Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Zbiorowa migracja komórek jest często kierowana przez gradient cząsteczek sygnałowych. W tym filmie pokazujemy, jak określić ilościowo siły komórkowe podczas migracji zbiorowej kierowanej gradientem biochemicznym. Integrujemy więc chip mikroprzepływowy z mikroskopią trakcyjną, następnie używamy chipa mikroprzepływowego do generowania gradientu biochemicznego i używamy mikroskopii trakcyjnej do pomiaru siły komórkowej.

Dr Hwanseok Jang, doktor nauk humanistycznych w moim laboratorium, zademonstruje tę procedurę. Przygotować roztwór PDMS, mieszając elastomer bazowy i utwardzacz w stosunku dziesięć do jednego. Umieść 15 mililitrów elastomeru bazowego w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i dodaj 1,5 mililitra utwardzacza.

Przygotuj dwie z tych probówek. Mieszaj mieszaninę PDMS przez pięć minut, a następnie odwiruj w temperaturze 196 g przez jedną minutę w celu usunięcia pęcherzyków. Aby wytworzyć szablon PDMS, wlej około jednego mililitra mieszaniny PDMS na płytkę, unikając obszarów z wzorem SU-8, tak aby PDMS dotykał boku filarów SU-8, ale nie górnej części wzoru SU-8.

Umieść wafel na płaskiej powierzchni na ponad 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie utwardź PDMS w suchym piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez ponad dwie godziny. Ostrożnie oderwij PDMS od formy SU-8, przytnij cienką membranę PDMS za pomocą 14-milimetrowego pustego stempla. Usuń kurz z powierzchni elementów PDMS za pomocą taśmy klejącej przed autoklawowaniem szablonów PDMS.

Aby wytworzyć mikrokanał PDMS, wlej około 30 mililitrów mieszaniny PDMS na formę SU-8. Odgazuj przez 30 minut w komorze próżniowej, a następnie utwardź PDMS w suchym piecu w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez ponad dwie godziny. Ostrożnie oderwij PDMS od formy SU-8 i przytnij PDMS do rozmiaru 24 milimetry na 24 milimetry.

W każdym bloku PDMS utwórz jeden wylot i trzy wloty za pomocą jednomilimetrowego stempla biopsyjnego. Produkcja i silanizowanie szkiełek szklanych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przykryj krawędź dolnej szyby 100 mikrolitrami roztworu silanu wiążącego.

Po pozostawieniu szklanki w temperaturze pokojowej na godzinę należy ją trzykrotnie spłukać wodą dejonizowaną. Następnie pozostaw szkło do wyschnięcia w temperaturze otoczenia lub przedmuchując sprężonym powietrzem. Przygotować roztwór żelu poliakryloamidowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie przenieś na 10 mikrolitrów zmieszanego roztworu żelu na prostokątną mikrostudzienkę i umieść na niej okrągłe szkiełko nakrywkowe. Zamocuj zestaw niestandardowego szkła, roztworu żelu i szkiełka nakrywkowego na pokrywie płytki sześciodołkowej za pomocą taśmy klejącej i odwróć ją. Następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 96 razy g, aby doprowadzić cząstki fluorescencyjne do górnej warstwy żelu poliakrylamidowego.

Wyjmij zespół z wirówki i umieść go na płaskiej powierzchni z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół. Po 30 minutach odwróć zestaw i umieść go na 35-milimetrowej szalce Petriego. Napełnij naczynie dwoma mililitrami wody dejonizowanej.

Za pomocą kleszczy delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe, przesuwając je na bok. Aby zakodować kolagen na żelu poliakrylamidowym, należy rozpuścić jeden miligram na mililitr sulfo-SANPAH w ciepłym 50-milimolowym buforze HEPES. Upuść 200 mikrolitrów roztworu na powierzchnię żelu i aktywuj światłem UV przez 10 minut.

Po aktywacji UV spłucz żel dwa razy 0,1-molowym buforem HEPES, a następnie raz PBS. Zakoduj żel poliakrylamidowy roztworem kolagenu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przemyj żel trzykrotnie PBS.

Zanurz autoklawowany szablon PDMS w roztworze F-127. Trzymaj go w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj szablon PDMS trzykrotnie PBS i usuń płyn zarówno z szablonu PDMS, jak i żelu poliakrylamidowego.

Następnie umieść szablon PDMS na żelu poliakrylamidowym i dodaj PBS do szablonu. Usuń pęcherzyki z otworów szablonu PDMS, delikatnie pipetując. Po usunięciu pęcherzyków usuń PBS z powierzchni szablonu PDMS.

Teraz dodaj 200 mikrolitrów roztworu komórkowego na szablon PDMS i umieść żel w inkubatorze na jedną godzinę, aby komórki przyczepiły się do żelu poliakrylamidowego. Po inkubacji delikatnie zmyć roztwór komórkowy pożywką do hodowli komórkowych i dodać więcej pożywki do hodowli komórkowych. Usuń szablon PDMS, sprawdź tworzenie się wysp komórkowych pod mikroskopem.

Następnie potraktuj powierzchnię mikrokanału PDMS plazmą tlenową przez 30 sekund. Po usunięciu płynu z dolnej szyby wypełnionej żelem poliakrylamidowym, umieść mikrokanał PDMS na dolnej szybie i umieść zespół na niestandardowym uchwycie szklanym. Wypełnij mikrokanalik pożywką do hodowli komórkowych.

Aby przygotować rurkę wlotową zintegrowanego systemu mikroprzepływowego, podłącz przyciętą igłę i 30-centymetrową linię mini objętości z trójdrogowym kranem. Przygotuj trzy z tych układów. W przypadku rurki wylotowej podłącz przyciętą igłę i 75-centymetrową linię mini objętości z trójdrożnym kranem.

Napełnij przewody rurkowe medium, które było wstępnie podgrzewane przez godzinę. Przygotować zbiorniki, wyjmując tłoki ze strzykawek i podłączając przewody doprowadzające. Podłącz złącza igłowe każdej linii rurowej do trzech wlotów i jednego wylotu urządzenia mikroprzepływowego.

Napełnij każdy zbiornik trzema mililitrami świeżej pożywki lub kondycjonowanej pożywki. W teście gradientowym napełnij lewy zbiornik wlotowy 20 nanogramami na mililitr czynnika wzrostu hepatocytów lub HGF w pożywce do hodowli komórkowych. W celu wizualizacji gradientu stężeń dodaj 200 mikrogramów na mililitr barwnika fluorescencyjnego do lewego zbiornika wlotowego.

Podłącz przewód wylotowy do pompy strzykawkowej. Umieść zintegrowany system mikroprzepływowy na stoliku konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. Wykonuj zdjęcia co 10 minut przez maksymalnie 24 godziny za pomocą automatycznego mikroskopu umieszczonego w inkubatorze.

W każdym punkcie czasowym wykonaj zestaw obrazów za pomocą soczewki obiektywowej 4X w trzech różnych kanałach, w tym obraz fazowy do wizualizacji migracji komórek, zielony obraz fluorescencyjny do wizualizacji kulek fluorescencyjnych osadzonych w żelu oraz czerwony obraz fluorescencyjny do wizualizacji gradientu stężenia substancji chemicznej. Po wykonaniu zdjęć poklatkowych wlej 0,25% roztwór trypsyny-EDTA do mikrokanalików, aby odłączyć komórki od żelu poliakrylamidowego. Po całkowitym usunięciu komórek z żelu należy wykonać zielony obraz fluorescencyjny, który zostanie wykorzystany jako obraz referencyjny do mikroskopii trakcyjnej.

Przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zmierzyć siłę skurczu i stres międzykomórkowy, połączono mikroskopię trakcyjną i jednowarstwową mikroskopię naprężeń z kanałem mikroprzepływowym. Mapy zostały naniesione w koordynacji radiowej z trakcją na zewnątrz przy użyciu ciepłego koloru i trakcją wewnętrzną przy użyciu zimnego koloru.

W czasie zero wszystkie wyspy wykazywały podobny rozkład trakcji z silną przyczepnością wewnętrzną na krawędzi i wahaniami w obrębie wyspy. Po 10 godzinach stosowania gradientu HGF, podczas gdy stopień rozszerzania się wyspy był różny w każdej kolumnie, rozkłady trakcji były w dużej mierze podobne do czasu zero. Średnia przyczepność nie zmieniła się przez 10 godzin.

Jednak przy obliczaniu naprężenia jednowarstwowego każda kolumna wykazywała inne trendy. Tam, gdzie stężenie HGF było niskie, średnie napięcie w obrębie wysp utrzymywało się na poziomie około 200 paskali przez okres 10 godzin. Tam, gdzie stężenie HGF było wysokie, średnie napięcie w obrębie wysp stopniowo spadało z 230 paskali do 100 paskali w ciągu 10 godzin, jak wykazano wcześniej.

Tam, gdzie stężenie HGF było wysokie w lewej połowie i niskie w prawej połowie wyspy, średnie napięcie utrzymywało się na poziomie około 150 paskal. Napełnianie kanału mikroprzepływowego musi być delikatne. Ważne jest, aby usunąć pęcherzyki uwięzione w kanale, jednocześnie nie zakłócając wysp mikrokomórek rodzicielskich.

Korzystając z tego zintegrowanego systemu, można zbadać, w jaki sposób zbiorowe komórki reagują mechanicznie na różne gradienty chemiczne, takie jak atraktanty chemioterapii lub czynniki wzrostu. Ta platforma pomoże nam dalej badać mechanikę zbiorowej migracji komórek w gradientach chemicznych, co jest kluczem do zrozumienia regeneracji, przerzutów i rozwoju raka.