej użytej do zaszczepienia 1 litra kultury może być dostosowana w zależności od OD600 w kulturze wstępnej. OD600 w 1 l kultury po inokulacji powinien wynosić około 0,2, aby umożliwić co najmniej dwa podwojenia podczas 4-5 godzinnego wzrostu.
	<ol>
		<li>Do wzrostu należy użyć kolby Fernbacha z przegrodą, aby umożliwić prawidłowe napowietrzenie, wystarczy kolba objętościowa o pojemności 2,8 l. Mniejsze napowietrzenie może skutkować wolniejszym wzrostem i mniejszymi granulkami komórkowymi podczas zbioru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź OD600, aby upewnić się, że kultura jest w fazie logarytmu (0,5-1) po 4-5 godzinach wzrostu. W zależności od wzrostu odmiany, dostosuj czas wzrostu, aby umożliwić co najmniej dwa podwojenia. Dodać do 2% galaktozy i hodować przez noc w 30 °C shaker. 
	nuta: OD600 po nocnym wzroście może się różnić, ale kultura powinna być nasycona. Należy pamiętać, że komórki nie muszą być usuwane z 0,1% glukozy przed dodaniem 2% galaktozy dla tego protokołu wzrostu. Zalecamy pobranie 3 OD komórek nieindukowanych i indukowanych na tym etapie dla SDS-PAGE i western blot w celu weryfikacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A, B, Pas 1-2).</li>
	<li>Zbierać komórki przez odwirowanie przy 4500 x g przez 15 minut. Można tu zastosować wahliwy wirnik kubełkowy, który mieści kulturę o objętości 1 l.</li>
	<li>Przenieść osad drożdży do stożkowej probówki o pojemności 50 ml; w razie potrzeby można przeprowadzić drugi etap wirowania. Granulka komórkowa ma na ogół około 10-15 ml objętości, mierzoną za pomocą oznaczeń podziałki i może być natychmiast zużyta lub przechowywana w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>Zawiesić osad w 15 ml buforze oczyszczającym (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM Ditiothreitol (DTT), koktajl inhibitorów proteazy), aby uzyskać końcową objętość około 30 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed użyciem schłodzić homogenizator w temperaturze 4 °C i zrównoważyć go z buforem oczyszczającym. Lizuj komórki za pomocą mechanicznego zaburzacza komórek lub homogenizatora. Załaduj próbkę do homogenizatora i poddaj lizie w temperaturze 20 000-25 000 psi przez 2-3 rundy; Należy pamiętać, że gdy komórki ulegają lizie, wymagane jest większe ciśnienie wejściowe, aby utrzymać 20 000-25 000 psi. Zebrać lizat komórkowy w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie. 
	nuta: Jeżeli konieczne jest poddanie lizie dodatkowych próbek, homogenizator powinien zostać dokładnie oczyszczony i wyrównany przed załadowaniem następnej próbki. Trzymaj wszystkie lizaty komórkowe na lodzie.</li>
	<li>Natychmiast usunąć lizat komórkowy w temperaturze 35 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki. Należy pamiętać, że lipidy z lizy komórek będą unosić się na wierzchu podczas wirowania i nie wpłyną na oczyszczanie. 
	nuta: Zalecamy zaoszczędzenie 0,5-1% lizatu i granulatu dla próbek SDS-PAGE. Zazwyczaj nie obserwuje się większych różnic i można wykonać dodatkowy western blot w celu potwierdzenia rozpuszczalności białka TAP (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 4, odpowiednio pasy 1 i 2).</li>
	<li>Zrównoważyć 300 μl kulek sefarozy IgG z buforem oczyszczającym. Dodać do oczyszczonego lizatu komórkowego i inkubować przez 2 godziny, obracając w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać kulki w kolumnie chromatograficznej o pojemności 10 ml i pozwolić na przepływ niezwiązanego lizatu.</li>
	<li>Przepłucz kulki za pomocą 10 ml buforu do płukania (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT), dodając po 1 ml na raz i pozwalając mu całkowicie przepłynąć. 
	nuta: Zalecamy zachowanie 2% związanych kulek IgG dla próbki SDS-PAGE. Zazwyczaj obserwujemy cztery główne pasma; dwa białka SNX-BAR oraz ciężkie i lekkie łańcuchy IgG (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, Tor 3). Zalecamy zachowanie równoważnych ilości "eluatu" i "kulek IgG po TEV" w celu porównania skuteczności rozszczepienia TEV.</li>
	<li>Zbierz koraliki i przenieś je do probówki mikrowirówkowej. Dodać do 500 μl całkowitej objętości ze świeżym buforem do przemywania i 2 μl proteazy TEV o stężeniu 10 mg/ml i inkubować przez noc, obracając w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego ranka całkowicie usunąć supernatant za pomocą igły 27 G i ocenić czystość białka za pomocą 10% poliakrylamidu SDS-PAGE (<silna klasa="xfig">Rysunek 4, tor 4). 
	nuta: Zazwyczaj uzyskujemy 500 μl 0,5-1 mg / ml 95% czystego heterodimeru (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4, tor 4). Można również przeprowadzić dodatkowe oczyszczanie przy użyciu żywicy kalmodulinowej, jednak zazwyczaj obserwujemy znaczne zmniejszenie plonów i zalecamy zaprzestanie tego procesu, jeśli czystość wynosi >90%. TEV nie zakłóca testów wiązania liposomów, chociaż TEV można dodatkowo usunąć za pomocą kulek agarozowych Ni-NTA15.</li>
	<li>Aby zagęścić, przenieść próbkę do filtra odśrodkowego o pojemności 0,5 ml z odcięciem 10 KDa i odwirować zgodnie z instrukcjami producenta do 50 μl lub mniej. Określ ilościowo skoncentrowane białka za pomocą testu białek Bradforda. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie liposomów
<ol>
	<li>Kup dostępne w handlu lipidy: fosfatydyloserynę (PS), PI3P, ergosterol i fosfatydylocholinę (PC). W razie potrzeby ponownie zawiesić w zalecanym rozpuszczalniku, aby uzyskać podstawowe lipidy. 
	nuta: Lipidy są ponownie zawieszane w mieszaninie metanolu i chloroformu zgodnie z zaleceniami producenta. Przed użyciem upewnij się, że zapasy lipidów są czyste i ogrzane do temperatury pokojowej. Zawieszone lipidy mogą być przechowywane w argonie i zamykane za pomocą filmu woskowego (lub jego odpowiednika) w temperaturze -20 °C przez 6-12 miesięcy lub do momentu zaobserwowania utraty aktywności.</li>
	<li>Obliczyć objętość wymaganą dla każdego zasobu lipidowego w celu wytworzenia mieszaniny o pożądanym składzie lipidowym (patrz Tabela 1). Załóżmy, że w mieszaninie lipidów znajduje się łącznie 1 mol lipidów.</li>
	<li>Wykonaj ten krok w dygestorium chemicznym. Szklane strzykawki należy oczyścić, pobierając pełną objętość chloroformu i wyrzucając ją do pojemnika na odpady. Powtórz jeszcze dwa razy. Podczas przenoszenia chloroformu należy używać wyłącznie szklanych strzykawek lub pipet. Podczas pobierania chloroformu należy powoli pociągnąć za korek, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków gazu do strzykawki.</li>
	<li>Za pomocą szklanych strzykawek przenieś lipidy podstawowe w przeliczeniu do czystej szklanej probówki hodowlanej, aby uzyskać końcową mieszaninę lipidów składającą się z 1% PI3P, 20% ergosterolu, 30% PS, PC (Tabela 1). W zależności od rozpuszczalników, w których każdy lipid jest ponownie zawieszony, mieszanina może stać się mętna po dodaniu każdego lipidu. 
	nuta: Aby zmienić stężenia PS (0-30%), odpowiednio dostosuj głośność i skompensuj ją za pomocą zmiennego PC (Tabela 1).</li>
	<li>Ostrożnie wysuszyć mieszaninę lipidów za pomocą azotu skierowanego na mieszaninę lipidów ruchami okrężnymi, aby równomiernie wysuszyć lipidy. Użyj niskiego przepływu gazu, aby utrzymać lipidy na dnie szklanej rurki podczas procesu suszenia. Owiń szklaną probówkę hodowlaną folią, pozostawiając otwór odkryty, a następnie odwadniaj w próżni przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 400 μl buforu wiążącego (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) w celu całkowitego odwodnienia lipidów, aby uzyskać końcowe stężenie liposomu 2,5 mM. 
	nuta: Końcowe stężenie liposomów można regulować, dodając mniej lub więcej buforu wiążącego. Na przykład można dodać 200 μl buforu wiążącego, aby w razie potrzeby uzyskać stężenie liposomu 5 mM (patrz poniżej).
	<ol>
		<li>Zawiesić lipidy, wstrząsając ze średnią prędkością wiru w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Bufor powinien wydawać się mętny podczas ponownego zawieszania lipidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś zawieszone liposomy do probówki mikrowirówkowej. Od tego momentu można używać plastikowych końcówek do pipet, ponieważ lipidy nie są już ponownie zawieszane w chloroformie. Należy pamiętać, że roztwór liposomu powinien wyglądać na mętny.</li>
	<li>Zamroź i rozmroź liposomy od siedmiu do ośmiu razy, zanurzając probówkę mikrowirówki najpierw w ciekłym azocie, a następnie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszanina liposomów powinna wydawać się całkowicie zamrożona i stała na oko przed rozmrożeniem.</li>
	<li>Wykonaj czynności z udziałem chloroformu w dygestoriach chemicznych. Oczyścić dwie szklane strzykawki o pojemności 1 ml, pobierając i wyrzucając pełne objętości chloroformu, trzy razy każda, w celu usunięcia wszelkich pozostałości lipidów. Zrównoważyć każdą szklaną strzykawkę z ultraczystą wodą, pobierając dwie objętości strzykawki, a następnie zrównoważyć z buforem wiążącym, pobierając dwie objętości strzykawki.</li>
	<li>Zmontuj mini-ekstruder zgodnie z zaleceniami producenta. Zrównoważyć jedną membranę o długości fali 200 nm i dwa kawałki podpór filtra (patrz tabela materiałów), zanurzając każdą z nich w buforze wiążącym.</li>
	<li>Umieść membranę między wspornikami filtra i umieść w mini-ekstruderze. Aby zmniejszyć martwą objętość w zmontowanym mini-ekstruderze i upewnić się, że zespół jest szczelny, należy przepuścić objętość buforu wiążącego porównywalną z objętością mieszaniny liposomów przez mini-ekstruder za pomocą szklanych strzykawek o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Użyj jednej ze szklanych strzykawek o pojemności 1 ml i wyciągnij mieszaninę liposomów. Odwrócić probówkę mikrowirówki, aby zebrać ostatnią mieszaninę liposomów w nasadce probówki w celu wciągnięcia do szklanej strzykawki.</li>
	<li>Wytłaczaj liposomy, przechodząc przez membranę 200 nm 19-21 razy. Zbierz wytłaczane liposomy w nowej probówce do mikrowirówki. 
	nuta: Wytłaczane liposomy powinny wydawać się mniej mętne niż liposomy przed wytłaczaniem. Liposomy należy stosować tego samego dnia i przechowywać na lodzie. Ostatnia ekstruzja powinna umieścić liposomy w strzykawce naprzeciwko tej, w której się zaczęła.</li>
</ol>
4. Wiązanie i kanaliki liposomowe SNX-BAR
<ol>
	<li>Wstępnie oczyszczone białko w ilości 100 000 x g w ultrawirówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C przed przeprowadzeniem eksperymentów z wiązaniem liposomów i sedymentacją. Usunąć supernatant i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki; Nie naruszaj pelletu, jeśli taki jest.</li>
	<li>Aby przeprowadzić testy wiązania liposomów i kanalików, inkubuj 4 μM oczyszczone liposomy Snx4-Atg20 i 2,5 mM w całkowitej objętości reakcji 20 μL, zmieniając objętość dodanych liposomów. 
	nuta: W tym samym eksperymencie należy użyć tej samej objętości liposomów.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 30 min. 
	nuta: Sugerujemy maksymalizację ilości 2,5 mM liposomów dodawanych do każdej reakcji przy użyciu nie mniej niż 10 μl liposomów, aby umożliwić wizualizację podczas sedymentacji. Jeśli w reakcji 20 μl liposomów 2,5 mM zostanie użyte, końcowe stężenie liposomów wyniesie 1,25 mM. Jeżeli oczyszczone białka są rozcieńczone i wymagana jest większa objętość dla białka 4 μM, lipidy mogą być ponownie zawieszone w 200 μl podczas etapu hydratacji w celu podwojenia stężenia liposomów (patrz krok 3.6); Będzie to jednak wymagało znajomości stężenia białka przed wytworzeniem liposomów.</li>
	<li>Wizualizacja i kwantyfikacja kanalików liposomowych.
	<ol>
		<li>Natychmiast przeprowadź reakcje wiązania liposomów do analizy pod mikroskopem elektronowym. Umieść próbki na siatce miedzianej pokrytej węglem i zabarwiej ujemnie za pomocą 1% octanu uranylu (Rysunek 5B)16.</li>
		<li>Analizuj próbki pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym (200 kV).</li>
		<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć i określić ilościowo średnicę kanalików. Aby dokładnie określić ilościowo średnicę kanalika pojedynczego kanalika, wykonaj trzy pomiary średnicy wzdłuż długości kanalika i uśrednij (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B). 
		nuta: Do określenia istotności statystycznej zastosowano dwukierunkową analizę wariancji (<silna klasa="xfig">Rysunek 5E). Octan uranylu jest zarówno radioaktywny, jak i toksyczny. Do wykonania tego kroku wymagany jest odpowiedni certyfikat bezpieczeństwa w laboratorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie liposomów i sedymentacja.
	<ol>
		<li>Przenieść reakcję (20 μl, z kroku 4.3) do probówki wirówkowej z poliwęglanu i za pomocą kompatybilnego wirnika wirować z prędkością 100 000 x g w ultrawirówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Należy pamiętać, że pellet powinien pozostać nienaruszony.</li>
		<li>Zawiesić osad w SDS-PAGE 40 μL buforu próbki i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Dodać 20 μl buforu próbki do supernatantu. Załaduj równoważne ilości osadu i supernatantu w 10% poliakrylamidowym żelu SDS-PAGE i wykonaj barwienie Coomassie, aby uwidocznić SNX-BAR związane z liposomami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5A).</li>
		<li>Aby określić ilościowo ilość kompleksu SNX-BAR we frakcji osadu, należy określić ilościowo intensywność pasma za pomocą densytometrii i określić ilościowo proporcję białek SNX-BAR we frakcji osadu. 
		nuta: Dwukierunkowa analiza wariancji została wykorzystana do określenia istotności statystycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Teasdale, R. D., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+PX+%28phox-homology%29+domain+and+SNX+%28sorting+nexin%29+protein+families%3A+structures%2C+functions+and+roles+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease.</a> The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Retromer+Complex+and+Sorting+Nexins+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79(2018).</li>
<li>Burd, C., Cullen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer%3A+a+master+conductor+of+endosome+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Retromer: a master conductor of endosome sorting.</a> Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).</li>
<li>Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+endosome-derived+transport+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of endosome-derived transport carriers.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+receptor+trafficking%3A+Retromer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic+%28Copenhagen%2C+Denmark%29%22%5BJournal%5D)">Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+by+yeast+Snx4+family+SNX-BAR+proteins+promotes+autophagy+and+vacuole+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2018).</li>
<li>van Weering, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+SNX-BAR-mediated+assembly+of+distinct+endosomal+sorting+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules.</a> The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).</li>
<li>Chi, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+of+SNX-BAR-coated+endosomal+retrograde+transport+carriers+is+promoted+by+the+dynamin-related+protein+Vps1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).</li>
<li>Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retromer-driven+membrane+tubulation+separates+endosomal+recycling+from+Rab7%2FYpt7-dependent+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).</li>
<li>Purushothaman, L. K., Ungermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+induces+retromer-mediated+membrane+remodeling+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).</li>
<li>Wurmser, A. E., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide+signaling+and+turnover%3A+PtdIns%283%29P%2C+a+regulator+of+membrane+traffic%2C+is+transported+to+the+vacuole+and+degraded+by+a+process+that+requires+lumenal+vacuolar+hydrolase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities.</a> The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+structure+of+lipoproteins+revealed+by+an+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy.</a> Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).</li>
<li>Yong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+SNX1%2FSNX6+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex.</a> Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany przepływ pracy do oczyszczania dimerów SNX-BAR w drożdżach oraz dwa testy do oceny ich właściwości biofizycznych na syntetycznych liposomach. Główną zaletą w porównaniu z typową ekspresją białek rekombinowanych w Escherichia coli lub innych systemach jest zdolność do równomiernej ekspresji białek SNX-BAR w natywnym gospodarzu, co pozwala uniknąć problemów z toksycznością i nierozpuszczalnością, które występują przy oczyszczaniu SNX-BAR w innych systemach. Warto również zauważy...

Organelle związane z błoną, takie jak błona plazmatyczna, retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, lizosom (wakuola drożdży) i endosom tworzą system endomembranowy komórki eukariotycznej. Większość organelli ma zdolność komunikowania się i wymiany materiału z innymi organellami za pośrednictwem nośników transportu pęcherzyków. Sposób, w jaki komórka koordynuje pakowanie i tworzenie nośników transportu pęcherzyków w systemie endomembranowym, nie jest dobrze poznany. Wiadomo jednak, że białka i lipidy, które stanowią większość systemu endobłonowego, pochodzą z internalizacji pęcherzyków endocytarnych z błony plazmatycznej (PM). Endosom jest głównym organellą akceptorową dla tych pęcherzyków i składa się z wielu połączonych ze sobą zestawów organelli rurkowych. Główną funkcją endosomu jest ułatwianie pozyskiwania składników odżywczych, regulowanie obrotu białek i lipidów, ochrona przed infekcją patogenami oraz służenie jako główne źródło uzupełniania lipidów dla błony plazmatycznej. Ponieważ endosom otrzymuje większość białek ładunkowych i lipidów z błony plazmatycznej, działa jak komora sortująca, izolując ładunki do rurowych endosomalnych nośników transportowych (ETC). Wszelkie białka, które nie zostały sekwestrowane w ETC, pozostawia się do degradacji przez system endo-lizosomalny. Rozregulowanie sortowania ładunków na ETC może prowadzić do utraty pobierania składników odżywczych, obrotu białkami lub homeostazy lipidów, co skutkuje licznymi zaburzeniami metabolicznymi, rozwojowymi i neurologicznymi1,2. Jednak pomimo centralnej roli ETC w endosomie, nie jest znany podstawowy mechanizm, w jaki sposób endosom może selektywnie koordynować pakowanie wielu heterogenicznych ładunków do nośników rurkowych.
Rodzina sortowania nexin (SNX) to ewolucyjnie zachowana klasa białek, które okazały się kluczowe dla wielu reakcji transportu pęcherzyków w komórce3,4,5. Neksyny sortujące są rekrutowane do błony endosomu i pomagają w wychwytywaniu ładunku poprzez ich charakterystyczną domenę homologii phox (PX), która wiąże fosfatydyloinozytolo-3-monofosforan (PtdIns(3)P), lipid wzbogacony w błonę endosomu. Ssaki kodują trzydzieści trzy białka SNX, które można dalej podzielić na wiele podrodzin, w zależności od obecności innych domen1. Przede wszystkim podrodzina SNX-BAR jest największą podrodziną składającą się z dwunastu u ludzi, podczas gdy u pączkujących drożdży, Saccharomyces cerevisiae, podrodzina jest zredukowana do zaledwie siedmiu SNX-BAR. Białka SNX-BAR mają zarówno domenę PX, jak i domenę Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR), która pobudza rezerwuary lipidowe do wiązania błon o dodatniej krzywiźnie. W związku z tym rodzina SNX-BAR ma naturalne powinowactwo do endosomu i może pośredniczyć w tworzeniu ETC poprzez zdolność do przebudowy błony. In vitro właściwości remodelujące SNX-BAR można indukować przez dodanie oczyszczonych SNX-BAR do syntetycznych liposomów, a następnie tworzenie wąskich, powlekanych kanalików można uwidocznić za pomocą mikroskopii elektronowej. Korzystając z tych metod, naukowcy ustalili, że zarówno stężenie oligomeryzacji, jak i siła zwężenia wydają się różnić w rodzinie SNX-BAR, co sugeruje, że mogą one pomóc zarówno w tworzeniu, jak i rozszczepianiu ETC.
SNX-BARs można dalej klasyfikować według ich wyjątkowych właściwości dimeryzacji. Testy wiązania in vitro i badania strukturalne wykazały, że białka SNX-BAR mogą tworzyć tylko specyficzne homodimery lub heterodimery. W związku z tym, w zasadzie, każdy potencjalny dimer-oligomer SNX-BAR może zapewnić powłokę kanalikową dla specyficznego dla ładunku szlaku transportu i podobnie, ograniczona oligomeryzacja innych protomerów SNX-BAR może również definiować odrębne szlaki eksportowe. Jednak ze względu na dużą liczbę SNX-BAR i różnorodność w rodzinie SNX, hipoteza jednego sortowania ładunku typu nexin-one jest bardzo mało prawdopodobna. Zamiast tego bardziej prawdopodobny jest skoordynowany wysiłek z wykorzystaniem wielu czynników, takich jak SNX-BAR, ładunek, specyficzność lipidowa i inne zależności. Podobnie, ostatnie badania drożdży z rodziny SNX4 ujawniły dowody na dodatkową specyficzność lipidową, poza PtdIns(3)P, w celu wzmocnienia nośników transportu endosomów6. W tym badaniu homodimer SNX-BAR Mvp1-Mvp1 został oczyszczony z bakterii, a natywne heterodimery Snx4-Atg20 i Vps5-Vps17 poddano ekspresji i oczyszczeniu z wysoką wydajnością z drożdży, podczas gdy stwierdzono, że tylko Snx4-Atg20 preferencyjnie wiąże fosfatydyloserynę (PS) i tworzy wąskie struktury przypominające rurki w badaniach wiązania liposomów6. Podczas gdy inni w tej dziedzinie ujawnili ważne właściwości SNX-BAR przy użyciu rekombinowanych homodimerów SNX-BAR z bakterii, toksyczność związana z ekspresją heterodimerów SNX-BAR w podobnych systemach utrudniła ich natywną charakterystykę7,8,9,10. Dlatego bez niezawodnego systemu do uzyskania czystych natywnych heterodimerów o ekspresji rekombinowanej, naukowcy muszą zrezygnować z tych kierunków badań. Na rysunku 1 przedstawiamy czteroczęściowy przepływ pracy, aby 1) skonstruować szczep drożdży z nadekspresją heterodimerów SNX-BAR do tandemowego oczyszczania powinowactwa, 2) wyrazić i oczyścić natywne heterodimery SNX-BAR, 3) przygotować jednowarstwowe syntetyczne liposomy i 4) skonfigurować test kanalików liposomowych lub sedymentacji, zapewniając naukowcom niezbędne narzędzie do zbadania rosnącego katalogu neksyn sortujących występujących w przyrodzie.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m PC</td><td>Membrany Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Poly-Prep Kolumna chromatograficzna (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>27 G igła</td><td>BD Biosciences</td><td>301629</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra z odcięciem 10K</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizator</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima MAX-XP Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPS</td><td>Avanti</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol (Sigma)</td><td>Zestaw wytłaczarek Sigma</td><td>47130-U</td><td></td></tr><tr><td>z Blok 0,2 &mu; L/1 mL</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>FEI Transmisyjny mikroskop elektronowy Tecnai F20 (200 kV)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane probówki hodowlane</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td></td></tr><tr><td>Kulki sefarozy IgG (GE Healthcare)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Szklane strzykawki mikrolterowe</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Excella E25</td><td>Eppendorf</td><td>M1353-0000</td><td>lub równoważne wytrząsanie 30 & deg; C</td></tr><tr><td>Ni-NTA Magnetyczne kulki agarozowe</td><td>Pierce</td><td>78605</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-076</td><td></td></tr><tr><td>PI3P</td><td>Echelon</td><td>P-3016</td><td>lub odpowiednik Echelon</td></tr><tr><td>Zespół butelki z poliwęglanu</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100 o stałym kącie Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>Typ 45 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odsysacz próżniowy, dolny i pokrywa z zaworem gniazdowym</td><td>VWR</td><td>75871-436</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa Alcatel (Pascal 2005 C1)</td><td>A& J Odkurzacz</td><td>PN07050</td><td></td></tr><tr><td>Vortex z uchwytem na piankę</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>ZESTAW VWR MIKRORURKA</td><td>VWR</td><td>12620-880</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów snx-bar drożdży

Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers

Białka SNX-BAR to ewolucyjnie zachowana klasa białek przebudowujących błonę, które odgrywają kluczową rolę w sortowaniu i transporcie białek i lipidów podczas endocytozy, sortowania w systemie endosomalnym i autofagii. Kluczowe znaczenie dla funkcji białka SNX-BAR ma zdolność do tworzenia homodimerów lub heterodimerów, które wiążą błony przy użyciu wysoce konserwatywnych domen phox-homology (PX) i BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs). Ponadto oligomeryzacja dimerów SNX-BAR na błonach może wywoływać tworzenie kanalików błonowych i pęcherzyków, a aktywność ta odzwierciedla ich funkcje jako białek płaszcza dla nośników transportowych pochodzących z endosomów. Naukowcy od dawna wykorzystują badania wiązania in vitro z wykorzystaniem rekombinowanych białek SNX-BAR na syntetycznych liposomach lub gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV), aby ujawnić dokładny skład lipidów potrzebnych do napędzania przebudowy błony, ujawniając w ten sposób ich mechanizm działania. Jednak ze względu na wyzwania techniczne związane z systemami podwójnej ekspresji, toksycznością ekspresji białka SNX-BAR u bakterii oraz słabą rozpuszczalnością poszczególnych białek SNX-BAR, większość dotychczasowych badań dotyczyła homodimerów SNX-BAR, w tym niefizjologicznych dimerów, które tworzą się podczas ekspresji u bakterii. Niedawno zoptymalizowaliśmy protokół, aby przezwyciężyć główne niedociągnięcia typowego bakteryjnego systemu ekspresji. Korzystając z tego przepływu pracy, pokazujemy, jak skutecznie wyrażać i oczyszczać duże ilości heterodimerów SNX-BAR oraz jak je rekonstytuować na syntetycznych liposomach do testów wiązania i kanalików.

Niniejszy protokół opisuje metodę powtarzalnej i stabilnej produkcji endogennych kompleksów SNX-BAR drożdży, które mogą być wykorzystane w dalszych analizach przebudowy błon (Rycina 1). Konstrukcja szczepu drożdży wykorzystanego do oczyszczania opiera się na efektywności rekombinacji homologicznej u drożdży pączkujących, co pozwala na modyfikacje w locusach genomowych docelowych białek SNX-BAR (Rycina 2). Takie podejście ma dwie ...

Tutaj prezentujemy przebieg procesu ekspresji, oczyszczania i wiązania liposomów heterodimerów SNX-BAR w drożdżach.

Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

SNX-BAR proteins are an evolutionarily conserved class of membrane remodeling proteins that play key roles in sorting and trafficking of protein and ...

SNX-BAR to białka przebudowujące błonę, które odgrywają kluczową rolę w chorobach człowieka. Korzystając z naszych metod, możemy określić ich dokładne właściwości biofizyczne, aby ułatwić wiązanie lipidów i przebudowę błon. Oczyszczanie białek SNB-BAR z komórek drożdży pozwala na pozyskanie natywnych dimerów homo i hetero SNX-BAR przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności i nierozpuszczalności często spotykanych w przypadku nienatywnych systemów ekspresji.Nasze metody mogą być wykorzystane do zrozumienia swoistości lipidowej wszystkich drożdży SNX-BAR lub do produkcji rekombinowanych białek SNX-BAR z dowolnego innego organizmu. Prawidłowy montaż ekstrudera jest niezbędny, aby zapobiec utracie liposomów podczas procesu wytłaczania. W przypadku początkujących uczniów lub tych, którzy są nowicjuszami w tej dziedzinie, wizualne obserwowanie najważniejszych kroków znacznie zwiększy Twoje szanse na sukces.Zacznij od zaszczepienia dużego wymazu komórek drożdży do kolby o objętości co najmniej czterokrotnie większej niż objętość kultury zawierającej 50 mililitrów standardowej pożywki YP uzupełnionej 2% rafinozą i 0,1% glukozy jako źródłem węgla i hoduj kulturę przez noc w wytrząsarce o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego ranka zaszczepij 50-mililitrową kulturę wstępną w jednym litrze standardowej pożywki YP z 2% rafinozą i 0,1% glukozy w kolbie Fernbacha o objętości 2,8 litra na czterogodzinną hodowlę w inkubatorze z wytrząsaniem. Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,2, dodaj galaktozę do końcowego stężenia 2% do komórek w celu hodowli przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem.Następnego ranka zbierz komórki przez odwirowanie i przenieś granulki drożdży do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach buforu oczyszczającego, aby uzyskać końcową objętość około 30 mililitrów i załadować zawiesinę komórek do homogenizatora schłodzonego do czterech stopni Celsjusza. Lizuj próbki w temperaturze od 20 do 25 000 funtów na cal kwadratowy przez dwie do trzech rund i przenieś lizat do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.Natychmiast usunąć lizat komórkowy przez odwirowanie i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki. Następnie zrównoważyć 300 mikrolitrów kulek IgG Sepharose z trzema re-zawiesinami w buforze oczyszczającym przed dodaniem kulek do oczyszczonego lizatu komórkowego na dwugodzinną inkubację z obracaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać kulki do 10-mililitrowej kolumny chromatograficznej i pozwolić niezwiązanemu lizatowi przepłynąć.Umyj koraliki 10 razy jednym mililitrem buforu do prania na pranie, pozwalając, aby każde pranie całkowicie przepłynęło przed dodaniem następnej objętości. Po ostatnim umyciu za pomocą pipety i świeżego bufora przenieś kulki do probówki mikrowirówkowej. Doprowadzić całkowitą objętość kulek do 500 mikrolitrów za pomocą świeżego buforu do płukania i usunąć kulki z lizatu za pomocą dwóch mikrolitrów proteazy TEV po 10 miligramów na mililitr TEV do inkubacji przez noc z rotacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego ranka użyj igły o rozmiarze 27, aby całkowicie usunąć supernatant i ocenić czystość białka za pomocą 10% strony SDS poliakrylamidu. Następnie oznacz ilościowo skoncentrowane białka za pomocą testu białkowego Bradforda zgodnie ze standardowymi protokołami i przechowuj białko przez okres do jednego tygodnia w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować liposomy, użyj szklanych strzykawek, aby przenieść podstawowe lipidy do czystej szklanej probówki hodowlanej, aby uzyskać końcową mieszaninę lipidów 1% fosfatydyloinozytolu-3-fosforanu, 20% ergosterolu, 30% fosfatydyloseryny, fosfatydylocholiny, jak opisano w tabeli.W zależności od rozpuszczalników, w których każdy lipid jest ponownie zawieszony, mieszanina może stać się mętna po dodaniu każdego lipidu. Ostrożnie wysuszyć mieszaniny lipidów, kierując gazowy azot o niskim przepływie na mieszaniny ruchem okrężnym, aby równomiernie potraktować lipidy na dnie szklanej probówki. Następnie owiń szklaną probówkę hodowlaną folią, pozostawiając otwór odkryty i dalej odwadniaj lipidy w próżni przez godzinę.Pod koniec inkubacji dodaj 400 mikrolitrów buforu wiążącego do każdej fiolki, aby całkowicie nawodnić lipidy przy końcowym stężeniu liposomów 2,5 milimola, a następnie ponownie zawiesić lipidy ze średnią prędkością w wirze w temperaturze pokojowej na 30 minut. Bufor powinien stać się mętny w miarę ponownego zawieszania lipidów. Przenieś zawieszone liposomy do probówki mikrowirówkowej i zamroź probówki w ciekłym azocie, a następnie rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza siedem do ośmiu razy.W dygestoriastycznym dygestoriociągu chemicznym wyczyść dwie jednomililitrowe szklane strzykawki pełną objętością chloroformu trzy razy na strzykawkę, aby usunąć wszelkie pozostałości lipidów i zrównoważyć każdą strzykawkę dwiema objętościami ultraczystej wody i dwiema objętościami buforu wiążącego. Zmontuj mini-ekstruder zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie zanurz dwa kawałki wspornika filtra w jednej membranie o długości 200 nanometrów w buforze wiążącym.Ważne jest, aby zmontować mini-ekstruder tak, aby był całkowicie szczelny. Dobrym sposobem sprawdzenia, czy nie ma wycieków, jest przepuszczenie bufora przez urządzenie. Umieść membranę między wspornikami filtra i umieść membranę w mini-ekstruderze.Za pomocą jednej ze zrównoważonych strzykawek o pojemności jednego mililitra przepuść objętość buforu wiążącego podobną do objętości mieszaniny liposomów przez mini-wytłaczarkę i użyj drugiej strzykawki, aby upuścić mieszaninę liposomów, odwracając probówkę mikrowirówki, aby zebrać ostatnie liposomy do nasadki probówki w celu ich zebrania. Następnie wytłaczaj liposomy przez membranę 200 nanometrów od 19 do 21 razy i zbierz wytłaczane liposomy do nowej probówki do mikrowirówki. Przed wykonaniem testów wiązania liposomów i kanalików SNX-BAR należy wstępnie oczyścić oczyszczone białko przez ultrawirowanie i przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej bez naruszania osadu.Następnie inkubuj cztery mikromole oczyszczonego SNX4-ATG20 i 2,5 milimola liposomów w całkowitej objętości reakcji 20 mikrolitrów przez 30-minutową inkubację w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Aby uwidocznić i określić ilościowo rurkę liposomową, pod koniec inkubacji natychmiast umieść próbki na pokrytej węglem siatce miedzianej i zabarwiej ujemnym z 1% octanem uranylu. Następnie przeanalizuj próbki pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym o napięciu 200 kilowoltów.W celu wiązania liposomów i sedymentacji przenieś 20 mikrolitrów reakcji do probówki wirówkowej z poliwęglanu i odwiruj próbkę za pomocą kompatybilnego routera w ultrawirówce. Pod koniec wirowania ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i ponownie zawiesić osad w 40 mikrolitrach buforu próbki stronicowej SDS. Przenieść zawiesinę osadów do nowej probówki do mikrowirówki i dodać 20 mikrolitrów buforu próbki do supernatantu.Następnie załaduj równoważne objętości próbki osadu i supernatantu na 10% poliakryloamidowy żel stronicowy SDS i wykonaj barwienie Coomassie, aby uwidocznić SNX-BAR związane z liposomami. Aby sprawdzić, czy ekspresja SNX-BAR jest prawidłowa, można użyć western blot przeciwko znacznikowi oczyszczania tandemowego powinowactwa, ponieważ poziomy białek SNX-BAR mogą nie być wykryte za pomocą barwienia Coomassie. Po oczyszczeniu heterodimera SNX-BAR prążki dwóch SNX-BAR powinny pojawić się w stosunku stechiometrycznym jeden do jednego, a prążki zanieczyszczające powinny być niewielkie lub nie powinno być ich wcale.W tej reprezentatywnej analizie heterodimery SNX-BAR uległy ekspresji, oczyszczeniu i związaniu z syntetycznymi liposomami, jak pokazano. Należy zauważyć, że MVP1 tworzył homodimery i ulegał ekspresji w bakteriach zgodnie z oczekiwaniami. Wiązanie SNX-BAR z różnymi składami liposomów można określić ilościowo za pomocą densytometrii w celu oceny wpływu fosfatydyloseryny, na przykład na wiązanie liposomów.Obrazowanie mikroskopem elektronowym umożliwia pomiar kanalików liposomowych SNX4-ATG20, przy czym większość kanalików ma zwykle średnice od 14 do 26 nanometrów. Należy pamiętać, że oczyszczone SNX-BAR można rozpuścić za pomocą kompleksów wychwytywania ładunku na liposomach, aby zrozumieć, w jaki sposób pełne zespoły mogą wpływać na przebudowę membrany. Porównując wiązanie różnych kombinacji oczyszczonych dimerów SNX-BAR z syntetycznymi liposomami złożonymi z różnych lipidów, stwierdzono, że białka SNX-BAR mają różne preferencje wiązania lipidów.Zawsze pracuj pod kapturem podczas pracy z chloroformem i pamiętaj o noszeniu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas pracy z ostrymi narzędziami lub materiałem szklanym.

expression-purification-liposome-binding-budding-yeast-snx-bar

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda MYTH umożliwia czułą detekcję przejściowych i trwałych oddziaływań między białkami ekspresowanymi w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Została ona z powodzeniem zastosowana do badania egzogennych oraz drożdżowych białek błonowych w celu wysokoprzepustowej identyfikacji ich partnerów interakcji.

System błonowego dwuhybrydowego badania drożdży (MYTH) oparty na rozszczepionej ubikwitynie: potężne narzędzie do identyfikacji oddziaływań białko-białko

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów.  Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Ten protokół hybrydyzacji fluorescencji in situ jest zoptymalizowany do ilościowego określenia liczby cząsteczek RNA w pączkujących drożdżach podczas wzrostu wegetatywnego i mejozy.

Analiza fluorescencji pojedynczej cząsteczki hybrydyzacji in situ (smFISH) w pączkującym wzroście wegetatywnym drożdży i mejozie

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Test ACT1-CUP1, test wzrostu miedzi, zapewnia szybki odczyt splicingu prekursorowego informacyjnego RNA (pre-mRNA) i wpływu zmutowanych czynników splicingu na funkcję spliceosomalną. To badanie zawiera protokół i podkreśla możliwe dostosowanie, aby odpowiedzieć na interesujące nas pytanie dotyczące splingu.

Testy ACT1-CUP1 określają specyficzną dla substratu wrażliwość mutantów spliceosomalnych w pączkujących drożdżach

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Poznaj metody ekspresji i oczyszczania heterodimerów SNX-BAR z drożdży oraz ich wiązanie z liposomami. Techniki te umożliwiają badanie właściwości biofizycznych białek remodelujących błony komórkowe.

Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

Przeglądaj więcej filmów