Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Metoda ta będzie pomocna w podstawowych badaniach biologicznych związanych z interakcją między mikrobiotą jelitową a zdrowiem jelit. Ponadto protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych potencjalnych probiotyków i nutraceutyków w celu leczenia problemów zdrowotnych jelit, takich jak zespół nieszczelnego jelita i choroby zapalne jelit. Protokół ten wykorzystuje wysokoprzepustowy system obrazowania, aby umożliwić szybką i precyzyjną analizę ilościową przepuszczalności jelit u C. elegans traktowanych różnymi bakteriami i chemikaliami.

Zalecamy, aby naukowiec, który nie jest zaznajomiony z tą techniką, ograniczył liczbę próbek, aby uniknąć błędnego etykietowania i innych błędów. Procedura ta składa się z wielu kroków, które wymagają wizualnej demonstracji, takich jak przenoszenie robaków na płytki 96-dołkowe i korzystanie z maszyny Operett, a także oprogramowania Harmony. Zacznij od przygotowania 500 mililitrów sterylnego podłoża LB.

Zaszczepić pojedynczą kolonię P.aeruginosa w pożywce i inkubować kulturę przez 14 do 15 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 150 obr./min. Następnego dnia równomiernie rozprowadź kulturę bakteryjną w dwóch 500-mililitrowych probówkach i odwiruj je w temperaturze 3 220 g i czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Usuń supernatant, pozostawiając 25 mililitrów w każdej probówce, aby uzyskać całkowitą pozostałą objętość 50 mililitrów, a następnie ponownie zawieś osad bakteryjny.

Przechowuj kulturę bakteryjną w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia. Aby przetestować wpływ bakterii na przepuszczalność jelit C.elegans, wyjmij kultury z lodówki i dokładnie je zwiruj. Dodaj łącznie 800 mikrolitrów do każdej świeżej płytki NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc.

Aby przygotować płytki DIM, dodaj 50 mililitrów pożywki agarowej NGM do butelki DIM zawierającej bulion NGM i dokładnie wymieszaj. Następnie wlej 20 mililitrów pożywki do każdej szalki Petriego o wymiarach 90 na 15 milimetrów. Przygotuj płytki DMSO, dodając 20 mililitrów pożywki DMSO zawierającej NGM do każdej szalki Petriego i pozostaw płytki w temperaturze pokojowej na co najmniej trzy godziny do zestalenia.

Rozprowadź 800 mikrolitrów wirowej kultury E. coli lub P.aeruginosa na każdej świeżej płytce NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza na noc. Umyj zsynchronizowane z wiekiem larwy L4 buforem S i przenieś około 500 robaków na płytki NGM zawierające różne bakterie i chemikalia. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Przygotować płytki uzupełnione dekstranem FITC, mieszając dwa mililitry inaktywowanej termicznie E. coli z czterema miligramami dekstranu FITC. Dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny do każdej z 20 świeżych płytek agarowych NGM i pozostaw płytki do wyschnięcia na godzinę na czystej ławce laboratoryjnej. Po 48 godzinach od poddania działaniu należy przemyć robaki buforem S, przenieść je na płytki z dodatkiem dekstranu FITC oraz na płytki NGM bez dekstranu FITC i inkubować płytki przez noc.

Następnego dnia umyj robaki buforem S i pozwól im czołgać się w świeżej płytce agarowej NGM przez godzinę. Dodaj 50 mikrolitrów 4% formaldehydu do każdej studzienki czarnej, 96-dołkowej płytki o płaskim dnie i przenieś około 50 robaków do każdej studzienki. Po jednej do dwóch minut usuń cały formaldehyd i dodaj 100 mikrolitrów podłoża montażowego do każdej studzienki.

Formaldehyd jest toksyczną substancją chemiczną i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Aby uchwycić obrazy fluorescencyjne, naciśnij ikonę otwartej pokrywy w oprogramowaniu do obrazowania i włóż płytkę do urządzenia. Kliknij przycisk Setup(Konfiguracja), wybierz typ płyty i dodaj kanały brightfield i EGFP.

Aby dostosować układ, przejdź do wyboru Układ i wybierz opcję Ścieżka. Ustaw pierwszy obrazek na jednym mikrometrze, liczbę płaszczyzn na 10, a odległość na jeden mikrometr. Wybierz jedną ze studzienek uzdatniania i jedno pole przechwytywania, a następnie naciśnij przycisk Test w sekcji Uruchom eksperyment.

Jeśli obrazy są zadowalające, wróć do sekcji Setup (Konfiguracja) i naciśnij ikonę Reset (Resetuj). Następnie należy zaznaczyć wszystkie studnie docelowe i odpowiednią liczbę pól przechwytywania. Przejdź do pozycji Uruchom eksperyment, wprowadź nazwę tabliczki i naciśnij przycisk Start.

Aby zmierzyć intensywność fluorescencji, przejdź do sekcji Analiza obrazu, wprowadź obraz i znajdź komórkę, wybierając kanał EGFP i metodę B. Dostosuj parametry zgodnie ze wskazówkami rękopisu i wybierz średnią jako dane wyjściowe. Naciśnij ikonę Zastosuj, aby zapisać konfigurację. Uzyskaj mapę cieplną i tabelę danych, przechodząc do sekcji Ocena i dostosuj parametr odczytu, a następnie rozpocznij ocenę.

C. elegans wykazał znaczny wzrost fluorescencji FITC-dekstranu po inkubacji z P.aeruginosa w porównaniu z pozostałymi dwoma szczepami bakteryjnymi, co wskazuje, że P.aeruginosa powodował bardziej istotne uszkodzenia bariery jelitowej nabłonka i zwiększoną przepuszczalność jelit. Żywy i inaktywowany termicznie P.aeruginosa wywołał bardzo różny wpływ na przepuszczalność jelit u C. elegans. Po inaktywacji cieplnej zarówno obrazy fluorescencyjne, jak i dane statystyczne wskazują, że P.aeruginosa nie wywoływała żadnej toksyczności dla nicieni.

48-godzinne leczenie równoczesne DIM znacznie zmniejszyło intensywność fluorescencji FITC-dekstranu w jelitach robaków narażonych na P.aeruginosa, co pokazuje, że DIM można uznać za dobry naturalny produkt do leczenia dysfunkcji przepuszczalności jelit spowodowanej infekcjami bakteryjnymi. Ważne jest, aby pamiętać, że podczas przygotowywania płytek pokrytych dstrandem FITC należy zminimalizować ekspozycję na światło ze względu na wrażliwość na światło dekstranu FITC. Technika ta może być wykorzystana do określenia patogennego i probiotycznego działania bakterii jelitowych i ich aktywnych składników poprzez badanie bakterii, a także ich składu chemicznego.