Name: Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metody identyfikacji sekwencji SSHHPS w wirusach grupy IV przy użyciu analizy in vitro i in silico. Proteazy wirusowe rozkładają białka gospodarza uczestniczące w odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekty Agencji Redukcji Zagrożeń Obronnych (DTRA) o numerach CB-SEED-SEED09-2-0061 i CBCall4-CBM-05-2-0019, a częściowo przez program badawczy Intramural/Extramural NCATS, NIH (XH) i Naval Research Laboratory.

Wyrażone tutaj opinie są opiniami autorów i nie reprezentują opinii Marynarki Wojennej Stanów Zjednoczonych, Armii Stanów Zjednoczonych, Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych ani rządu Stanów Zjednoczonych.

Specyficzne dla sekwencji niszczenie białka lub kwasu nukleinowego kierowane przez obcą sekwencję obserwuje się tylko w kilku przypadkach w biologii. Mechanizmy pokazane na rysunku 1 są mechanizmami obronnymi, które chronią gospodarza przed wirusem lub wirusa przed gospodarzem.
Za pomocą metod bioinformatycznych możemy zidentyfikować cele, które są niszczone przez te systemy. W naszych analizach sekwencji SSHHP odkryliśmy, że wiele z nich można znaleźć w białkach potrzebnych do generowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Niektóre z nich miały oczywiste role, takie jak MAVS i TRIF (interferon-β indukujący adaptację zawierającą domenę TIR), podczas gdy inne były związane z odpornością poprzez bardziej złożone mechanizmy (np. Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Informacje docelowe przechowywane w sekwencji SSHHP mogą potencjalnie zidentyfikować szlaki, które mają działanie przeciwwirusowe przeciwko tym wirusom. Odpowiedzi przeciwwirusowe in vivo są często specyficzne dla wirusa26,43. Na przykład podzbiory białek TRIM mają działanie przeciwwirusowe na różne wirusy 43,44,45, niektóre są wirusowymi czynnikami restrykcyjnymi (np. HIV i TRIM5α). Specyficzność białek TRIM (zidentyfikowano ~70) jest nadal badana44,45. Informacje zawarte w SSHHPS mogą przyczynić się do zrozumienia, w jaki sposób wirusy te unikają wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Inne wzorce i korelacje mogą zostać odkryte w miarę badania większej liczby SSHHPS.
Różnice specyficzne dla poszczególnych gatunków były widoczne w naszych analizach (Ryc. 2, Ryc. 10). Wiadomo, że wirusy te atakują niektóre gatunki bardziej niż inne. Informacje o zakresie hostów, podatności hosta i obronie hosta mogą być obecne w SSHHPS. Na przykład koniowate, gatunek najbardziej podatny na wirusy zapalenia mózgu koni, nie miały regionu ludzkiego TRIM14, który został przejściowo przecięty przez proteazę VEEV nsP2. Ludzie rzadko umierają z powodu zakażeń wirusem VEEV, ale mogą być zakażeni24 razy. Ludzkie białko TRIM14 przenosiło sekwencję6 rozszczepienia proteazy nsP2. Obecność miejsca rozszczepienia sugeruje, że ludzie mają mechanizm obronny przed tymi wirusami. Uważa się, że ptaki są potencjalnymi rezerwuarami tych wirusów46. Odpowiednia sekwencja SSHHP w białku TRIM14 od kurcząt różniła się od sekwencji znalezionych u ludzi i innych gatunków. Subtelne różnice, takie jak te, mogą sprawić, że białko gospodarza docelowego będzie nierozszczepione lub łatwiej rozszczepione. Aguirre i wsp.16 wykazali, że nierozkurczone zmutowane białko STRING indukowało wyższe poziomy IFN po zakażeniu wirusem dengi i że myszy naturalnie przenoszą wersję STING, która nie jest cięta przez proteazę Denga ns2B3. Mysie białko STING nie zostało przecięte przez proteazę ZIKV47. W naszej analizie SSHHPS zaobserwowaliśmy również różnice w sekwencjach miejsc rozszczepienia proteazy ZIKV, gdy porównaliśmy białka ludzkie z białkami gryzoni6 (Figura 10D). Odtwarzanie specyficznych dla gatunku rozszczepień proteolitycznych białek gospodarza może być ważne w modelach zwierzęcych stosowanych w przypadku wirusów grupy IV. Hamowanie rozszczepienia białek gospodarza ma również wpływ na rozwój inhibitorów proteazy grupy IV. W naszej poprzedniej publikacji wykazaliśmy, że możemy hamować rozszczepienie TRIM14 przez proteazę VEEV nsP2 za pomocą estru metylowego CA0746. Wynik ten sugeruje, że małocząsteczkowe inhibitory tych proteaz mogą być w stanie modulować wrodzone odpowiedzi immunologiczne, które są zdolne do tłumienia infekcji 6,31.
Zmienność genetyczna w obrębie gatunku może również powodować różnice w rozszczepieniu proteolitycznym. Subtelne różnice w użyciu kodonów mogą wpływać na pauzę rybosomu48. Ponieważ niektóre proteazy wirusowe grupy IV są osadzone w błonie ER, różnice w tych przerwach mogą wpływać na rozszczepienie celu, jeśli rozszczepienie następuje równotranslacyjnie. Niektóre z miejsc rozszczepienia, które zidentyfikowaliśmy, znajdowały się w przewidywanych sekwencjach peptydów sygnałowych (np. SFRP1), podczas gdy inne były wewnętrzne.
Analiza SSHHPS może dostarczyć informacji, które różnią się od innych metod analizy białek gospodarza. Analiza SSHHPS była niedroga i łatwa do zastosowania. Zastosowanie bakteryjnego systemu ekspresji pozwoliło na przetestowanie krótkich odcinków (~25 aminokwasów) sekwencji ssaków bez użycia hodowli komórek ssaków. Odkryliśmy, że substraty CFP-YFP były w stanie tolerować wszystkie testowane sekwencje białek ludzkich; Jednak plony były różne. W podobnych testach substraty zawierające sekwencje białek ludzkich o długości aż 63 aminokwasów zostały z powodzeniem wyrażone, oczyszczone i wykorzystane do analiz kinetycznych i badań przesiewowych inhibitorów 49,50,51. Ponieważ do testu nieciągłego potrzebne są tylko niewielkie ilości substratu, można zbadać dużą liczbę celów. Jedną z zalet systemu jest to, że podłoża CFP/YFP mogą być używane do analiz SDS-PAGE oraz do bardziej skomplikowanych analiz kinetycznych (np. IC50, Ki, Km, Vmax). W celu odkrywania leków, związki hamujące mogą wytwarzać artefakty w testach fluorescencyjnych. Tak więc test nieciągły w połączeniu z testem ciągłym pozwala potwierdzić rozszczepienie lub zahamowanie rozszczepienia. Próbki do nieciągłego testu SDS-PAGE można pobrać bezpośrednio z płytek 96-dołkowych. Substraty CFP/YFP zostały wykorzystane do przesiewania bibliotek złożonych52. Wymagane są jednak dodatkowe analizy w celu określenia, czy podłoże nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, takich jak obliczenie współczynnika Z53.
Jednym z wyzwań związanych z projektowaniem podłoża jest zidentyfikowanie obszaru wokół wiązania nożycowego, który jest związany i rozpoznawany przez proteazę. W przedstawionych tutaj przykładach zaczęliśmy od 12 sekwencji reszt, które były wyśrodkowane wokół wiązania nożycowego. Po przeanalizowaniu dopasowań sekwencji miejsc cięcia stwierdzono homologię do reszt N-końcowych wiązania nożycowego dla proteazy VEEV, natomiast dla proteazy ZIKV stwierdzono homologię do kilku reszt C-końcowych. Model in silico zadokowanego podłoża można wykorzystać do zaprojektowania eksperymentów mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, które badają miejsca wiązania substratu. Ponieważ substrat i sekwencje enzymów znajdują się na plazmidach, mogą być mutowane w celu przetestowania modeli in silico lub tolerancji podmiejsc. Może to być korzystne, jeśli struktura krystaliczna związanego podłoża (substratów) nie jest dostępna.
Analiza SSHHPS może również dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów, za pomocą których fenotypy wywołane przez wirusa są wytwarzane przez enzymy wirusowe. Jeden z celów ZIKV, SFRP1, jest częścią szlaku sygnałowego Wnt i odgrywa rolę zarówno w rozwoju mózgu i oczu, jak i w odpowiedziach immunologicznych 36,37,54,55,56,57. Odkryliśmy, że inne sekwencje białek, które mogą być cięte przez proteazę ZIKV ns2B / ns3, również znajdowały się w białkach zaangażowanych w rozwój mózgu i oczu; Nieprawidłowości w obu przypadkach zaobserwowano we wrodzonym zespole Zika i uważa się, że są one częścią fenotypu58 wywołanego przez wirusa.
Przewidywalność interakcji gospodarz-patogen może być wykorzystana do różnych zastosowań: specyficzne dla celu terapie wirusem onkolitycznym; zmniejszanie ryzyka związanego ze szczepionkami zawierającymi żywe wirusy; udoskonalanie, przewidywanie lub selekcja modeli zwierzęcych; przewidywanie zasięgu żywiciela lub podatności; przewidywanie zdarzeń odzwierzęcych; i przewidywanie obrony gospodarza. Ponieważ opisane metody są oparte na sekwencjach, mogą być przydatne do włączenia do oprogramowania w przyszłości.

Dowody poziomego transferu genów z wirusa na gospodarza lub z gospodarza na wirusa można znaleźć w różnych genomach1,2,3,4. Przykładami endogenizacji wirusowej są sekwencje dystansowe CRISPR znajdujące się w genomach bakteryjnych gospodarzy4. Ostatnio znaleźliśmy dowody na sekwencje białek gospodarza osadzone w niestrukturalnych poliproteinach wirusów grupy IV (+)ssRNA. Sekwencje te w regionach kodujących genomu wirusa mogą być rozmnażane pokoleniowo. Krótkie odcinki homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) znajdują się w wirusie i gospodarzu5,6. SSHHPS to konserwatywne sekwencje motywów miejsca rozszczepienia rozpoznawane przez proteazy wirusowe, które mają homologię do określonych białek gospodarza. Sekwencje te kierują niszczeniem określonych białek gospodarza.
W naszej poprzedniej publikacji6, sporządziliśmy listę wszystkich białek gospodarza, które były celem proteaz wirusowych i stwierdziliśmy, że lista celów była nielosowa (Tabela 1). Widoczne były dwie tendencje. Po pierwsze, większość proteaz wirusowych, które przecinały białka gospodarza, należała do wirusów grupy IV (24 z 25 przypadków dotyczyły proteaz wirusowych grupy IV), a jedna proteaza należała do retrowirusów grupy VI (HIV, ludzki wirus niedoboru odporności)7. Po drugie, cele białkowe gospodarza cięte przez proteazy wirusowe były na ogół zaangażowane w generowanie wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, co sugeruje, że rozszczepienia miały na celu zantagonizowanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Połowa białek gospodarza, na które ukierunkowane są proteazy wirusowe, była znanymi składnikami kaskad sygnałowych, które generują interferon (IFN) i cytokiny prozapalne (Tabela 1). Inni byli zaangażowani w transkrypcję komórek gospodarza8,9,10 lub translation11. Co ciekawe, Shmakov et al.4 wykazali, że wiele sekwencji protospacerowych CRISPR odpowiada genom zaangażowanym w koniugację lub replikację plazmidu4.
Grupa IV obejmuje między innymi Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae i Togaviridae. Kilka nowych i pojawiających się patogenów należy do grupy IV, takich jak wirus Zika (ZIKV), Zachodni Nil (WNV), Chikungunya (CHIKV), wirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (SARS) i wirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS). Genom (+)ssRNA jest zasadniczo fragmentem mRNA. Aby wytworzyć enzymy niezbędne do replikacji genomu, genom (+)ssRNA musi najpierw zostać poddany translacji. W alfawirusach i innych wirusach grupy IV enzymy niezbędne do replikacji są wytwarzane w pojedynczej poliproteinie (tj. nsP1234 dla VEEV). Niestrukturalna poliproteina (nsP) jest proteolitycznie przetwarzana (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) przez proteazę nsP2 w celu wytworzenia aktywnych enzymów12 (Figura 1). Rozszczepienie poliproteiny przez proteazę nsP2 jest niezbędne do replikacji wirusa; Wykazano to poprzez delecję i mutagenezę ukierunkowaną na miejsce aktywne cysteiny miejsca aktywnego proteazy nsP213,14. Warto zauważyć, że translacja białek wirusowych poprzedza zdarzenia replikacji genomu. Na przykład nsP4 zawiera zależną od RNA polimerazę RNA potrzebną do replikacji genomu (+)ssRNA. Replikacja genomu może wytwarzać produkty pośrednie dsRNA; Te produkty pośrednie mogą wyzwalać wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza. W związku z tym wirusy te mogą rozszczepiać białka wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wczesnym etapie infekcji, aby stłumić ich działanie15,16,17.
Wyciszenie może wystąpić na poziomie DNA, RNA i białka. Wspólną cechą każdego z mechanizmów wyciszania pokazanych na rysunku 1 jest to, że krótkie obce sekwencje DNA, RNA lub białka są wykorzystywane do kierowania niszczeniem określonych celów, aby zantagonizować ich funkcję. Mechanizmy wyciszania są analogiczne do programów typu "wyszukaj i usuń", które zostały napisane w trzech różnych językach. Krótka sekwencja miejsca rozszczepienia jest analogiczna do "słowa kluczowego". Każdy program ma enzym, który rozpoznaje dopasowanie między krótką sekwencją ("słowem kluczowym") a słowem w "pliku", który ma zostać usunięty. Po znalezieniu dopasowania enzym tnie ("usuwa") większą sekwencję docelową. Trzy mechanizmy pokazane na rysunku 1 są wykorzystywane do obrony gospodarza przed wirusami lub do obrony wirusa przed układem odpornościowym gospodarza.
Proteazy wirusowe rozpoznają krótkie sekwencje motywów miejsca cięcia między ~2-11 aminokwasami; w nukleotydach odpowiada to 6-33 zasadom. Dla porównania, sekwencje dystansowe CRISPR to ~26-72 nukleotydy, a RNAi to ~20-22 nukleotydy18,19. Chociaż sekwencje te są stosunkowo krótkie, można je rozpoznać w specyficzny sposób. Biorąc pod uwagę większą różnorodność aminokwasów, prawdopodobieństwo losowego rozszczepienia jest stosunkowo niskie w przypadku proteazy wirusowej rozpoznającej sekwencje białek składające się z 6-8 aminokwasów lub dłuższych. Przewidywanie SSHHPS w białkach gospodarza będzie w dużej mierze zależało od specyficzności badanej proteazy wirusowej. Jeśli proteaza ma ścisłe wymagania dotyczące specyficzności sekwencji, szansa na znalezienie sekwencji miejsca rozszczepienia wynosi 1/206 = 1 na 64 miliony lub 1/208 = 1 na 25,6 miliarda; jednak większość proteaz ma zmienne tolerancje podmiejsc (np. R lub K mogą być tolerowane w miejscu S1). W związku z tym nie ma wymogu identyczności sekwencji między sekwencjami znajdującymi się w gospodarzu a wirusem. W przypadku proteaz wirusowych, które mają luźniejsze wymagania dotyczące sekwencji (takich jak te należące do Picornaviridae), prawdopodobieństwo znalezienia miejsca rozszczepienia w białku gospodarza może być wyższe. Wiele pozycji w tabeli 1 pochodzi z rodziny Picornaviridae.
Notacja Schechtera i Bergera20 jest powszechnie używana do opisania reszt w substracie proteazy i podmiejsc, z którymi się wiążą, używamy tego zapisu w całym tekście. Reszty w podłożu, które są N-końcem wiązania nożycowego, są oznaczone jako P3-P2-P1, podczas gdy te, które są C-końcowe, są oznaczone jako P1'-P2'-P3'. Odpowiednie podmiejsca w proteazie, które wiążą te reszty aminokwasowe, to odpowiednio S3-S2-S1 i S1'-S2'-S3'.
Aby określić, które białka gospodarza są celem ataku, możemy zidentyfikować SSHHPS w miejscach cięcia poliprotein wirusa i poszukać białek gospodarza, które je zawierają. W niniejszym artykule przedstawiamy procedury identyfikacji SSHHPS przy użyciu znanych sekwencji miejsca cięcia proteazy wirusowej. Opisane metody bioinformatyczne, testy proteazy i metody in silico są przeznaczone do stosowania w połączeniu z testami komórkowymi.
Dopasowanie sekwencji białek gospodarza, do których dążą proteazy wirusowe, ujawniło specyficzne dla gatunku różnice w tych krótkich sekwencjach miejsc rozszczepienia. Na przykład odkryto, że proteaza nsP2 wirusa wenezuelskiego zapalenia mózgu koni (VEEV) przecina ludzki TRIM14, białko z motywem trójdzielnym (TRIM)6. Niektóre białka TRIM są czynnikami restrykcyjnymi wirusa (np. TRIM5α21), większość z nich uważa się za ligazy ubikwityny E3. TRIM14 nie ma domeny RING (naprawdę interesujący nowy gen) i nie jest uważany za klasę ligazy E3<sup="xref">22. Zaproponowano, że TRIM14 jest adaptorem w mitochondrialnym przeciwwirusowym signalosomie (MAVS)22, ale może mieć inne funkcje przeciwwirusowe23. Wyrównanie sekwencji TRIM14 z różnych gatunków pokazuje, że konie nie mają miejsca rozszczepienia i mają okrojoną wersję TRIM14, w której brakuje C-końcowej domeny PRY/PRY. W tej domenie znajduje się miejsce poliubikwitynacji (ryc. 2). U koni wirusy te są wysoce śmiertelne (~20-80% śmiertelności), podczas gdy u ludzi tylko ~1% umiera z powodu infekcji VEEV24. Rozszczepienie domeny PRY/SPRY może przejściowo spowodować zwarcie kaskady sygnalizacyjnej MAVS. Kaskada ta może być wywoływana przez dsRNA i prowadzi do produkcji interferonu i cytokin prozapalnych. W związku z tym obecność SSHHPS może być przydatna do przewidywania, które gatunki mają systemy obronne przeciwko określonym wirusom grupy IV.
W wirusach grupy IV mechanizmy antagonizmu IFN są uważane za wielokrotnie zbędne25. Rozszczepienie białka gospodarza może być przejściowe podczas infekcji, a stężenia mogą z czasem powrócić. Odkryliśmy w komórkach, że produkty rozszczepienia TRIM14 można wykryć bardzo wcześnie po transfekcji (6 godzin) z plazmidem kodującym proteazę (promotor wirusa cytomegalii). Jednak w dłuższych okresach nie wykryto produktów rozszczepienia. W komórkach zakażonych wirusem kinetyka była inna, a produkty rozszczepienia można było wykryć w zakresie 6-48 h6. Inni zgłaszali pojawienie się produktów rozszczepienia białka gospodarza już po 3-6 godzinach od zakażenia9,11.
Aktywność proteolityczna w komórkach jest często trudna do wychwycenia; produkty rozszczepienia mogą różnić się rozpuszczalnością, stężeniem, stabilnością i żywotnością. W testach komórkowych nie można zakładać, że produkty rozszczepienia będą się gromadzić w komórce lub że intensywność pasm białka ciętego i nieciętego będzie wykazywać kompensacyjne wzrosty i spadki, ponieważ cięte białko może ulec bardzo szybkiej degradacji i może nie być wykrywalne w Western blot przy oczekiwanej masie cząsteczkowej (MW) (np. Region zawierający epitop może zostać rozszczepiony przez inne proteazy gospodarza lub może być ubikwitynowany). Jeśli substratem proteazy wirusowej jest białko wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, jego stężenie może się zmieniać podczas infekcji. Na przykład, niektóre białka wrodzonej odpowiedzi immunologicznej są obecne przed infekcją wirusową i są dalej indukowane przez interferon26. Stężenie białka docelowego może zatem ulegać wahaniom podczas infekcji, a porównanie lizatów komórkowych niezakażonych i zakażonych może być trudne do zinterpretowania. Ponadto nie wszystkie komórki mogą być jednakowo transfekowane lub zakażone. Z drugiej strony, testy proteazy in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych białek E. coli mają mniej zmiennych, które można kontrolować, a takie testy można wykonać przy użyciu SDS-PAGE zamiast immunoblotów. Zanieczyszczające proteazy mogą być zahamowane we wczesnych etapach oczyszczania białka z substratu CFP/YFP, a zmutowane proteazy wirusowe mogą być oczyszczane i testowane jako kontrola w celu ustalenia, czy rozszczepienie jest spowodowane proteazą wirusową, czy zanieczyszczającą proteazą bakteryjną.
Jednym z ograniczeń testów proteaz in vitro jest to, że nie są one tak skomplikowane jak komórki ssaków. Aby enzym mógł przeciąć swój substrat, oba muszą być zlokalizowane razem. Proteazy wirusowe grupy IV różnią się budową i lokalizacją. Na przykład proteaza ZIKV jest osadzona w błonie retikulum endoplazmatycznego (ER) i skierowana w stronę cytozolu, podczas gdy proteaza VEEV nsP2 jest rozpuszczalnym białkiem w cytoplazmie i jądrze27. Niektóre sekwencje miejsc rozszczepienia znalezione w analizie ZIKV SSHHPS znajdowały się w peptydach sygnałowych, co sugeruje, że rozszczepienie może zachodzić jednocześnie w przypadku niektórych celów. W związku z tym w tych analizach należy również wziąć pod uwagę lokalizację proteazy i substratu w komórce.
Testy oparte na komórkach mogą być cenne dla ustalenia roli zidentyfikowanego białka (białek) gospodarza w infekcji. Metody, które mają na celu zatrzymanie rozszczepienia proteazy wirusowej w białkach gospodarza, takie jak dodanie inhibitora proteazy6 lub mutacja w docelowym 16, mogą być wykorzystane do zbadania ich wpływu na replikację wirusa. Nadekspresja docelowego białka może również wpływać na replikację wirusa28. Do ilościowego określenia replikacji wirusa można zastosować testy płytki nazębnej lub inne metody.

<table><tbody><tr><td>Kolba Erlenmeyera 250 ml</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>125472500</td><td>Niebezpieczeństwo: Silnie toksyczny. Otwórz butelkę w kapturze, aby uniknąć wdychania oparów.</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera o pojemności 4 l z szeroką szyjką Pyrex z nakrętką</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS49954L-1EA</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Prime Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0729-01</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna AKTA XK 16/20</td><td>GE Healthcare</td><td>28988937</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td> <td>odśrodkowy Amicon Ultra-15Millipore Sigma</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Niebezpieczeństwo: Reakcje alergiczne (skórne lub oddechowe).</td></tr><tr><td>Chelatowanie sefarozy Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0575-02</td><td>Po zrównoważeniu żywicy z 0,2 M siarczanem niklu w tekście określa się ją mianem kolumny niklowej. Kolumna będzie miała zielony kolor po umyciu wodą. Kolumna będzie miała niebieski kolor po zrównoważeniu z buforem.</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>RPI</td><td>C61000</td><td>Niebezpieczeństwo: Może powodować raka.</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Corning 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Sugestia: Probówki polipropylenowe są mniej podatne na pękanie podczas sonikacji niż rurki polietylenowe</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Półpłytka powierzchniowa, niewiążąca powierzchnia</td><td>Corning</td><td>3993</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy do rurek do dializy</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa kolumna odsalająca PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>RPI</td><td>D11000-50.0</td><td>Ostrzeżenie: Ostra toksyczność pokarmowa; działanie drażniące na skórę i oczy</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics (Fisher)</td><td>15892-0010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Acros Organics</td><td>301870010</td><td>Niebezpieczeństwo: Toksyczny, drażniący</td></tr><tr><td>IPTG (Izopropyl &beta;-D-tiogalaktopiranozyd)</td><td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td><td>420291</td><td>Nie wdychać pyłu. Unikać kontaktu z oczami i skórą.</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemmli</td><td>BIO-RAD</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Agar</td><td>Fluka (Millipore Sigma)</td><td>L3027-1KG</td><td>Sugestia: Autoklaw z mieszadłem magnetycznym w cieczy i mieszanie podczas chłodzenia. Poczekaj z dodaniem antybiotyku, aż będziesz mógł trzymać ręce na butelce bez bólu przez 30 sekund.</td></tr><tr><td>Luria Bertani Media</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L4919-5g</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Pionowa elektroforeza CellGel Box</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge Szybkoobrotowe probówki wirówkowe</td><td>PPCO Nalgene (Thermo Scientific)</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>M1335</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny siarczan niklu (krystaliczny / certyfikowany ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>N73-500</td><td>Niebezpieczeństwo: Szkodliwy po połknięciu lub wdychaniu działa drażniąco na skórę i oczy</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Kompetentny chemicznie E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C600003</td><td>Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia. Może powodować podrażnienie skóry i oczu u osób wrażliwych.</td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td><td>C606003</td><td>Może być szkodliwy w przypadku wdychania lub połknięcia. Może powodować podrażnienie skóry i oczu u osób wrażliwych.</td></tr><tr>Do komercyjnej syntezy DNA <td>użyto plazmidu pet15b DNA</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69661</td><td>GenScript Inc. Plazmid pet15b został użyty do substratów CFP/YFP.</td></tr><tr><td>pet32b</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>69016-3</td><td>Plazmid pet32b został użyty do budowy proteazy cysteinowej.</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Pierce Mini tabletki, wolne od EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32955</td><td>Ostrzeżenie: Działanie/drażniące skóry; uszkodzenie oczu</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Model M5</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji białek</td><td>Novagen (Millipore Sigma)</td><td>70584-4</td><td>BugBuster lub Bper (Katalog # 78248, ThermoFisher)</td></tr><tr><td>Q-Sepharose Fast Flow</td><td>G.E. Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Żywica anionowymienna</td></tr><tr><td>RunBlue (12%) 17-dołkowe żele PAGE</td><td>Expedeon</td><td>BCG01227</td><td>Można użyć dowolnego 12% prefabrykowanego żelu poliakrylamidowego</td></tr><tr><td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td><td>Expedeon</td><td>NXB50500</td><td>Rozcieńczyć 50 ml 950 ml wodą dejonizowaną, aby uzyskać 1x</td></tr><tr><td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td>Nie rozcieńczać, stosować zgodnie z zaleceniami</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td><td>Branson Ultrasonics (VWR)</td> <td>Model nr 101-063-346R</td><td>Sonikator był używany na poziomie 5</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td><td>Spectrum Labs</td><td>132645T</td><td>Rurki do dializy</td></tr><tr><td>SP-Sepharose Fast Flow</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>17-0729-01</td> Trombina z żywicy <td>kationowymiennej</td></tr><tr><td>z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>T6634-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Uwaga: Działa drażniąco na oczy/skórę</td></tr></tbody></table>

analiza wirusowych sshhps grupy iv przy użyciu metod in vitro i in silico

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Enzymy alfawirusowe są syntetyzowane w pojedynczym polipeptydzie. Niestrukturalna poliproteina (nsP) jest przetwarzana przez proteazę cysteinową nsP2 w celu wytworzenia aktywnych enzymów niezbędnych do replikacji wirusa. Proteazy wirusowe są wysoce specyficzne i rozpoznają konserwatywne sekwencje motywów miejsca cięcia (~6-8 aminokwasów). W kilku wirusach grupy IV sekwencje motywu motywu miejsca rozszczepienia proteazy nsP można znaleźć w specyficznych białkach gospodarza zaangażowanych w generowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, a w niektórych przypadkach docelowe białka wydają się być powiązane z fenotypem wywołanym przez wirusa. Wirusy te wykorzystują krótkie odcinki homologicznych sekwencji białek gospodarz-patogen (SSHHPS) do ukierunkowanego niszczenia białek gospodarza. Aby zidentyfikować SSHHPS, sekwencje motywu motywu miejsca rozszczepienia proteazy wirusowej można wprowadzić do BLAST i przeszukać genom (genomy) gospodarza. Rozszczepienie początkowo można przetestować przy użyciu oczyszczonej proteazy wirusowej nsP i substratów transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) wykonanych z E. coli. Substraty FRET zawierają cyjan i żółte białko fluorescencyjne oraz sekwencję miejsca rozszczepienia (sekwencja CFP-YFP). Ten test proteazy może być stosowany w sposób ciągły w czytniku płytek lub nienieprzerwanie w żelach SDS-PAGE. Modele związanych substratów peptydowych mogą być generowane in silico, aby pomóc w wyborze substratu i badaniach mutagenezy. Substraty CFP/YFP zostały również wykorzystane do identyfikacji inhibitorów proteazy. Te metody in vitro i in silico mogą być stosowane w połączeniu z testami komórkowymi w celu określenia, czy docelowe białko gospodarza wpływa na replikację wirusa.

Analiza SSHHPS proteazy ns2B/3 ZIKV zidentyfikowała 4 białkowe cele gospodarza: FOXG1, SFRP1, podjednostkę alfa Gs z biblioteki cDNA siatkówki oraz mitochondrialną nukleotydazę 5',3'- NT5M (Rysunek 10)6. Co istotne, żadna inna metoda nie przewidziała tych białek jako potencjalnych celów proteazy ZIKV. Mutacje w genie FOXG1 powiązano z zespołem wrodzonym charakteryzującym się zaburzeniami rozwoju i strukturalnymi nieprawidłowościami mózgu, takimi jak mikrocefalia. SFRP1 jest wydzielanym białkiem związanym z receptorem frizzled (SFRP); te rozpuszczalne receptory mogą konkurencyjnie wiązać ligandy Wnt, aby antagonizować i hamować sygnalizację Wnt. Szlak sygnalizacyjny Wnt bierze udział w regulacji odpowiedzi IFN podczas infekcji flawiwirusami36. Oczekuje się, że rozszczepienie SFRP1 zwiększy replikację flawiwirusów. SFRP1 bierze również udział w różnicowaniu komórek Th1737. Dopasowania sekwencji SSHHPS wykazały różnice gatunkowe w sekwencjach miejsc rozszczepienia (Rysunek 10D). Sekwencja miejsca rozszczepienia w SFRP1 była identyczna u ludzi i kurcząt; ZIKV może wywoływać śmiertelność i mikrocefalię u embrionów kurcząt38. U gryzoni wysoko konserwowany reszta P1 (K/R)R↓G jest zastąpiona glicyną (RGG). Szczepy myszy immunokompetentne są zazwyczaj odporne na infekcję i chorobę wywoływaną przez ZIKV39.
Parametry kinetyki stanu stacjonarnego oraz stałe inhibicji dla sekwencji poliprotein wirusowych i sekwencji białek gospodarza można zmierzyć, stosując ciągły test w czytniku płytek31,40,41 (Rysunek 11A). W celu uzyskania jakościowych informacji o cięciu, takich jak rozszczepienie konkretnej sekwencji lub inhibicja proteazy przez różne związki, można zastosować test nieciągły (Rysunek 11B).
Można wymagać optymalizacji liczby reszt pomiędzy CFP a YFP. Model związany z substratem można opracować, wykorzystując metody in silico. Reprezentatywny model dokowania złącza nsP1/nsP2 przedstawiono na Rysunku 9. Dla proteazy nsP2 VEEV zgłaszano cięcie 12-aminokwasowej sekwencji wirusa Semliki Forest (SFV) (Km = 0.58 mM)33. Wydłużenie sekwencji substratu do 19, 22 i 25 reszt oraz zmniejszenie siły jonowej buforu doprowadziło do znacznej redukcji Km. Analiza struktury krystalicznej nsP2 VEEV oraz upakowania kryształów wykazała również, że część jednego ze złączy była upakowana przy domenie proteazy i miała strukturę helikalną. Zatem dłuższe substraty VEEV mogą wiązać się lepiej dzięki rozpoznawaniu motywu struktury drugorzędowej.
W przypadku TRIM14 otrzymaliśmy Km = 21 µM6,33. Km dla substratu zawierającego sekwencję białka gospodarza była porównywalna z wartościami Km substratów zawierających sekwencje miejsc cięcia poliproteiny wirusowej (Km(V12) = 12 µM i Km(V34) = 21 µM). Sekwencje miejsc cięcia w złączach nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 oraz nsP3/nsP4 były cięte z różną wydajnością. Przypuszcza się, że w komórce umożliwia to sekwencyjne cięcie poliproteiny42.
Należy zachować ostrożność w interpretacji wyników negatywnych. Jeśli nie dojdzie do cięcia, miejsce cięcia może być zbyt krótkie lub oczyszczona proteaza może być nieaktywna. W przypadku substratów, które ulegają cięciu, konieczne są dodatkowe eksperymenty w celu potwierdzenia cięcia białka o pełnej długości lub cięcia w komórkach zainfekowanych wirusem. Należy dobrać odpowiednie eksperymenty uzupełniające. Można również zbadać wpływ nadekspresji lub wyciszenia białka docelowego na replikację wirusa.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg" /> 
Rycina 1: Trzy mechanizmy wyciszania. Wyciszanie może zachodzić na poziomie DNA, RNA lub białka. Te algorytmy typu „szukaj i usuń” wykorzystują „słowo kluczowe” do kierowania rozszczepieniem pliku zawierającego to słowo. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Morazzani i wsp.32 oraz przywołanych w niej referencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg" /> 
Rycina 2: Gatunkowe różnice w sekwencjach miejsc cięcia. Na dopasowaniu przedstawiono C-końcowe domeny PRY/SPRY homologów TRIM14. Domenę PRY/SPRY można zidentyfikować po konserwowanych motywach zaznaczonych na szaro. Ludzkie TRIM14 jest cięte w miejscu QEAGA↓G przez cysteinową proteazę nsP2 VEEV. Sekwencja SSHHP została zaznaczona kolorami. Aminokwas zaznaczony na zielono to reszta P1'; na niebiesko to reszta P4, a na czerwono inne konserwowane reszty w sekwencji motywu miejsca cięcia. Konie posiadają skróconą wersję TRIM14, w której brakuje domeny PRY/SPRY. Lizyna zaznaczona na cyjanowo jest poliubikwitynowana i jest ważna dla montażu sygnałosomu MAVS. C-końcowa domena PRY/SPRY może być przejściowo cięta przez proteazę nsP2, aby upośledzić wewnątrzkomórkową odpowiedź przeciwwirusową gospodarza podczas ostrej infekcji wirusowej. U koni domena ta jest zawsze nieobecna. Sugeruje to, że domena PRY/SPRY białka TRIM14 może pełnić funkcję ochronną przeciwko infekcjom VEEV. Rycina została powielona z pracy Morazanni i wsp.6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg" /> 
Rycina 3: Identyfikacja SSHHPS przy użyciu BLAST.** Sekwencja motywu miejsca cięcia w złączu nsP1/nsP2 VEEV jest dopasowana do sekwencji SSHHP w białku gospodarza TRIM14. Pozostałość zaznaczona kolorem zielonym to pozostałość P1'; na niebiesko zaznaczono pozostałość P4, a na czerwono inne konserwatywne pozostałości sekwencji motywu miejsca cięcia. Większość dopasowań wykazała homologię do regionów poza konserwatywnym motywem miejsca cięcia lub nie obejmowała pozostałości wiązania scissile P1/P1'. TRIM14 wykazało dopasowanie do 6 pozostałości w kolejności sekwencyjnej, w tym P1 i P1'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg" /> 
Rycina 4: Sekwencje białkowe i DNA substratu CFP-V12-YFP dla cysteinowej proteazy nsP2 wirusa VEEV. Miejsca restrykcyjne NdeI (CATATG) i XhoI (CTCGAG) zaznaczono wielkimi literami. Na czerwono zaznaczono sekwencję miejsca cięcia z wirusowego poliproteiny, znajdującą się pomiędzy nsP1 a nsP2. Pozostałość zaznaczona na zielono to pozostałość P1', a na niebiesko pozostałość P4 miejsca cięcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg" /> 
Rysunek 5: Sekwencja białkowa konstruktu cysteinowej proteazy Trx-VEEV-nsP2. Tio-redoksyna (Trx) jest zaznaczona na żółto. Miejsce cięcia trombiną oraz znacznik His są zaznaczone na cyjanowo. Diada Cys-His jest oznaczona na czerwono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg" /> 
Rycina 6: Struktury peptydów w programie MOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg" /> 
Rysunek 7: Dokowanie peptydu substratowego przy użyciu PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg" /> 
Rysunek 8: Zadania uruchomione w klastrze Biowulf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg" /> 
Rycina 9: Model substratu P12 VEEV zawierającego sekwencję miejsca cięcia na złączu nsP1/nsP2. Diada katalityczna Cys-477/His-546 zaznaczono na niebiesko. Rycina została przygotowana przy użyciu programu Pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg" /> 
Rycina 10: Analiza SSHHPS proteazy ns2B/ns3 wirusa Zika. (A) Przewidywane białkowe cele gospodarza dla proteazy ns2B/ns3 ZIKV. Pozostałości zaznaczone na czerwono odpowiadają sekwencji pojedynczego miejsca cięcia. Pozostałości zaznaczone na zielono są tolerowane w podstronie i odpowiadają pozostałościom w innych miejscach cięcia. SFRP1 posiadało najwyższą liczbę identycznych pozostałości w kolejności następującej. (B) Białka CFP-substrat-YFP (~50-60 kDa) zawierające przewidywaną sekwencję SSHHP z każdego białka gospodarza (ludzkiego) zostały wyekspresowane i oczyszczone. Proteaza ZIKV przecięła ludzkie białka FOXG1, SFRP1, NT5M oraz podjednostkę Gsalpha wyizolowaną z biblioteki cDNA siatkówki. Produkty cięcia mają masę około 28-30 kDa. Sekwencje substratów są dostępne w pracy Morazzani i wsp.6 (C) Podczas gdy proteaza ns2B/ns3 przecięła SFRP1, nie przecięła jej homologów (SFRP2 i SFRP4). (D) Dopasowanie miejsc cięcia z różnych gatunków zwierząt może być przydatne w wyborze modelu zwierzęcego dla wirusa Grupy IV. Należy zauważyć, że konserwatywna sekwencja R↓G różni się między ludźmi a gryzoniami w białku SFRP1. Rycina powielona z pracy Morazzani i wsp.6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg" /> 
Rycina 11: Analiza kinetyki stanu stacjonarnego z wykorzystaniem testów ciągłych i nieciągłych. (A) Dane kinetyczne przedstawione w Tabeli 5 zostały wykreślone w programie GraFit. Wstawka przedstawia wykres Lineweavera-Burka. (B) Żel SDS-PAGE pokazujący produkty cięcia substratu CFP-V12-YFP. W ścieżce 1 znajduje się substrat „NIECIĘTY” (48 kDa). W ścieżce 2 znajduje się substrat „CIĘTY” (31 kDa i 27 kDa). W ścieżkach 3-9 zastosowano różne związki w celu przetestowania ich aktywności inhibicyjnej. Ścieżka 4 zawiera kowalencyjny inhibitor E64d. Reakcje te prowadzono przez noc, przez ok. 17 h w temperaturze pokojowej. Aby uzyskać wyraźny wzór prążków, konieczne było zagotowanie próbek. Proteaza nsP2 jest widoczna (56 kDa) w reakcjach zawierających enzym, ale nie w ścieżce 1. Ścieżka 1 stanowi kontrolę „bez enzymu”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy ogólny protokół identyfikacji krótkich odcinków homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) osadzonych w poliproteinie wirusa. SSHHP są rozpoznawane przez proteazy wirusowe i kierują ukierunkowanym niszczeniem określonych białek gospodarza przez kilka wirusów grupy IV.

Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Wykazaliśmy, że genomy wirusa grupy IV kodują krótkie odcinki sekwencji białek gospodarza. Sekwencje te można znaleźć w miejscach cięcia proteazy wirusowej. Są one wykorzystywane do ukierunkowanego niszczenia białek gospodarza, zwykle białek zaangażowanych w generowanie odpowiedzi immunologicznej.Główną zaletą stosowania testów proteazy jest to, że usuwają one złożoność komórki i pokazują, czy proteaza wirusowa może rozszczepić określoną sekwencję. Kiedy więc przeanalizowaliśmy sekwencje Zika SSHHPS, odkryliśmy, że proteaza może przecinać sekwencje w białkach zaangażowanych w generowanie odpowiedzi immunologicznej i że niektóre z tych białek odgrywają również rolę w rozwoju mózgu i oczu. Wykonując tę technikę po raz pierwszy, należy pamiętać, że jeśli nie obserwuje się rozszczepienia, może to być spowodowane różnymi czynnikami, takimi jak aktywność proteazy.Procedurę zademonstruje Jaimee Compton, technik z mojego laboratorium. Zacznij od otwarcia Protein BLAST i umieść 20 aminokwasów otaczających wiązanie nożycowe i poliproteinę wirusa, a następnie wybierz nieredundantne sekwencje białek, a następnie wpisz genom gospodarza, który ma zostać przeszukany. W razie potrzeby wybierz PHI-BLAST i wpisz sekwencję wzorca, w której nawiasy kwadratowe wskazują, że dowolny aminokwas w nawiasach może znajdować się w pozycji zastępczej, a następnie naciśnij BLAST.Uporządkuj uderzenia BLAST na podstawie liczby kolejnych identycznych lub tolerowanych pozostałości, które pasują do sekwencji miejsca rozszczepienia. Z listy należy wybrać białka zawierające sześć lub więcej identycznych lub podobnych reszt do analizy w testach proteazy. Skonstruuj plazmid kodujący cyjanowe białko fluorescencyjne, do 25 aminokwasów sekwencji rozszczepienia i żółte białko fluorescencyjne.Następnie przygotuj substraty CFP i YFP, zaszczepiając cztery czterolitrowe kolby 25 mililitrami kultury przez noc. Wstrząśnij kulturami w temperaturze 37 stopni Celsjusza i monitoruj wzrost co godzinę za pomocą spektroskopii UV-Vis przy 600 nanometrach. Gdy bakterie osiągną absorbancję około jednego, indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 mililitra jednego molowego IPTG do każdej kolby, a następnie obniż temperaturę inkubatora do wytrząsania do 17 stopni Celsjusza i pozwól na kontynuację ekspresji przez noc przez 17 do 20 godzin.Następnego dnia osadzaj bakterie przez odwirowanie 7000 razy g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Usuń i wyrzuć płynne podłoże, a następnie przechowuj granulki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub przystąp do lizy komórek. Aby zlizować komórki, przygotuj 100 mililitrów buforu do lizy zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, ponownie zawieś granulki w buforze i przenieś od 25 do 25 mililitrów zawiesiny do 50-mililitrowych jednorazowych probówek stożkowych.Umieść probówki w plastikowej zlewce z lodowatą wodą, a następnie włóż końcówkę sonikatora do probówki tak, aby końcówka znajdowała się około jednego centymetra od dna probówki i sonikuj lizat 10 do 20 razy, aż stanie się płynny i upłynniony. Po sonikacji przenieść lizat do probówek wirówek o dużej prędkości i odwirować go przy 20, 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do czystej butelki i wyrzucić granulki.Załaduj lizat na kolumnę niklu, a następnie umyj kolumnę dwiema objętościami buforu A, a następnie pięcioma objętościami kolumny 20% buforu B. Absorbancja przy 280 nanometrach wzrośnie podczas mycia, gdy zanieczyszczenia będą wymywać się z kolumny. Kontynuuj mycie, aż A280 powróci do wartości bazowych. Następnie wymyj białko za pomocą dwóch do trzech objętości kolumny 100% buforu B i zbierz 10 mililitrowych frakcji, upewniając się, że mierzysz A280 każdej frakcji.Przygotować osiem mieszanin reakcyjnych zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i odpipetować 45 mikrolitrów każdej mieszaniny do pierwszych trzech dołków w każdym rzędzie czarnej płytki 96-dołkowej o połowie powierzchni. Skonfiguruj czytnik płytek do jednoczesnego wykrywania fluorescencji na dwóch długościach fal ze stałym ustawieniem lampy fotopowielacza. Zaprogramuj czas odczytu na 20 do 30 minut z jednym odczytem na minutę i wybierz dołki do odczytu.Włóż płytkę do maszyny i rozpocznij odczyt, monitorując proporcje emisji w czasie. Uruchom odczyt końcowy płyty zawierającej nieobcięte podłoże. Wyjąć płytkę i odpipetować pięć mikrolitrów enzymu do każdej studzienki.Pierwszą kolumnę można zapisać jako formant nieprzecięty. Następnie ponownie odczytaj tabliczkę przez 20 do 30 minut, upewniając się, że czytnik płytek jest ustawiony na wyświetlanie wartości bezwzględnych. Po zakończeniu odczytu uszczelnij płytkę folią, aby zapobiec parowaniu i pozostaw ją na noc w temperaturze pokojowej, aby enzym mógł całkowicie przeciąć podłoże.Po 24 godzinach usuń folię i wykonaj końcowy odczyt płytki. Uśrednić wskaźniki emisji i zapisać je jako obcięte. Potwierdź rozszczepienie podłoża za pomocą SDS-PAGE.Załadować marker masy cząsteczkowej do pierwszego lub ostatniego toru i załadować pięć mikrolitrów każdej mieszaniny reakcyjnej do pasa żelu, zaczynając od reakcji nieoszlifowanej. Podłącz elektrody zbiornika żelu do zasilania i uruchom produkty pod napięciem 110 woltów przez 60 minut. Usuń żel z kasety za pomocą narzędzia do pękania i zanurz go w pięciu do 10 mililitrach roztworu barwiącego.Po upływie od jednej do 24 godzin usuń nadmiar plamy i zanurz żel w wodzie. Następnie zrób zdjęcie żelu za pomocą imagera do żelu. Aby przygotować strukturę białka, załaduj plik PDB białka do MOE.Kliknij opcję Wybierz i rozpuszczalnik, a następnie usuń rozpuszczalnik. Otwórz panel Przygotowanie struktury z górnego paska menu Obliczenia i automatycznie popraw wszystkie elementy konstrukcyjne, klikając Popraw. Wykonaj protonację struktury, klikając przycisk Prorokuj 3D.Dodaj ładunki częściowe do białka, otwierając panel Ładunki częściowe i wybierając AMBER 99 i Dostosuj wodory i samotne pary zgodnie z wymaganiami. Następnie zapisz plik struktury. Aby zbudować strukturę peptydów substratowych i TRIM14, otwórz panel Konstruktor białek, wprowadź sekwencję substratu i wybierz opcję Automatyczne przepakowanie.Następnie ustaw Geometrię jako Rozszerzoną i kliknij Buduj. Na koniec zminimalizuj strukturę i zapisz ją jako plik PDB. Zadokuj peptydy substratu do VEEV-nsP2 za pomocą oprogramowania PyRx AudoDock 4.2.Załaduj białko, kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę i wybierz opcję Utwórz makrocząsteczkę, aby przygotować plik dokowania PDBQT. Następnie załaduj cząsteczkę substratu i wybierz opcję Utwórz ligand, aby przygotować plik dokowania liganda. Uruchom kreatora AutoDock na panelu dokowania u dołu i wybierz przygotowane pliki ligandów i białek.Zdefiniuj kieszeń wiążącą białko, ręcznie dostosowując wymiar siatki, a następnie uruchom AuotGrid. Następnie uruchom AutoDock i wybierz metodę algorytmu genetycznego Lamarcka. Kliknij pozycję Parametry dokowania i ustaw liczbę uruchomień GA na 50, a następnie kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć uruchamianie dokowania.Po zakończeniu pracy funkcji AutoDock otwórz panel Analizuj wyniki i sprawdź wszystkie przewidywane ułożenie opraw. Wybierz najlepszy model o najniższej przewidywanej energii wiązania i rozsądnych interakcjach wiązania między cis-477 a substratem w miejscu rozszczepienia, a następnie zapisz go jako plik PDB do dalszych symulacji MD. Po odczytaniu pozycji powiązań za pomocą funkcji AutoDock ważne jest, aby przeprowadzić analizę po dokowaniu w celu zidentyfikowania prawdopodobnego modelu wiązania do udoskonalenia za pomocą symulacji MD.Protokół ten został wykorzystany do znalezienia krótkich odcinków homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen lub SSHHPS w proteazie ns2B/3 wirusa Zika. Zidentyfikowano cztery docelowe białka gospodarza. FOXGS, SFRP1, podjednostka Gsalpha z biblioteki cDNA siatkówki i mitochondrialna 5'3'nukleotydaza NT5M.Wyrównanie sekwencji SSHHPS pozwoliło na specyficzne dla gatunku różnice w sekwencjach miejsc cięcia. Sekwencja SFRP1 była identyczna u ludzi i kurczaków, co jest godne uwagi, ponieważ wirus Zika może indukować śmiertelność i małogłowie w zarodkach kurczaków. Test ciągły zastosowano do pomiaru parametrów kinetycznych stanu ustalonego i stałych inhibicji dla sekwencji polibiałkowych wirusa, a test nieciągły wykorzystano do uzyskania jakościowych informacji o rozszczepieniu, takich jak rozszczepienie określonej sekwencji lub hamowanie proteazy przez różne związki.Model połączenia wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu nsP1-nsP2 wykonano metodą in silico. W przypadku proteazy nsP2 wydłużenie sekwencji substratu i zmniejszenie siły jonowej buforu doprowadziło do znacznego zmniejszenia stałej Michaelisa rozszczepienia sekwencji wirusa Semliki Forest. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uruchomić kontrolki.Substraty zawierające sekwencje miejsca rozszczepienia proteazy wirusowej powinny zostać przetestowane przed przystąpieniem do analizy sekwencji SSHHPS. Jeśli zaobserwuje się rozszczepienie białka gospodarza, należy przeprowadzić dalsze eksperymenty w celu potwierdzenia, że to białko gospodarza wpływa na replikację wirusa. Można to zrobić poprzez nadekspresję lub wyciszenie białka, a następnie zbadanie wpływu na replikację wirusa.Grupa IV zawiera dużą liczbę nowych i pojawiających się patogenów. Sekwencje SSHHPS łączą określone białka i szlaki gospodarza z proteazami wirusowymi w bardzo przewidywalny sposób.

analysis-of-group-iv-viral-sshhps-using-in-vitro-and-in-silico-methods

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Ten film demonstruje test przyczepiania wirusów do badania przesiewowego związków przeciwwirusowych. Wykorzystując genetycznie zmodyfikowany wirus zapalenia wątroby typu C i lucyferazy, ocenia hamujący wpływ na przyłączanie się wirusa, na co wskazuje niższe natężenie światła w studzienkach poddanych działaniu kooperacji w porównaniu ze studzienkami leczonymi samym wirusem.

Test przyłączania wirusa do badań przesiewowych związków przeciwwirusowych

Ten film demonstruje test do oceny środków przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na określone etapy wnikania wirusa do komórek gospodarza i fuzji z endosomem. Komórki są inkubowane w niskiej temperaturze, a następnie zakażone HCV. Niska temperatura umożliwia wiązanie wirusa z komórkami gospodarza, ale hamuje internalizację poprzez endocytozę. Dodaje się testowy związek przeciwwirusowy, a komórki inkubuje się w temperaturze fizjologicznej. To przejście do wyższej temperatury ułatwia wnikanie...

Test do oceny wpływu badanych związków na wnikanie wirusa i fuzję w komórkach gospodarza

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

Poznaj metody identyfikacji sekwencji SSHHPS w wirusach grupy IV przy użyciu analizy in vitro i in silico. Proteazy wirusowe rozkładają białka gospodarza uczestniczące w odpowiedzi immunologicznej.

Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico

Przeglądaj więcej filmów