Name: Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii trakcyjnej zintegrowanej z mikrofluidyką do badania sił komórkowych podczas zbiorowej migracji chemotaktycznej. Technika ta pozwala ilościowo określić mechanikę ruchu komórek w odpowiedzi na gradienty biochemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) ufundowany przez rząd koreański (MSIP) (Nie. NRF-2017R1E1A1A01075103), stypendium Uniwersytetu Koreańskiego oraz program BK 21 Plus. Był również wspierany przez National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

UWAGA: Litografia form SU-8 do szablonów (grubość = 250 μm) i części mikrokanałowych (grubość = 150 μm), wytrawianie szkła (głębokość = 100 μm) oraz produkcja odlewów zostały zlecone na zewnątrz poprzez wysyłanie projektów za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo do producentów.
1. Produkcja szablonu z polidimetylosiloksanu (PDMS) i mikrokanału
<ol>
	<li>Zaprojektuj mikrowzór szablonu i mikrokanału.</li>
	<li>Produkcja lub outsourcing form SU-8 (grubość ~250 μm dla szablonów i ~150 μm dla mikrokanałów) na płytkach krzemowych (średnica 4").</li>
	<li>Przygotować mieszaninę PDMS, mieszając elastomer bazowy i utwardzacz w stosunku 10:1.
	<ol>
		<li>Umieść 15 ml elastomeru bazowego w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 1,5 ml utwardzacza. Przygotuj dwa z nich.</li>
		<li>Mieszać mieszaninę PDMS przez 5 minut. Odwirowywać mieszaninę PDMS przy sile 196 x g przez 1 minutę w celu usunięcia pęcherzyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wytworzyć szablon PDMS, wlej ~ 1 ml mieszaniny PDMS na wafel, unikając obszarów wzorzystych SU-8, tak aby PDMS dotykał boku filarów SU-8, ale nie górnej części wzoru SU-8.
	<ol>
		<li>Umieść wafel na płaskiej powierzchni na ponad 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Utwardzać PDMS w suchym piecu w temperaturze 80 °C przez ponad 2 godziny.</li>
		<li>Ostrożnie oderwij PDMS od formy SU-8 i przytnij cienką membranę PDMS za pomocą pustego dziurkacza 14 mm. Usuń kurz z powierzchni kawałków PDMS za pomocą taśmy klejącej i autoklaw szablony PDMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wytworzyć mikrokanał PDMS, wlej ~30 ml mieszaniny PDMS na formę SU-8.
	<ol>
		<li>Odgazowywać przez 30 minut w komorze próżniowej i utwardzać PDMS w suchym piecu w temperaturze 80 °C przez ponad 2 godziny.</li>
		<li>Ostrożnie oderwij PDMS od formy SU-8 i przytnij PDMS do rozmiaru 24 mm x 24 mm. W każdym bloku PDMS utwórz jeden wylot i trzy wloty za pomocą stempla do biopsji o średnicy 1 mm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie dolnej szyby z żelem poliakrylamidowym (PA)
<ol>
	<li>Produkcja lub outsourcing prostokątnych szkieł szkiełkowych (24 mm x 24 mm x 1 mm) z prostokątną mikrostudzienką (6 mm x 12 mm, głębokość 100 μm29) poprzez cięcie i wytrawianie szkieł.</li>
	<li>Silanizuj powierzchnię dolnej szklanki30.
	<ol>
		<li>Przygotować wiążący roztwór silanu, mieszając 200 ml wody dejonizowanej (DIW), 80 μl kwasu octowego i 50 μl metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu (TMSPMA) przez 1 godz. 
		UWAGA: TMSPMA jest cieczą palną. Postępuj zgodnie z zaleceniami zawartymi w kartach charakterystyki. Używać tylko w dygestoriach chemicznych.</li>
		<li>Usuń kurz z powierzchni szkła za pomocą taśmy klejącej i autoklaw szklanki.</li>
		<li>Przykryć wytrawioną powierzchnię dolnej szyby 100 μl roztworu silanu wiążącego i pozostawić szklankę w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
		<li>Opłucz szklankę za pomocą DIW 3x i pozostaw szklankę do wyschnięcia w temperaturze otoczenia lub przez nadmuch powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór żelu dla PA gel31.
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór 0,5 % (m/v) nadsiarczanu amonu (APS), rozpuszczając 5 mg APS w 1 ml DIW.</li>
		<li>Przygotować roztwór żelu PA składający się ze 138 μl 40% roztworu akryloamidu, 101 μl 2% roztworu bis-akrylamidu, 5 μl roztworu cząstek fluorescencyjnych (0,2 μm) i 655 μl DIW. 
		UWAGA: Roztwory akrylamidu i bisakryloamidu są toksyczne. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne. Chronić roztwór żelu PA zawierający cząstki fluorescencyjne przed światłem. 
		UWAGA: Przed pipetowaniem należy przemieszać roztwór kulek fluorescencyjnych, aby uzyskać jednolitą liczbę kulek fluorescencyjnych na partię.</li>
		<li>Po dodaniu 100 μl roztworu APS i 1 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), przenieść 10 μl zmieszanego roztworu żelu do prostokątnej mikrostudzienki i umieścić na wierzchu okrągłe szkiełko nakrywkowe (18 mm). 
		UWAGA: Aby napełnić dolną szklankę żelem PA bez pęcherzyków, umieść wystarczającą ilość roztworu żelu w rowku dolnej szklanki, ostrożnie nasuń szkiełko nakrywkowe na roztwór żelu i usuń nadmiar roztworu żelu. 
		UWAGA: Żel powoli utwardza się przez około 40 min. Poniższą procedurę wirowania żeli należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe.</li>
		<li>Odwróć zestaw niestandardowego szkła, roztworu żelu i szkiełka nakrywkowego, a następnie odwiruj przez 10 minut przy 96 x g, aby doprowadzić cząstki fluorescencyjne do górnej warstwy żelu PA.</li>
		<li>Wyjmij zestaw z wirówki i umieść go na płaskiej powierzchni szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół. 
		UWAGA: Począwszy od kroku 2.3.6, należy obchodzić się z próbkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Po 30 minutach odwróć zestaw i umieść go na szalce Petriego o średnicy 35 mm, napełnij 2 ml DIW i (za pomocą kleszczyków) delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe, przesuwając je na bok. 
		UWAGA: Utwardzony żel PA można przechowywać w DIW przez 1 miesiąc. Jednak po pokryciu kolagenu żelem PA należy go użyć w eksperymencie w ciągu 1 dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj kolagen na żelu PA.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 mg/ml 6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino) heksanianu sulfosukcynimidylu (sulfo-SANPAH) w ciepłym 50 mM buforze HEPES. Upuść 200 μl roztworu na powierzchnię żelu i aktywuj światłem UV (długość fali 365 nm) przez 10 min. 
		UWAGA: Chronić sulfo-SANPAH przed światłem.</li>
		<li>Przepłukać żel 0,1 M kwasem [4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym; HEPES] bufor 2x oraz z PBS 1x.</li>
		<li>Żel PA pokryć roztworem kolagenu (100 μg/ml w PBS, kolagen z ogona szczura typu I) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia przemyć PBS 3x.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikrowzory wysp komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować roztwór F-127 (tabela materiałów) [2% (w/v) w PBS] i zanurzyć autoklawowany szablon PDMS w roztworze F-127. Przechowywać w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotować roztwór komórkowy (2 x 106 komórek/ml) w pożywce do hodowli komórkowej składającej się z: zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku przeciwgrzybiczego (AA).</li>
	<li>Umyj szablon PDMS za pomocą PBS 3x i usuń płyn zarówno z szablonu PDMS, jak i żelu PA. Umieść szablon PDMS na żelu PA i dodaj PBS do szablonu.</li>
	<li>Usuń pęcherzyki z otworów szablonu PDMS, delikatnie pipetując. Po usunięciu pęcherzyków usuń PBS z powierzchni szablonu PDMS.</li>
	<li>Po umieszczeniu 200 μl roztworu komórkowego na szablonie PDMS, należy przechowywać żel PA w inkubatorze przez 1 godzinę, aby komórki przyczepiły się do żelu PA.</li>
	<li>Delikatnie zmyj roztwór komórkowy pożywką do hodowli komórkowych, usuń szablon PDMS i dodaj więcej pożywki do hodowli komórkowych. Sprawdź tworzenie się wysp komórkowych pod mikroskopem.</li>
</ol>
4. Montaż żelu PA z mikrokanalikiem PDMS
<ol>
	<li>Usuń kurz z mikrokanału PDMS za pomocą taśmy klejącej, a następnie autoklawu.</li>
	<li>Powierzchnię mikrokanału PDMS należy traktować plazmą tlenową (80 W, 50 kHz) przez 30 s.</li>
	<li>Po usunięciu płynu z dolnej szyby wypełnionej żelem PA, umieść mikrokanał PDMS na dolnej szybie i umieść zespół na niestandardowym uchwycie szklanym.</li>
	<li>Wypełnij mikrokanalik pożywką do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś wszystkie pęcherzyki uwięzione w kanałach, delikatnie przepłukując ciepłe media pipetą. Ponadto podczas usuwania pęcherzyków należy uważać, aby nie odczepić wysp komórkowych z mikrowzorem.</li>
</ol>
5. Zintegrowany system mikroprzepływowy
<ol>
	<li>Podłącz rurki.
	<ol>
		<li>Przygotuj łączniki, przycinając końcówkę igieł (18 G) i wyginając ją pod kątem 90°.</li>
		<li>Przygotuj przewody rurowe dla trzech wlotów i jednego wylotu.
		<ol>
			<li>W przypadku rurki dopływowej połącz przyciętą igłę i przewód o długości 30 cm z trójdrożnym kranem. Przygotuj trzy z nich.</li>
			<li>W przypadku rurki wylotowej połącz przyciętą igłę i przewód o długości 75 cm z trójdrożnym kranem. Przygotuj jeden z nich.</li>
			<li>Napełnij przewody rurowe medium, które zostało wstępnie podgrzane przez 1 godz. 
			UWAGA: Upewnij się, że usunąłeś wszystkie pęcherzyki uwięzione w przewodach rurowych, delikatnie spłukując ciepłe media strzykawką.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować zbiorniki, wyjmując tłoki ze strzykawek i podłączając przewody doprowadzające.</li>
		<li>Podłącz złącza igłowe każdej linii rurowej do trzech wlotów i jednego wylotu urządzenia mikroprzepływowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij zbiorniki 3 ml świeżej pożywki lub kondycjonowanej pożywki każdy.
	<ol>
		<li>W teście gradientu napełnij lewy zbiornik wlotowy 20 ng/ml HGF w pożywce do hodowli komórkowych.</li>
		<li>W celu wizualizacji gradientu stężeń dodać barwnik fluorescencyjny o stężeniu 200 μg/ml (rodamina B-dextran, 70 kDa) do lewego zbiornika wlotowego.</li>
		<li>Podłączyć przewód wylotowy do pompy strzykawkowej. 
		UWAGA: Tryb pracy pompy strzykawkowej to "wycofanie". Natężenie przepływu zmienia się w zależności od pojemności strzykawki i prędkości roboczej pompy strzykawkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić zintegrowany system mikroprzepływowy na stoliku konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. 
	UWAGA: Aby wytworzyć łagodny gradient HGF w kanale mikroprzepływowym, natężenie przepływu powinno wynosić zaledwie 0,1 μl/min. Jest to na tyle czułe, że wymaga stabilizacji przez 2 godziny i należy zachować ostrożność, aby uniknąć zakłóceń fizycznych podczas eksperymentu.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Wykonuj zdjęcia co 10 minut przez maksymalnie 24 godziny za pomocą automatycznego mikroskopu umieszczonego w inkubatorze. W każdym punkcie czasowym wykonaj zestaw obrazów za pomocą soczewki obiektywowej 4x w trzech różnych kanałach, w tym obraz fazowy, aby wyświetlić migrację komórek, zielony obraz fluorescencyjny, aby uwidocznić kulki fluorescencyjne osadzone w żelu PA oraz czerwony obraz fluorescencyjny, aby wyświetlić gradient stężenia substancji chemicznej.  </li>
	<li>Po wykonaniu zdjęć poklatkowych wlej 0,25% roztwór trypsyny-EDTA do mikrokanałów, aby odłączyć komórki od żelu PA. Po całkowitym usunięciu komórek z żelu należy wykonać zielony obraz fluorescencyjny, który zostanie wykorzystany jako obraz referencyjny do mikroskopii trakcyjnej.</li>
</ol>
7. Analiza danych
UWAGA: Niestandardowy kod do analizy danych został opracowany przy użyciu MATLABa, a szczegóły zostały opisane gdzie indziej32,33,34,35,36.
<ol>
	<li>W przypadku analizy obrazu fazowego należy obliczyć przemieszczenia w dwóch kolejnych obrazach fazowych za pomocą prędkości obrazu cząstki36.</li>
	<li>W przypadku mikroskopii trakcyjnej z transformacją Fouriera porównaj każdy obraz zielonej fluorescencji z obrazem referencyjnym i oblicz przemieszczenia na każdym obrazie za pomocą prędkości obrazu cząstek36. Z przemieszczeń odzyskaj przyczepność wytwarzaną przez komórki na żelu PA za pomocą mikroskopii trakcyjnej z transformacją Fouriera33,34,37.</li>
	<li>Na podstawie danych trakcyjnych oblicz naprężenie w monowarstwie wyspy komórkowej za pomocą jednowarstwowej mikroskopii naprężeń opartej na metodach elementów skończonych32,34,38.</li>
</ol>

<ol><li>Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+from+tissue+culture+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell migration: from tissue culture to embryos.</a> Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Mayor, R., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+front+and+rear+of+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The front and rear of collective cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).</li>
<li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+forces%3A+architectural+control+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).</li>
<li>Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+involving+multimodular+proteins%3A+converting+force+into+biochemical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+guidance+of+cell+migration%3A+lessons+from+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).</li>
<li>Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanoresponsive+cadherin-keratin+complex+directs+polarized+protrusive+behavior+and+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration.</a> Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanotransduction%3A+putting+all+the+pieces+together+again%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).</li>
<li>Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+traction+forces+of+motile+dendritic+cells+on+micropost+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays.</a> Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).</li>
<li>Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+orthogonal+gradients+of+chemical+concentration+and+substrate+stiffness+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Multiplexed+Drug-Combination+Screening+Platforms+Using+3D+Microtumor+Model+for+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine.</a> Small. 14 (42), 1703617(2018).</li>
<li>Ayuso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+Chemotactic+Response+of+Multicellular+Spheroids+in+a+Microfluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device.</a> PLoS ONE. 10 (10), 0139515(2015).</li>
<li>McCutcheon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+neuroclusters+in+microfluidic+devices+and+cell+migration+as+a+function+of+stromal-derived+growth+factor+1+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients.</a> Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).</li>
<li>Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+self-organization+based+on+collective+cell+migration+by+contact+activation+of+locomotion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).</li>
<li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).</li>
<li>Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+membrane-based+gradient+generator+for+use+in+cell-signaling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies.</a> Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).</li>
<li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+3D+in+vitro+model+for+specificity+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone.</a> Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whence+directionality%3A+guidance+mechanisms+in+solitary+and+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration.</a> Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+guidance+of+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective guidance of collective cell migration.</a> Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).</li>
<li>McCutcheon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+neuroclusters+in+microfluidic+devices+and+cell+migration+as+a+function+of+stromal-derived+growth+factor+1+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients.</a> Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whence+directionality%3A+guidance+mechanisms+in+solitary+and+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration.</a> Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).</li>
<li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+guidance+of+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective guidance of collective cell migration.</a> Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).</li>
<li>Farrell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HGF+induces+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+modulating+the+mammalian+hippo%2FMST2+and+ISG15+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways.</a> Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).</li>
<li>Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+acts+as+a+mitogen+and+chemoattractant+for+postnatal+subventricular+zone-olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+substrate+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review.+E%2C+Statistical%2C+Nonlinear+and+Soft+matter+Physics%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of substrate thickness.</a> Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918(2010).</li>
<li>Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+forces+and+kinematics+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping forces and kinematics during collective cell migration.</a> Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).</li>
<li>Denisin, A. K., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Range+of+Polyacrylamide+Gel+Stiffness+for+Mechanobiology+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+microscopy+with+integrated+microfluidics%3A+responses+of+the+multi-cellular+island+to+gradients+of+HGF%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF.</a> Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li>
<li>Jang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenizing+cellular+tension+by+hepatocyte+growth+factor+in+expanding+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer.</a> Scientific Reports. 8, 45844(2017).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5 (6), 426(2009).</li>
<li>Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS ONE. 8 (2), 55172(2013).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).</li>
<li>Notbohm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Contraction+and+Polarization+Drive+Collective+Cellular+Motion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion.</a> Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).</li>
<li>Sunyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propulsion+and+navigation+within+the+advancing+monolayer+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet.</a> Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zbiorowa migracja komórek składowych jest ważnym procesem podczas rozwoju i regeneracji, a kierunek migracji jest często kierowany przez gradient chemiczny czynników wzrostu 4,23. Podczas migracji zbiorowej komórki wchodzą w interakcje z sąsiednimi komórkami i leżącymi pod nimi substratami. Takie oddziaływania mechaniczne powodują powstawanie zjawisk emergentnych, takich jak durotaksja42, plitotaksja33 i kenotaksja<...

Migracja komórek w systemach biologicznych jest podstawowym zjawiskiem związanym z tworzeniem tkanek, odpowiedzią immunologiczną i gojeniem się ran1,2,3. Migracja komórkowa jest również ważnym procesem w niektórych chorobach, takich jak rak4. Komórki często migrują jako grupa, a nie pojedynczo, co jest znane jako zbiorcza migracja komórek4,5. Aby komórki mogły poruszać się kolektywnie, niezbędne jest wykrywanie mikrośrodowiska6. Na przykład komórki odbierają bodźce fizykochemiczne i reagują poprzez zmianę ruchliwości, interakcje komórka-substrat i interakcje komórka-komórka, co skutkuje migracją kierunkową wzdłuż gradientu chemicznego7,8,9,10. Opierając się na tym połączeniu, dokonano szybkich postępów w technologiach lab-on-a-chip, które mogą tworzyć dobrze kontrolowane mikrośrodowiska chemiczne, takie jak gradient chemoatraktantu11,12,13. Chociaż te mikroprzepływy oparte na chipie typu lab-on-a-chip były wcześniej używane do badania chemotaksji zespołu komórkowego lub sferoid komórkowych14,15,16,17, były one używane głównie w kontekście migracji pojedynczej komórki18,19,20,21. Mechanizmy leżące u podstaw zbiorowej odpowiedzi komórkowej na gradient chemiczny wciąż nie są dobrze poznane14,22,23,24,25,26. W związku z tym opracowanie platformy, która umożliwi czasoprzestrzenną kontrolę czynników rozpuszczalnych, a także obserwację in situ biofizyki komórek, pomoże rozwikłać mechanizmy stojące za zbiorową migracją komórek.
Opracowany i opisany tutaj jest wielokanałowy system mikroprzepływowy, który umożliwia generowanie gradientu stężeń rozpuszczalnych czynników, który moduluje migrację wzorzystych klastrów komórek. W tym badaniu czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) został wybrany do regulacji zachowań migracyjnych komórek nerki psów Madin-Darby (MDCK). Wiadomo, że HGF osłabia integralność komórka-komórka i zwiększa ruchliwość komórek27,28. W układzie mikroprzepływowym włączono również mikroskopię trakcyjną z transformacją Fouriera i jednowarstwową mikroskopię naprężeniową, co umożliwia analizę ruchliwości, siły skurczu i napięcia międzykomórkowego indukowanego przez komórki składowe w odpowiedzi na gradient HGF. W obrębie tej samej wyspy komórki znajdujące się w pobliżu wyższego stężenia HGF migrują szybciej i wykazują niższy poziom stresu międzykomórkowego niż te po stronie o niższym stężeniu HGF. Wyniki sugerują, że ten nowy system eksperymentalny jest odpowiedni do zbadania innych zagadnień w dziedzinach związanych ze zbiorową migracją komórek w warunkach gradientów chemicznych różnych rozpuszczalnych czynników.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór buforowy HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Dziurkacz do biopsji</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalki Petriego</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>średnica 100 mm, wysokość 15 mm</td></tr><tr><td>14 mm dziurkacz pusty</td><td>ILJIN</td><td>124-0571</td><td></td></tr><tr><td>18 mm &Oslash; Szkiełko nakrywkowe</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111580</td><td>Circular 18 mm, grubość nr 1 (0,13 do 0,16 mm)</td></tr><tr><td>2% roztwór bis-akryloamidu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td>Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne</td></tr>.<tr><td>3-(Trimethoxysililo)propyl metakrylan (TMSPMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159-500ML</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy kran</td><td>Hyupsung</td><td>HS-T-61N</td><td>UWAGA: nie używać, jeśli został wcześniej otwarty. nie sterylizuj ani nie używaj ponownie</td></tr><tr><td>linii o minimalnej objętości 30 cm (dla dzieci)</td><td>Hyupsung</td><td>HS-MV-30</td><td>UWAGA: nie używać, jeśli został wcześniej otwarty. Nie sterylizować ani nie używać ponownie</td></tr><tr><td>naczyń do hodowli komórkowych 35 mm</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td>Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Linia o minimalnej objętości 75 cm (dla dzieci)</td><td>Hyupsung</td><td>HS-MV-75</td><td>UWAGA: nie używać, jeśli został wcześniej otwarty. nie regenerować ani nie używać</td></tr><tr><td>ponownie kwasu octowego</td><td>J.T. Baker</td><td>JT9508-03</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Dolny chip szklany</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>24 x 24 x 1 mm, wykonany na zamówienie, rowek prostokątny (6 x 12 mm, głębokość: 100 &mu; m)</td></tr> <tr><td>Kolagen typu I, ogon szczura</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowy uchwyt na szkło</td><td>Han-Gug Mechatronika</td><td>na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco (DMEM)</td> <td>Welgene</td><td>LM 001-11</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td> <td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td>bez magnezu, wapnia</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres mikrosfery modyfikowane aminami</td><td>Invitrogen</td><td>F8764</td><td>0,2 &micro; m, żółto-zielona fluorescencyjna (505/515)</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu hepatocytów (HGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1404-5UG</td><td>rekombinowany, ludzki</td></tr><tr><td>system obrazowania żywych komórek w stadium JuLI</td><td>NanoEnTek w</td><td></td><td>zautomatyzowanym etapie X-Y-Z i obrazowaniu fluorsent Kompatybilny z inkubatorem (37 & deg; C i 5% CO2)</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)</td><td></td><td></td><td>cell type II</td></tr><tr><td>System plazmy tlenowej</td><td>Femto Science</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian rodaminy B&ndash; dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379-100MG</td><td>70 kDa, służy do szacowania czasoprzestrzennego rozkładu HGF w kanale mikroprzepływowym</td></tr><tr><td>Sterylna igła podskórna 18 G</td><td>KOVAX</td><td></td><td>Przytnij końcówkę igły i zegnij ją pod kątem 90 stopni, aby podłączyć porty wejściowe / wyjściowe z linią głośności</td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>3M/Scotch</td><td>810D</td><td>33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>Formy wzorcowe SU-8</td><td>MicroFIT</td><td></td><td>4" średnica, wykonany na zamówienie</td></tr> 6<tr><td>-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanian sulfosukcynimidylu (Sulfo-SANPAH)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td>Przechowywać w temperaturze -20&C. Przechowywać w chronionym miejscu przed wilgocią i światłem.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>PDMS Pompa</td></tr><tr><td>strzykawkowa</td><td>Chemyx Inc.</td><td>model fusion 720</td> strzykawki <td>do pobierania płynu</td></tr><tr><td></td><td>KOVAX</td><td></td><td>1, 3, 5, 10 lub 50 cc do korzystania ze zbiornika wlotowego lub wylotowego pompy strzykawkowej</td></tr><tr><td>tetrametyloetylenodiaminy (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610800</td><td>Nosić rękawice ochronne, odzież i ochronę oczu.</td></tr><tr><td>Lampa ultrafioletowa (UV)</td><td>UVP LLC</td><td>95-0248-02</td><td>Długość fali 365 nm</td></tr></tbody></table>

mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Komórki zmieniają wzorce migracji w odpowiedzi na bodźce chemiczne, w tym gradienty bodźców. Migracja komórek w kierunku gradientu chemicznego, znana jako chemotaksja, odgrywa ważną rolę w rozwoju, odpowiedzi immunologicznej, gojeniu się ran i przerzutach raka. Podczas gdy chemotaksja moduluje migrację pojedynczych komórek, a także zbiorów komórek in vivo, badania in vitro koncentrują się na chemotaksji pojedynczych komórek, częściowo z powodu braku odpowiednich narzędzi eksperymentalnych. Aby wypełnić tę lukę, opisano tutaj unikalny system eksperymentalny, który łączy mikrofluidykę i mikrowzory, aby zademonstrować wpływ gradientów chemicznych na zbiorową migrację komórek. Ponadto mikroskopia trakcyjna i jednowarstwowa mikroskopia naprężeniowa są włączone do systemu w celu scharakteryzowania zmian siły komórkowej na podłożu, a także między sąsiednimi komórkami. Jako dowód słuszności koncepcji, migracja mikrowzorzystych okrągłych wysp komórek nerki psów Madin-Darby (MDCK) jest testowana w gradiencie czynnika wzrostu hepatocytów (HGF), znanego czynnika rozpraszającego. Stwierdzono, że komórki znajdujące się w pobliżu wyższego stężenia HGF migrują szybciej niż te po przeciwnej stronie w obrębie wyspy komórkowej. W obrębie tej samej wyspy trakcja komórkowa jest podobna po obu stronach, ale stres międzykomórkowy jest znacznie niższy po stronie wyższego stężenia HGF. Ten nowatorski system eksperymentalny może zapewnić nowe możliwości badania mechaniki migracji chemotaktycznej przez kolektywy komórkowe.

Aby zbadać migrację zbiorową w warunkach gradientu chemicznego, zastosowano system mikropłynowy połączony z mikroskopią sił naprężeń (Rycina 1). Aby zbudować ten zintegrowany system, żel poliakrylamidowy (PA) został odlewany na specjalnie przyciętym szkle, a komórki MDCK zostały zasiaane na wyspach utworzonych za pomocą szablonu PDMS. W tym doświadczeniu stworzono dwanaście wysp komórek MDCK (cztery rzędy na trzy kolumny, średnica około 700 μm). Po przyczepieniu się komórek do żelu PA szablo...

Zbiorowa migracja komórek w procesie rozwoju, gojenia ran i przerzutów nowotworowych jest często kierowana przez gradienty czynników wzrostu lub cząsteczek sygnałowych. Opisano tutaj eksperymentalny system łączący mikroskopię trakcyjną z układem mikroprzepływowym oraz demonstrację sposobu ilościowego określania mechaniki migracji zbiorowej w warunkach gradientu biochemicznego.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Zbiorowa migracja komórek jest często kierowana przez gradient cząsteczek sygnałowych. W tym filmie pokazujemy, jak określić ilościowo siły komórkowe podczas migracji zbiorowej kierowanej gradientem biochemicznym. Integrujemy więc chip mikroprzepływowy z mikroskopią trakcyjną, następnie używamy chipa mikroprzepływowego do generowania gradientu biochemicznego i używamy mikroskopii trakcyjnej do pomiaru siły komórkowej.Dr Hwanseok Jang, doktor nauk humanistycznych w moim laboratorium, zademonstruje tę procedurę. Przygotować roztwór PDMS, mieszając elastomer bazowy i utwardzacz w stosunku dziesięć do jednego. Umieść 15 mililitrów elastomeru bazowego w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i dodaj 1,5 mililitra utwardzacza.Przygotuj dwie z tych probówek. Mieszaj mieszaninę PDMS przez pięć minut, a następnie odwiruj w temperaturze 196 g przez jedną minutę w celu usunięcia pęcherzyków. Aby wytworzyć szablon PDMS, wlej około jednego mililitra mieszaniny PDMS na płytkę, unikając obszarów z wzorem SU-8, tak aby PDMS dotykał boku filarów SU-8, ale nie górnej części wzoru SU-8.Umieść wafel na płaskiej powierzchni na ponad 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie utwardź PDMS w suchym piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez ponad dwie godziny. Ostrożnie oderwij PDMS od formy SU-8, przytnij cienką membranę PDMS za pomocą 14-milimetrowego pustego stempla. Usuń kurz z powierzchni elementów PDMS za pomocą taśmy klejącej przed autoklawowaniem szablonów PDMS.Aby wytworzyć mikrokanał PDMS, wlej około 30 mililitrów mieszaniny PDMS na formę SU-8. Odgazuj przez 30 minut w komorze próżniowej, a następnie utwardź PDMS w suchym piecu w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez ponad dwie godziny. Ostrożnie oderwij PDMS od formy SU-8 i przytnij PDMS do rozmiaru 24 milimetry na 24 milimetry.W każdym bloku PDMS utwórz jeden wylot i trzy wloty za pomocą jednomilimetrowego stempla biopsyjnego. Produkcja i silanizowanie szkiełek szklanych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przykryj krawędź dolnej szyby 100 mikrolitrami roztworu silanu wiążącego.Po pozostawieniu szklanki w temperaturze pokojowej na godzinę należy ją trzykrotnie spłukać wodą dejonizowaną. Następnie pozostaw szkło do wyschnięcia w temperaturze otoczenia lub przedmuchując sprężonym powietrzem. Przygotować roztwór żelu poliakryloamidowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie przenieś na 10 mikrolitrów zmieszanego roztworu żelu na prostokątną mikrostudzienkę i umieść na niej okrągłe szkiełko nakrywkowe. Zamocuj zestaw niestandardowego szkła, roztworu żelu i szkiełka nakrywkowego na pokrywie płytki sześciodołkowej za pomocą taśmy klejącej i odwróć ją. Następnie wirować przez 10 minut w temperaturze 96 razy g, aby doprowadzić cząstki fluorescencyjne do górnej warstwy żelu poliakrylamidowego.Wyjmij zespół z wirówki i umieść go na płaskiej powierzchni z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół. Po 30 minutach odwróć zestaw i umieść go na 35-milimetrowej szalce Petriego. Napełnij naczynie dwoma mililitrami wody dejonizowanej.Za pomocą kleszczy delikatnie usuń szkiełko nakrywkowe, przesuwając je na bok. Aby zakodować kolagen na żelu poliakrylamidowym, należy rozpuścić jeden miligram na mililitr sulfo-SANPAH w ciepłym 50-milimolowym buforze HEPES. Upuść 200 mikrolitrów roztworu na powierzchnię żelu i aktywuj światłem UV przez 10 minut.Po aktywacji UV spłucz żel dwa razy 0,1-molowym buforem HEPES, a następnie raz PBS. Zakoduj żel poliakrylamidowy roztworem kolagenu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przemyj żel trzykrotnie PBS.Zanurz autoklawowany szablon PDMS w roztworze F-127. Trzymaj go w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj szablon PDMS trzykrotnie PBS i usuń płyn zarówno z szablonu PDMS, jak i żelu poliakrylamidowego.Następnie umieść szablon PDMS na żelu poliakrylamidowym i dodaj PBS do szablonu. Usuń pęcherzyki z otworów szablonu PDMS, delikatnie pipetując. Po usunięciu pęcherzyków usuń PBS z powierzchni szablonu PDMS.Teraz dodaj 200 mikrolitrów roztworu komórkowego na szablon PDMS i umieść żel w inkubatorze na jedną godzinę, aby komórki przyczepiły się do żelu poliakrylamidowego. Po inkubacji delikatnie zmyć roztwór komórkowy pożywką do hodowli komórkowych i dodać więcej pożywki do hodowli komórkowych. Usuń szablon PDMS, sprawdź tworzenie się wysp komórkowych pod mikroskopem.Następnie potraktuj powierzchnię mikrokanału PDMS plazmą tlenową przez 30 sekund. Po usunięciu płynu z dolnej szyby wypełnionej żelem poliakrylamidowym, umieść mikrokanał PDMS na dolnej szybie i umieść zespół na niestandardowym uchwycie szklanym. Wypełnij mikrokanalik pożywką do hodowli komórkowych.Aby przygotować rurkę wlotową zintegrowanego systemu mikroprzepływowego, podłącz przyciętą igłę i 30-centymetrową linię mini objętości z trójdrogowym kranem. Przygotuj trzy z tych układów. W przypadku rurki wylotowej podłącz przyciętą igłę i 75-centymetrową linię mini objętości z trójdrożnym kranem.Napełnij przewody rurkowe medium, które było wstępnie podgrzewane przez godzinę. Przygotować zbiorniki, wyjmując tłoki ze strzykawek i podłączając przewody doprowadzające. Podłącz złącza igłowe każdej linii rurowej do trzech wlotów i jednego wylotu urządzenia mikroprzepływowego.Napełnij każdy zbiornik trzema mililitrami świeżej pożywki lub kondycjonowanej pożywki. W teście gradientowym napełnij lewy zbiornik wlotowy 20 nanogramami na mililitr czynnika wzrostu hepatocytów lub HGF w pożywce do hodowli komórkowych. W celu wizualizacji gradientu stężeń dodaj 200 mikrogramów na mililitr barwnika fluorescencyjnego do lewego zbiornika wlotowego.Podłącz przewód wylotowy do pompy strzykawkowej. Umieść zintegrowany system mikroprzepływowy na stoliku konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego. Wykonuj zdjęcia co 10 minut przez maksymalnie 24 godziny za pomocą automatycznego mikroskopu umieszczonego w inkubatorze.W każdym punkcie czasowym wykonaj zestaw obrazów za pomocą soczewki obiektywowej 4X w trzech różnych kanałach, w tym obraz fazowy do wizualizacji migracji komórek, zielony obraz fluorescencyjny do wizualizacji kulek fluorescencyjnych osadzonych w żelu oraz czerwony obraz fluorescencyjny do wizualizacji gradientu stężenia substancji chemicznej. Po wykonaniu zdjęć poklatkowych wlej 0,25% roztwór trypsyny-EDTA do mikrokanalików, aby odłączyć komórki od żelu poliakrylamidowego. Po całkowitym usunięciu komórek z żelu należy wykonać zielony obraz fluorescencyjny, który zostanie wykorzystany jako obraz referencyjny do mikroskopii trakcyjnej.Przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zmierzyć siłę skurczu i stres międzykomórkowy, połączono mikroskopię trakcyjną i jednowarstwową mikroskopię naprężeń z kanałem mikroprzepływowym. Mapy zostały naniesione w koordynacji radiowej z trakcją na zewnątrz przy użyciu ciepłego koloru i trakcją wewnętrzną przy użyciu zimnego koloru.W czasie zero wszystkie wyspy wykazywały podobny rozkład trakcji z silną przyczepnością wewnętrzną na krawędzi i wahaniami w obrębie wyspy. Po 10 godzinach stosowania gradientu HGF, podczas gdy stopień rozszerzania się wyspy był różny w każdej kolumnie, rozkłady trakcji były w dużej mierze podobne do czasu zero. Średnia przyczepność nie zmieniła się przez 10 godzin.Jednak przy obliczaniu naprężenia jednowarstwowego każda kolumna wykazywała inne trendy. Tam, gdzie stężenie HGF było niskie, średnie napięcie w obrębie wysp utrzymywało się na poziomie około 200 paskali przez okres 10 godzin. Tam, gdzie stężenie HGF było wysokie, średnie napięcie w obrębie wysp stopniowo spadało z 230 paskali do 100 paskali w ciągu 10 godzin, jak wykazano wcześniej.Tam, gdzie stężenie HGF było wysokie w lewej połowie i niskie w prawej połowie wyspy, średnie napięcie utrzymywało się na poziomie około 150 paskal. Napełnianie kanału mikroprzepływowego musi być delikatne. Ważne jest, aby usunąć pęcherzyki uwięzione w kanale, jednocześnie nie zakłócając wysp mikrokomórek rodzicielskich.Korzystając z tego zintegrowanego systemu, można zbadać, w jaki sposób zbiorowe komórki reagują mechanicznie na różne gradienty chemiczne, takie jak atraktanty chemioterapii lub czynniki wzrostu. Ta platforma pomoże nam dalej badać mechanikę zbiorowej migracji komórek w gradientach chemicznych, co jest kluczem do zrozumienia regeneracji, przerzutów i rozwoju raka.

traction-microscopy-integrated-with-microfluidics-for-chemotactic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano proces wytwarzania kanałów mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach służących do badania zachowań chemotaktycznych morskich drobnoustrojów w niejednorodnym środowisku nutrientowym (patchy nutrient seascape) oraz zachowań pływackich bakterii w przepływie ścinającym.

Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Badania nad chemotaksją bakteryjną z wykorzystaniem mikroprzepływów – wywiad

Niniejszy protokół opisuje opracowanie urządzenia mikroprzepływowego do badania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń chemoefektorów.

Urządzenie mikroprzepływowe do ilościowego oznaczania chemotaksji bakteryjnej w stabilnych gradientach stężeń

Opisano przedzielone urządzenie mikrofluidyczne do badania migracji komórek macierzystych nowotworu. Ta nowatorska platforma tworzy żywotne mikrośrodowisko komórkowe i umożliwia mikroskopową wizualizację lokomocji żywych komórek. Wysoce ruchliwe komórki nowotworowe są izolowane w celu zbadania molekularnych mechanizmów agresywnej infiltracji, co w przyszłości może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych terapii.

Ocena migracji komórek macierzystych nowotworu z wykorzystaniem kompartymentowych urządzeń mikroprzepływowych i obrazowania żywych komórek

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisano ilościową metodę badania spontanicznej migracji komórek w jednowymiarowym, zamkniętym mikrośrodowisku. Metoda ta wykorzystuje mikrofabrykowane kanały i może być stosowana do badania migracji dużej liczby komórek w różnych warunkach w pojedynczych eksperymentach.

Badanie migracji komórek w kanałach mikroprefabrykowanych

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Prezentowany jest tutaj protokół testu chemotaksji in situ, niedawno opracowanego urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia badanie zachowania mikroorganizmów bezpośrednio w środowisku.

Test chemotaksji in situ w celu zbadania zachowania mikroorganizmów w ekosystemach wodnych

Poznaj metodę mikroskopii trakcyjnej zintegrowanej z mikrofluidyką do badania sił komórkowych podczas zbiorowej migracji chemotaktycznej. Technika ta pozwala ilościowo określić mechanikę ruchu komórek w odpowiedzi na gradienty biochemiczne.

Mikroskopia trakcyjna zintegrowana z mikrofluidyką do chemotaktycznej migracji zbiorowej

Przeglądaj więcej filmów