Name: Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności jelit u Caenorhabditis elegans w badaniach mikrobioty jelitowej. Protokół umożliwia szybką analizę wpływu bakterii i substancji chemicznych na zdrowie jelit oraz identyfikację potencjalnych probiotyków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant badawczy Koreańskiego Instytutu Nauki i Technologii (2E29563).

1. Przygotowanie kultury P. aeruginosa PAO1 i Escherichia coli OP50
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml wysterylizowanej pożywki Luria-Bertani (LB) (Tabela 1) i zaszczepić pojedynczą kolonię P. aeruginosa w pożywce. Inkubować kulturę przez 14-15 godzin w temperaturze 37 °C z prędkością wytrząsania 150 obr./min.</li>
	<li>Równomiernie rozprowadzić kulturę bakteryjną do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 500 ml i odwirować probówki przy ciśnieniu 3,220 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant do momentu, gdy objętość osiągnie 50 ml (jedna dziesiąta objętości początkowej) i ponownie zawiesić osad bakteryjny.</li>
	<li>Skoncentrowaną kulturę bakteryjną przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Okres przechowywania kultury P. aeruginosa może wynosić do 1 miesiąca, ale świeża kultura jest lepsza do wywoływania uszkodzenia jelit. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Oprócz całych żywych bakterii, supernatant kultury bakteryjnej może być użyty do zbadania działania bakterii jelitowych19.</li>
	<li>Aby przygotować E. coli OP50, należy wyhodować E. coli OP50 w pożywce DYT (Tabela 1), a następnie zastosować podobne kroki do opisanych powyżej, ale zmniejszyć objętość do jednej szóstej pierwotnej objętości. Na przykład, jeśli początkowa objętość wynosi 500 ml, po usunięciu supernatantu pozostała objętość wynosi około 83 ml. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury Enterococcus faecalis KCTC 3206
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml wysterylizowanego bulionu z naparu z serca mózgu (BHI) (Tabela 1).</li>
	<li>Zaszczepić jedną kolonię w 500 ml bulionu BHI i inkubować kulturę przez 14–15 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 150 obr./min.</li>
	<li>Równomiernie rozprowadzić kulturę bakteryjną do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 500 ml i odwirować probówki przy ciśnieniu 3,220 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad do momentu, gdy jego objętość wyniesie 50 ml (jedna dziesiąta objętości początkowej) i ponownie zawiesić osad.</li>
	<li>Skoncentrowaną kulturę bakteryjną przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Świeża kultura jest lepsza do testowania wpływu na przepuszczalność jelit. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
3. Przygotowanie inaktywowanych termicznie kultur E. coli OP50 i inaktywowanych termicznie P. aeruginosa PAO1
<ol>
	<li>Zahoduj i zbierz bakterie zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.1–1.3).</li>
	<li>Inaktywuj termicznie kulturę E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1, jak opisano wcześniej20,21,22. W celu inaktywacji termicznej inkubować zawieszone bakterie w temperaturze 65 °C (łaźnia wodna) przez 30 minut.</li>
	<li>Schłodzić zagęszczoną kulturę bakteryjną do temperatury pokojowej i przechowywać ją w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Okres przechowywania może wynosić do 1 miesiąca. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pożywki do hodowli nicieni (NGM) do testowania wpływu różnych bakterii na przepuszczalność jelitową C. elegans
<ol>
	<li>W szklanej butelce o pojemności 500 ml umieść 1,25 g peptonu, 1,5 g NaCl, 8,5 g agaru, mieszadło magnetyczne i 487,5 ml wody destylowanej (tabela 1).</li>
	<li>Mieszaninę dobrze wymieszać, pozostawić mieszaninę w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C i schłodzić mieszaninę do temperatury 55 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z łaźni wodnej, dodać składniki (0,5 ml 1 M CaCl2, 0,5 ml cholesterolu, 0,5 ml MgSO4, 12,5 ml KPO4) (Tabela 1) do NGM i dobrze wymieszać. 
	nuta: Wszystkie poszczególne składniki muszą być sterylizowane w autoklawie, z wyjątkiem cholesterolu (rozpuszczonego w absolutnym etanolu), a każdy etap doświadczalny musi być przeprowadzony na czystym stanowisku badawczym.</li>
	<li>Rozprowadzić 20 ml NGM na każdą szalkę Petriego o wymiarach 90 x 15 mm i pozostawić agar do zestalenia się na czystej ławce w temperaturze pokojowej (około 20 °C). Płytki NGM można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Płytki NGM używane do barwienia FITC-dekstranu przygotowano według tej samej procedury (z kroków 4.1–4.3). 10 ml NGM rozprowadzono na każdą szalkę Petriego o wymiarach 60 x 15 mm i pozostawiono do zestalenia na czystej ławce w temperaturze pokojowej (około 20 °C).</li>
	<li>Wyjąć kulturę bakteryjną z lodówki o temperaturze 4 °C i dokładnie wymieszać kulturę przed rozprowadzeniem kultury na płytkach NGM.</li>
	<li>Dodać łącznie 800 μl kultury bakteryjnej do każdej świeżej płytki NGM i pozostawić płytki do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez noc. 
	nuta: Do pierwszego eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) przygotowano dwie płytki NGM z E. coli OP50, jedną płytkę NGM z P. aeruginosa PAO1 i jedną płytkę NGM z E. faecalis KCTC3206. Do drugiego eksperymentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) przygotowano dwie płytki NGM z żywym E. coli OP50, jedną płytkę NGM z żywym P. aeruginosa PAO1 i jedną płytkę NGM z inaktywowanym termicznie P. aeruginosa PAO1.</li>
</ol>
5. Przygotowanie płytek NGM do badania wpływu substancji chemicznej (DIM) na przepuszczalność jelit C. elegans karmionych P. aeruginosa
<ol>
	<li>Dodaj 0,5 g peptonu, 0,6 g NaCl, 195 ml wody destylowanej, mieszadło magnetyczne i 6,8 g agaru do szklanej butelki o pojemności 500 ml (agar NGM).</li>
	<li>Dodaj 0,5 g peptonu, 0,6 g NaCl, 195 ml wody destylowanej i mieszadło magnetyczne bez agaru do kolejnej szklanej butelki o pojemności 500 ml (bulion NGM).</li>
	<li>Dwie butelki (z kroków 5.1–5.2), jedną pustą szklaną butelkę o pojemności 100 ml należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C. Następnie pozostawić butelki zawierające podłoże do ostygnięcia do temperatury 55 °C w łaźni wodnej przez 30 minut. Trzymaj podłoże agarowe w łaźni wodnej i wyjmij butelkę z bulionem (z kroku 5.2) do następnego kroku.</li>
	<li>Dodaj dodatki chemiczne do bulionu NGM: 0,4 ml 1 M CaCl2, 0,4 ml cholesterolu w etanolu (ml), 0,4 ml 1 MMgSO4 i 10 ml 1 M KPO4 (wszystkie te składniki muszą być sterylizowane z wyjątkiem cholesterolu w etanolu). Następnie dokładnie wymieszać mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Oznacz autoklawowaną pustą szklaną butelkę o pojemności 500 ml dimetylosulfotlenkiem (DMSO), a autoklawowaną pustą szklaną butelkę o pojemności 100 ml za pomocą DIM.</li>
	<li>Przenieś 50 ml bulionu NGM do butelki o pojemności 100 ml z oznaczeniem DIM. Dodaj 500 μl bulionu DIM 20 mM do butelki i dobrze wymieszaj. 
	nuta: DIM jest rozpuszczony w DMSO (zapas DIM 20 mM).</li>
	<li>Szybko wyjmij podłoże agarowe NGM z łaźni wodnej, dodaj 50 ml podłoża agarowego NGM do butelki z etykietą DIM i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Umieścić 20 ml podwielokrotności pożywki NGM zawierającej DIM na każdej szalce Petriego o wymiarach 90 mm x 15 mm. Z tego kroku można wykonać około pięciu płytek NGM zawierających DIM. 
	nuta: Końcowe stężenie DIM w każdej płytce NGM wyniesie 100 μM.</li>
	<li>Aby przygotować płytkę NGM zawierającą DMSO, przenieś 150 ml bulionu NGM do butelki o pojemności 500 ml z oznaczeniem DMSO. Dodaj 1,5 ml DMSO do butelki i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Dodaj 150 ml podłoża agarowego NGM do butelki z oznaczeniem DMSO i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Umieścić 20 ml podwielokrotności pożywki NGM zawierającej DMSO na każdej szalce Petriego o wymiarach 90 mm x 15 mm. Na tym etapie można wykonać około piętnastu płytek NGM zawierających DMSO. 
	nuta: Końcowe stężenie DMSO w każdej płytce NGM wyniesie 0,5%.</li>
	<li>Zestalić płytki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny i przechowywać je w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Wyjąć kulturę E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1 z lodówki o temperaturze 4 °C (od kroku 1.4) i odpowiednio wymieszać kulturę przed rozprowadzeniem na płytkach NGM.</li>
	<li>Umieścić 800 μl kultury bakterii E. coli OP50 lub P. aeruginosa PAO1 na każdej świeżej płytce agarowej NGM i pozostawić płytki do wyschnięcia w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez noc. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. W trzecim eksperymencie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) przygotowano dwie płytki NGM zawierające DMSO pokryte żywym E. coli OP50, jedną płytkę NGM zawierającą DMSO pokrytą żywym P. aeruginosa PAO1 i jedną płytkę NGM zawierającą DIM pokrytą żywym P. aeruginosa PAO1.</li>
</ol>
6. Przygotowanie C. elegans zsynchronizowanych z wiekiem
<ol>
	<li>Hoduj robaki na solidnej płytce NGM i karm je E. coli OP50, aż do osiągnięcia pożądanej populacji.</li>
	<li>Zsynchronizuj jaja, stosując metodę składania jaj z określonym czasem lub roztwór wybielający, jak opisano wcześniej20,23,24.</li>
</ol>
7. Leczenie bakterii lub karmienie DIM i FITC-dekstranem
<ol>
	<li>Inkubować jaja zsynchronizowane z wiekiem w temperaturze 20 °C przez 64 godziny na płytkach NGM uzupełnionych żywymi bakteriami E. coli OP50 jako pokarmem.</li>
	<li>Przemyć zsynchronizowane z wiekiem larwy L4 buforem S i przenieść je (ponad około 500 robaków) na płytki NGM zawierające różne bakterie i substancje chemiczne (opisane w UWAGA po krokach 4.6 i 5.14). Inkubować je w temperaturze 20 °C przez 48 h. 
	nuta: Czas zabiegu może wynosić od 24 do 72 godzin, w zależności od zastosowanych bakterii i chemikaliów. Efekt terapeutyczny lub zapobiegawczy DIM można również ocenić poprzez wstępne traktowanie robaków patogenami, a następnie leczenie robaków DIM (efekt terapeutyczny) lub poprzez wstępne traktowanie robaków DIM, a następnie leczenie patogenami (efekt zapobiegawczy)19.</li>
	<li>Aby przygotować płytki uzupełnione dekstranem FITC, należy zmieszać 2 ml inaktywowanego termicznie E. coli OP50 z 4 mg dekstranu FITC. Następnie podzielić 100 μl mieszaniny FITC-dekstranu i E. coli OP50 na dwadzieścia świeżych płytek agarowych NGM (60 mm x 15 mm) i pozostawić płytki do wyschnięcia na 1 godzinę na czystej ławce. 
	nuta: Końcowe stężenie dekstranu FITC-w każdej płytce NGM wyniesie 20 μg/ml.</li>
	<li>Przygotować pięć płytek NGM zawierających E. coli OP50 bez dekstranu FITC-dekstran do badania kontrolnego nośnika. W tym celu podzielić 100 μl inaktywowanej termicznie E. coli OP50 na każdą świeżą płytkę agarową NGM (60 mm x 15 mm) i pozostawić płytki do wyschnięcia na 1 godzinę na czystej ławce. 
	nuta: Do każdego niezależnego eksperymentu wymagane jest piętnaście płytek NGM uzupełnionych dekstranem FITC i pięć płytek NGM bez dekstranu FITC.</li>
	<li>Po 48 godzinach leczenia (od kroku 7.2) przemyć robaki buforem S, przenieść robaki na płytki z dodatkiem dekstranu FITC i płytki NGM bez dekstranu FITC, a następnie inkubować płytki przez noc (14–15 godzin). 
	nuta: Dla każdej grupy badanej wymagane jest 5 powtórzeń barwienia FITC-dekstranem (lub podawania w grupie kontrolnej nośnika).</li>
	<li>Umyj robaki buforem S i pozwól im wpełznąć do świeżej płytki agarowej NGM przez 1 godz. 
	nuta: Do każdego niezależnego eksperymentu potrzebnych jest łącznie 20 świeżych płytek NGM. W tym kroku możesz użyć płytki NGM uzupełnionej bez lub z E. coli OP50.</li>
	<li>Dodać 50 μl 4% roztworu formaldehydu do każdego dołka czarnej 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Przenieś około 50 robaków z każdej płytki NGM do każdej studzienki w celu pomiarów fluorescencji. Po 1 do 2 minutach dokładnie usuń cały formaldehyd z każdej studzienki i dodaj 100 μl podłoża montażowego, aby pokryć studzienki. 
	nuta: Roztwór formaldehydu (4%) służy do unieruchamiania i utrwalania robaków. Dla każdej grupy badanej wykorzystuje się 5 dołków (5 powtórzeń) do analizy obrazu.</li>
</ol>
8. Obrazowanie C. elegans za pomocą systemu obrazowania operetki i oznaczanie przepuszczalności jelit poprzez pomiar wychwytu fluorescencji FITC-dekstranu
UWAGA: Stereomikroskopia fluorescencyjna może być używana do analizy obrazu zamiast systemu Operettka.
<ol>
	<li>Przechwytuj obrazy fluorescencyjne i mierz intensywność fluorescencji za pomocą systemu obrazowania Operetta High-Content i analizuj obrazy za pomocą oprogramowania Harmony.</li>
	<li>W oprogramowaniu Harmony naciśnij ikonę Otwórz pokrywę, aby otworzyć pokrywę i włożyć płytkę do urządzenia.</li>
	<li>Skonfiguruj parametry.</li>
	<li>Kliknij przycisk Konfiguruj, wybierz typ płyty (96-dołkowa płyta corning z płaskim dnem) i dodaj kanały (kanały jasnego pola i EGFP).</li>
	<li>Dostosuj układ. Przejdź do wyboru Układ, a następnie wybierz Ścieżka i dostosuj parametry (pierwsze zdjęcie na 1 μm, liczba płaszczyzn to 10, odległość to 1 μm).</li>
	<li>Wybierz jedną z studzienek zabiegowych i jedno pole przechwytywania i naciśnij Testuj, aby sprawdzić, czy zdjęcia są zadowalające w sekcji Uruchom eksperyment.</li>
	<li>Jeśli zdjęcia są zadowalające, wróć do sekcji Konfiguracja i naciśnij ikonę resetowania na końcu ekranu. Następnie należy zaznaczyć wszystkie studnie docelowe i odpowiednią liczbę pól przechwytywania.</li>
	<li>Przejdź ponownie do pozycji Uruchom eksperyment i wprowadź nazwę tablicy, a następnie naciśnij Start, aby rozpocząć przetwarzanie.</li>
	<li>Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, przejdź do sekcji analizy obrazu i wprowadź obraz. Znajdź komórkę, wybierając kanał EGFP i metodę B. Dostosuj wspólny próg do 0,5, obszar do >200 μm2, współczynnik podziału do 3,0, indywidualny próg do 0,18 i kontrast do więcej niż 0,18. Następnie oblicz właściwości intensywności i wybierz średnią jako wynik wyjściowy. Naciśnij ikonę Zastosuj, aby zapisać konfigurację.</li>
	<li>Przejdź do sekcji Ocena, aby zmierzyć intensywność, uzyskując mapę cieplną i tabelę danych. Ustaw parametr Readout na Cells — Intensity Cell EGFP Average — Average per Well i rozpocznij ocenę. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Aby wyodrębnić dane z Operetki, kliknij przycisk Ustawienia i wybierz Zarządzanie danymi.</li>
	<li>Wybierz pozycję Zapisz archiwum, a następnie otwórz przycisk przeglądania i wybierz plik.</li>
	<li>Aby wybrać plik, kliknij mały sygnał + w lewym rogu, a następnie kliknij Pomiar i wybierz Nazwa płyty.</li>
	<li>Wybierz plik i kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Wybierz ścieżkę, aby zapisać plik, klikając sygnał Przeglądaj w aktywnej ścieżce.</li>
	<li>Kliknij przycisk Start, aby zapisać plik danych. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
9. Analiza statystyczna fluorescencji FITC-dekstranu C. elegans
<ol>
	<li>Zaimportuj dane i oblicz średnią i odchylenie standardowe (SD) za pomocą oprogramowania statystycznego.</li>
	<li>Przeanalizuj istotną różnicę za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya.</li>
</ol>

<ol><li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+permeability%E2%80%93a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).</li>
<li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li>
<li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26(2018).</li>
<li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135(2016).</li>
<li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352(2018).</li>
<li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li>
<li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li>
<li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+germ+line%3A+A+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li>
<li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441(2018).</li>
<li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li>
<li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290(2014).</li>
<li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+apple+extracts+increase+lifespan%2C+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Functional+Foods%22%5BJournal%5D)">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li>
<li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li>
<li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%2C3%27-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology%2C+Medicine%22%5BJournal%5D)">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li>
<li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Oral+Administration+of+3%2C3%27-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%2C3%27-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li>
<li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437(2017).</li>
<li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK%2Fsirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li>
<li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor%2C+etoposide%2C+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227(2015).</li>
<li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genus+Enterococcus%3A+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791(2018).</li>
<li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).</li>
<li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li>
<li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+exotoxin+A%2C+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li>
<li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li>
<li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%2C3%27-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li>
<li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li>
<li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria%3A+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykorzystując tę nową metodę określania przepuszczalności jelit u C. elegans, która łączy zautomatyzowaną mikroskopię fluorescencyjną i ilościową analizę obrazu, można określić różnice spowodowane przez mikroorganizmy jelitowe lub substancje chemiczne in vivo, szczególnie w jelicie C. elegans. Protokół ten jest przydatny do badań przepuszczalności jelit i ma zastosowanie do wielu zadań, takich jak oznaczanie reaktywnych form tlenu (ROS) w warunkach stresu i badania morfologiczne, ze względu na wygodę i ...

Przepuszczalność jelit jest uważana za jedną z głównych barier związanych z mikrobiotą jelitową i odpornością błony śluzowej i prawdopodobnie wpływa na nią kilka czynników, takich jak modyfikacje mikrobioty jelitowej, upośledzenie nabłonka lub zmiany warstwy śluzu1. Ostatnie prace donoszą o skutecznych protokołach pomiaru przepuszczalności jelit hodowanych ludzkich komórek jelitowych poprzez analizę szybkości strumienia fluorescencji w warstwie komórek jelitowych2, ale mniej prac badawczych przedstawia odpowiednią procedurę pomiaru przepuszczalności jelit u nicieni, szczególnie u C. elegans, za pomocą barwienia FITC-dekstranu.
Istnieją dwa reprezentatywne protokoły pomiaru przepuszczalności jelit u C. elegans za pomocą czerwieni nilowej3 i disodu erioglaucyny (lub testu Smerfów)4,5. W tym protokole zastosowaliśmy dekstran FITC (średnia masa cząsteczkowa 10 000), który ma znacznie wyższą masę cząsteczkową niż czerwień nilowa (MW = 318,37) i disodowa erioglaucyny (MW = 792,85). FITC-dekstran jest bardziej podobny niż barwniki disodowe czerwieni nilowej lub erioglacjucyny do rzeczywistych makrocząsteczkowych składników odżywczych, takich jak węglowodany, które są wchłaniane przez warstwę jelitową. Przepuszczalność jelit C. elegans karmionych disodem erioglaucyny (niebieski barwnik Smerf) można łatwo ocenić bez mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak w teście Smerfa ilościowa analiza przepuszczalności jelit jest trudna ze względu na brak standaryzacji i powinna być oceniana ręcznie4,5. W przypadku testu czerwieni nilowej, czerwień nilowa barwi również kropelki lipidów w komórkach, co może zakłócać dokładne określenie przepuszczalności jelit u C. elegans6. Obecne protokoły umożliwiają szybką i precyzyjną analizę ilościową przepuszczalności jelit u C. elegans leczonych różnymi bakteriami jelitowymi i substancjami chemicznymi, unikając jednocześnie niespecyficznego barwienia lipidów.
C. elegans jest typowym modelem w dziedzinach biologicznych ze względu na przystępną cenę, łatwą manipulację, ograniczone problemy z etyką zwierząt i krótką żywotność, co jest korzystne dla szybkich eksperymentów7. W szczególności, po opublikowaniu całego genomu C. elegans, okazało się, że prawie 40% genów w genomie C. elegans jest ortologicznych w stosunku do genów powodujących choroby u ludzi8. Co więcej, przezroczysty korpus umożliwia obserwację wnętrza organizmu, co jest korzystne dla badań zdarzeń komórkowych i zastosowań fluorescencyjnych w biologii komórki, na przykład barwienia komórek macierzystych za pomocą DAPI lub immunohistochemistry9. C. elegans jest często wykorzystywany jako zwierzę doświadczalne do badania interakcji między mikrobiotą jelitową a gospodarzem; ponadto C. elegans jest używany do badań przesiewowych prozdrowotnych bakterii probiotycznych10,11,12, a także dietetycznych chemikaliów promujących zdrowie jelit13,14.
Pseudomonas aeruginosa i Enterococcus faecalis to dobrze znane bakterie jelitowe, które negatywnie wpływają na układ pokarmowy, zwłaszcza na komórki nabłonka okrężnicy przewodu pokarmowego15,16. Dlatego pomiar przepuszczalności jelit wywołanej przez te bakterie jest niezbędny do badań przesiewowych i opracowania nowych leków, które mogą odzyskać i zmniejszyć uszkodzenia spowodowane zapaleniem i infekcją bakteryjną. W tym protokole przetestowaliśmy wpływ tych bakterii jelitowych na przepuszczalność jelitową C. elegans.
Raportujemy również zoptymalizowany protokół testowania substancji chemicznych na przepuszczalność jelit C. elegans. W tym celu użyliśmy 3,3'-diindolilometanu (DIM) jako modelowej substancji chemicznej, ponieważ DIM jest bioaktywnym związkiem metabolitowym pochodzącym z indolo-3-karbinolu, który jest obecny w roślinach spożywczych Brassica i doniesiono, że ma działanie terapeutyczne na IBD u myszy17,18. Ponadto niedawno odkryliśmy, że DIM poprawia dysfunkcję przepuszczalności jelit zarówno w hodowanych ludzkich komórkach jelitowych, jak i w modelowym nicieniu C. elegans19.
W tym badaniu użyliśmy trzech różnych warunków eksperymentalnych. Po pierwsze, zmierzyliśmy wpływ różnych bakterii, P. aeruginosa i E. faecalis, na przepuszczalność jelit (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Po drugie, zmierzyliśmy wpływ żywego i inaktywowanego termicznie P. aeruginosa na przepuszczalność jelit (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Po trzecie, zmierzyliśmy wpływ DIM (modelowej substancji chemicznej) na przepuszczalność jelit C. elegans karmionych P. aeruginosa (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).
Celem tego badania było opracowanie zoptymalizowanych protokołów, które mierzą przepuszczalność jelit C. elegans, która jest zmieniana przez leczenie różnymi bakteriami jelitowymi, jak również chemikaliami.

<table><tbody><tr><td>3,3'-diindolylmetan&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9568</td><td></td></tr><tr><td>90 razy; 15 mm szalki Petriego</td><td>SPL Life Sciences, Korea Południowa</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>60 razy; Szalki Petriego 15 mm</td><td>SPL Life Sciences, Korea Południowa</td><td>10060</td><td></td></tr><tr><td>Bactor Agar</td><td>Beckton Dickinson</td><td>REF. 214010</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Napar z mózgu i serca (BHI)&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF. 237500</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans N2</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td>Typ dziki&nbsp;</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Płytka testowa Costa, 96 dołków z przezroczystym płaskim dnem nieobrobiona, bez pokrywki Polistyren</td><td>Corning Incorporated</td><td>REF. 3631</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Enterococcus faecalis KCTC 3206</td><td>Koreańska kolekcja do hodowli typu</td><td>KCTC NR 3206</td><td>Fałszywa beztlenowa</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny - oprogramowanie dekstran</td><td>Sigma</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Harmony&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>verson 3.5</td></tr><tr><td>Luria-Bertani LB medium</td><td>Merck</td><td>VM743185 626&nbsp; 1.10285.5000</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2213-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount wodne medium montażowe</td><td>Sigma</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Operetka CLS System analizy o wysokiej zawartości</td><td>PerkinElmer</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>HH16000000 Peptone</td><td>Merck</td><td>EMD 1.07213.1000</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PA01</td><td>Koreańska kolekcja dla kultur typu</td><td>KCTC NR 1637</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon, Japonia</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF. 212750</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit caenorhabditis elegans

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

W organizmach żywych, nadmierna przepuszczalność jelit jest poważnym objawem, który prowadzi do wielu chorób zapalnych jelit (IBD). Caenorhabditis elegans to model zwierzęcy niebędący ssakiem, który jest szeroko stosowany jako system testowy ze względu na jego krótką żywotność, przejrzystość, opłacalność i brak problemów etycznych u zwierząt. W tym badaniu opracowano metodę badania wpływu różnych bakterii i 3,3'-diindolilometanu (DIM) na przepuszczalność jelit C. elegans za pomocą wysokoprzepustowego systemu analizy obrazu. Robaki zostały zakażone różnymi bakteriami jelitowymi lub były leczone jednocześnie DIM przez 48 godzin i karmione izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)-dekstranem przez noc. Następnie zbadano przepuszczalność jelit, porównując obrazy fluorescencji z intensywnością fluorescencji wewnątrz ciał robaków. Metoda ta może również mieć potencjał do identyfikacji probiotycznych i chorobotwórczych bakterii jelitowych, które wpływają na przepuszczalność jelit w modelu zwierzęcym i jest skuteczna w badaniu wpływu szkodliwych lub prozdrowotnych substancji chemicznych na przepuszczalność jelit i zdrowie jelit. Jednak protokół ten ma również pewne znaczne ograniczenia na poziomie genetycznym, zwłaszcza w przypadku określania, które geny są zmieniane w celu kontrolowania choroby, ponieważ metoda ta jest najczęściej stosowana do określania fenotypu. Ponadto metoda ta ogranicza się do dokładnego określenia, które patogenne substraty wywołują stan zapalny lub zwiększają przepuszczalność jelit robaków podczas infekcji. Dlatego konieczne są dalsze dogłębne badania, w tym badanie molekularnego mechanizmu genetycznego z wykorzystaniem zmutowanych bakterii i nicieni, a także analiza składników chemicznych bakterii, aby w pełni ocenić funkcję bakterii i substancji chemicznych w określaniu przepuszczalności jelit.

Po inkubacji z P. aeruginosa PAO1 u C. elegans odnotowano istotny wzrost fluorescencji FITC-dekstranu w ciele nicieni w porównaniu z fluorescencją obserwowaną po inkubacji z dwoma pozostałymi szczepami bakteryjnymi (Rycina 1). Intensywności fluorescencji nicieni karmionych E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 oraz E. faecalis KCTC3206 wynosiły odpowiednio 100,0 ± 6,6%, 369,7 ± 38,9% i 105,6 ± 10,6%. Dane te wskazują, że P. aeruginosa spowodow...

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Metoda ta będzie pomocna w podstawowych badaniach biologicznych związanych z interakcją między mikrobiotą jelitową a zdrowiem jelit. Ponadto protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych potencjalnych probiotyków i nutraceutyków w celu leczenia problemów zdrowotnych jelit, takich jak zespół nieszczelnego jelita i choroby zapalne jelit. Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustowy system obrazowania, aby umożliwić szybką i precyzyjną analizę ilościową przepuszczalności jelit u C. elegans traktowanych różnymi bakteriami i chemikaliami.Zalecamy, aby naukowiec, który nie jest zaznajomiony z tą techniką, ograniczył liczbę próbek, aby uniknąć błędnego etykietowania i innych błędów. Procedura ta składa się z wielu kroków, które wymagają wizualnej demonstracji, takich jak przenoszenie robaków na płytki 96-dołkowe i korzystanie z maszyny Operett, a także oprogramowania Harmony. Zacznij od przygotowania 500 mililitrów sterylnego podłoża LB.Zaszczepić pojedynczą kolonię P.aeruginosa w pożywce i inkubować kulturę przez 14 do 15 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 150 obr./min. Następnego dnia równomiernie rozprowadź kulturę bakteryjną w dwóch 500-mililitrowych probówkach i odwiruj je w temperaturze 3 220 g i czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Usuń supernatant, pozostawiając 25 mililitrów w każdej probówce, aby uzyskać całkowitą pozostałą objętość 50 mililitrów, a następnie ponownie zawieś osad bakteryjny.Przechowuj kulturę bakteryjną w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia. Aby przetestować wpływ bakterii na przepuszczalność jelit C.elegans, wyjmij kultury z lodówki i dokładnie je zwiruj. Dodaj łącznie 800 mikrolitrów do każdej świeżej płytki NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc.Aby przygotować płytki DIM, dodaj 50 mililitrów pożywki agarowej NGM do butelki DIM zawierającej bulion NGM i dokładnie wymieszaj. Następnie wlej 20 mililitrów pożywki do każdej szalki Petriego o wymiarach 90 na 15 milimetrów. Przygotuj płytki DMSO, dodając 20 mililitrów pożywki DMSO zawierającej NGM do każdej szalki Petriego i pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na co najmniej trzy godziny do zestalenia.Rozprowadź 800 mikrolitrów wirowej kultury E. coli lub P.aeruginosa na każdej świeżej płytce NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza na noc. Umyj zsynchronizowane z wiekiem larwy L4 buforem S i przenieś około 500 robaków na płytki NGM zawierające różne bakterie i chemikalia. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Przygotować płytki uzupełnione dekstranem FITC, mieszając dwa mililitry inaktywowanej termicznie E. coli z czterema miligramami dekstranu FITC. Dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny do każdej z 20 świeżych płytek agarowych NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia na godzinę na czystej ławce laboratoryjnej. Po 48 godzinach od poddania działaniu należy przemyć robaki buforem S, przenieść je na płytki z dodatkiem dekstranu FITC oraz na płytki NGM bez dekstranu FITC i inkubować płytki przez noc.Następnego dnia umyj robaki buforem S i pozwól im czołgać się w świeżej płytce agarowej NGM przez godzinę. Dodaj 50 mikrolitrów 4% formaldehydu do każdej studzienki czarnej, 96-dołkowej płytki o płaskim dnie i przenieś około 50 robaków do każdej studzienki. Po jednej do dwóch minut usuń cały formaldehyd i dodaj 100 mikrolitrów podłoża montażowego do każdej studzienki.Formaldehyd jest toksyczną substancją chemiczną i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Aby uchwycić obrazy fluorescencyjne, naciśnij ikonę otwartej pokrywy w oprogramowaniu do obrazowania i włóż płytkę do urządzenia. Kliknij przycisk Setup(Konfiguracja), wybierz typ płyty i dodaj kanały brightfield i EGFP.Aby dostosować układ, przejdź do wyboru Układ i wybierz opcję Ścieżka. Ustaw pierwszy obrazek na jednym mikrometrze, liczbę płaszczyzn na 10, a odległość na jeden mikrometr. Wybierz jedną ze studzienek uzdatniania i jedno pole przechwytywania, a następnie naciśnij przycisk Test w sekcji Uruchom eksperyment.Jeśli obrazy są zadowalające, wróć do sekcji Setup (Konfiguracja) i naciśnij ikonę Reset (Resetuj). Następnie należy zaznaczyć wszystkie studnie docelowe i odpowiednią liczbę pól przechwytywania. Przejdź do pozycji Uruchom eksperyment, wprowadź nazwę tabliczki i naciśnij przycisk Start.Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, przejdź do sekcji Analiza obrazu, wprowadź obraz i znajdź komórkę, wybierając kanał EGFP i metodę B. Dostosuj parametry zgodnie ze wskazówkami rękopisu i wybierz średnią jako dane wyjściowe. Naciśnij ikonę Zastosuj, aby zapisać konfigurację. Uzyskaj mapę cieplną i tabelę danych, przechodząc do sekcji Ocena i dostosuj parametr odczytu, a następnie rozpocznij ocenę.C. elegans wykazał znaczny wzrost fluorescencji FITC-dekstranu po inkubacji z P.aeruginosa w porównaniu z pozostałymi dwoma szczepami bakteryjnymi, co wskazuje, że P.aeruginosa powodował bardziej istotne uszkodzenia bariery jelitowej nabłonka i zwiększoną przepuszczalność jelit. Żywy i inaktywowany termicznie P.aeruginosa wywołał bardzo różny wpływ na przepuszczalność jelit u C. elegans. Po inaktywacji cieplnej zarówno obrazy fluorescencyjne, jak i dane statystyczne wskazują, że P.aeruginosa nie wywoływała żadnej toksyczności dla nicieni.48-godzinne leczenie równoczesne DIM znacznie zmniejszyło intensywność fluorescencji FITC-dekstranu w jelitach robaków narażonych na P.aeruginosa, co pokazuje, że DIM można uznać za dobry naturalny produkt do leczenia dysfunkcji przepuszczalności jelit spowodowanej infekcjami bakteryjnymi. Ważne jest, aby pamiętać, że podczas przygotowywania płytek pokrytych dstrandem FITC należy zminimalizować ekspozycję na światło ze względu na wrażliwość na światło dekstranu FITC. Technika ta może być wykorzystana do określenia patogennego i probiotycznego działania bakterii jelitowych i ich aktywnych składników poprzez badanie bakterii, a także ich składu chemicznego.

measuring-effects-bacteria-chemicals-on-intestinal-permeability

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film przedstawia metodę wizualizacji i pomiaru integralności światła jelita C. elegans poprzez karmienie robaków dekstranem znakowanym FITC. Przykładowy protokół pokazuje test wykonany na robakach 3,3'-diindolilometanu (DIM) i karmionych patogenami.

Karmienie FITC-dekstranem: metoda ilościowego określania przepuszczalności jelit u C. elegans

Źródło: Anderson, Q. L., et al. Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)Film przedstawia test na bazie cieczy, w którym genetycznie zmodyfikowane larwy C. elegans są narażone na działanie bakterii chorobotwórczych na mikropłytce. Toksyny bakteryjne wydzielane do pożywki wywołują stres i śmierć gospodarza. Barwnik fluorescencyjny barwi martwe robaki, umożliwiając ilościowe określenie śmiertelności na podstawie obrazowania w celu oceny...

Ocena śmiertelności larw C. elegans wywołanej przez bakterie chorobotwórcze

Źródło: Taylor, M. N., et.al. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje narażenie wolnych od zarazków, dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans na szczep bakteryjny w celu kolonizacji jelit. Wyjaśnia selektywne usuwanie nieprzylegających i zewnętrznych bakterii, pozostawiając tylko żywe bakterie przylegające do nabłonka jelitowego w celu...

Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Źródło: Le, T. A. N., i in., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Jelit of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji mającycy na celu ilościową przepuszczalność jelit u osób C. elegans, które były narażone na Pseudomonas aeruginosa. W porównaniu z kontrolami karmionymi Escherichia coli, robaki poddane patogenom wykazują zwiększoną przeciekliwość fluoroforu do jamy ciała, co wskazuje na uszkodzenie bariery nabłonkowej.

Ocena przepuszczalności jelit u C. elegans po ekspozycji na bakterie

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Opisany jest podstawowy protokół oceny toksyczności substancji chemicznych u zwierzęcia modelowego, Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest wygodna i przydatna przy opracowywaniu farmaceutyków, a także przy ocenie ryzyka związanego z różnymi zanieczyszczeniami środowiska.

Pomiar wpływu substancji chemicznych na wzrost i rozmnażanie Caenorhabditis elegans

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj metodę pomiaru przepuszczalności jelit u Caenorhabditis elegans w badaniach mikrobioty jelitowej. Protokół umożliwia szybką analizę wpływu bakterii i substancji chemicznych na zdrowie jelit oraz identyfikację potencjalnych probiotyków.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów