Name: Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj metodę klonalnego śledzenia genetycznego w tkankach zmineralizowanych myszy Confetti. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, sekcjonowanie kriostatowe i mikroskopię fluorescencyjną do badania dynamiki komórek chrząstki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jewgienijowi Iwaszkinowi za porady metodyczne. Praca ta była wspierana finansowo przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (A.S.C.), Rosyjską Fundację Naukową (grant #19-15-00241 dla ASC), Instytut Karolinska (A.S.C.), StratRegen KI i Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), Stiftelsen Frimurare Barnhuset i Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Chińską Radę Stypendialną (B.Z.). Mikroskop konfokalny został ufundowany przez Fundację Knuta i Alice Wallenbergów.

Wszystkie prace na myszach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Doświadczeń na Zwierzętach (Komitet Północny w Sztokholmie/Norra Djurförsöksetiska Nämd) i przeprowadzone zgodnie z Przepisami i Wytycznymi Szwedzkiej Agencji ds. Zwierząt dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.
1. Hodowla myszy
<ol>
	<li>Aby wygenerować napięcie, skrzyżuj mysz R26R-Confetti z interesującą ją linią Cre. Młode odsadzone od piersi w wieku 21 dni. 
	UWAGA: Myszy mogą być wykorzystywane do hodowli od około 8 tygodnia życia lub zgodnie z lokalnymi wytycznymi. Genotypowanie (nieopisane tutaj) można przeprowadzić na podstawie biopsji pobranych przy odsadzeniu. Wiek w momencie odsadzenia można dostosować zgodnie z lokalnymi wytycznymi.</li>
</ol>
2. Etykietowanie konfetti
UWAGA: Ta strategia etykietowania jest odpowiednia dla szczepów Cre indukowanych tamoksyfenem.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do 2,5 mg/ml tamoksyfenu w oleju kukurydzianym w szklanej butelce. Rozpuścić przez podgrzanie do temperatury 37 °C w piecu przez maksymalnie 60 minut, mieszając co 5 minut za pomocą wiru, aż proszek się rozpuści. 
	UWAGA: W przypadku zwiększonych dawek tamoksyfenu można przygotować roztwory do 20 mg/ml przy użyciu tej metody.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy, chronić przed światłem.</li>
	<li>Wywołać rekombinację, podając 50 μl 2,5 mg/ml tamoksyfenu rozpuszczonego w oleju kukurydzianym dootrzewnowo w pierwszej dobie po urodzeniu (P1). 
	UWAGA: W zasadzie tamoksyfen może być podawany w każdym wieku, już w pokoleniu F1. Dawka tamoksyfenu powinna być zróżnicowana w zależności od ekspresji Cre, wieku myszy i zastosowania eksperymentalnego. Więcej informacji można znaleźć w sekcji dyskusji. Myszy Cre ujemne traktowane w ten sam sposób mogą być używane jako kontrola negatywna dla sygnałów fluorescencyjnych konfetti. 
	UWAGA: Upewnij się, że osoby zajmujące się zwierzętami są ostrzegane o stosowaniu tamoksyfenu i upewnij się, że materiały klatki są utylizowane zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska i bezpieczeństwa.</li>
</ol>
3. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji w 27 dniu po urodzeniu (P27), stopniowo wypełniając przestrzeń zawierającą myszy dwutlenkiem węgla do co najmniej 80% objętości i utrzymując to stężenie przez 3 minuty. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy. Trzymaj myszy na lodzie podczas sekcji innych zwierząt.</li>
	<li>Wypreparuj tkankę, która Cię interesuje. Poniżej przedstawiono protokół pobierania bliższych płytek wzrostu kości piszczelowej i dystalnej kości udowej oraz chrząstki stawowej kolana, odpowiedni dla myszy po urodzeniu w wieku do 6 miesięcy.
	<ol>
		<li>Usuń skórę wokół kończyn tylnych aż do stopy, używając ostrych nożyczek i kleszczy zębatych.</li>
		<li>Z grubsza przyciąć tkankę mięśniową i tłuszczową z nóg ostrymi nożyczkami. 
		UWAGA: Nie czyść idealnie kości, ponieważ otaczające tkanki zapewniają pewne wsparcie strukturalne podczas cięcia, ale upewnij się, że cała skóra została usunięta.</li>
		<li>Za pomocą skalpela przeciąć tkankę miękką w miejscu, w którym górna część nogi styka się z ciałem, aż widoczna będzie głowa kości udowej, a następnie przeciąć więzadła w stawie biodrowym, aby usunąć nogę. 
		UWAGA: Alternatywnie, jeśli nie można znaleźć głowy kości udowej, przeciąć kość udową blisko biodra mocnymi nożycami.</li>
		<li>Odetnij stopę od reszty nogi za pomocą skalpela lub ostrych nożyczek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrwalanie i przetwarzanie tkanek
UWAGA: W zależności od interesującej tkanki, postępuj zgodnie z jednym z dwóch protokołów opisanych poniżej (4.1 dla tkanek miękkich lub 4.2 dla zmineralizowanych tkanek myszy w wieku powyżej około 45 dni, jak opisano poniżej). W przypadku obu metod należy przechowywać wypreparowane próbki w 3,7% roztworze soli fizjologicznej buforowanej formaldehydem/fosforanem (PBS) na lodzie, podczas gdy pozostałe zwierzęta są poddawane sekcji.
<ol>
	<li>W przypadku tkanek miękkich oraz zmineralizowanych kości piszczelowych i udowych do wieku około P45 należy utrwalić tkankę we wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie/PBS przez 6 godzin, delikatnie tocząc na rotatorze w temperaturze 4 °C. Użyj objętości co najmniej 10 razy większej niż objętość tkanki. Przejdź bezpośrednio do kroku 4.3.</li>
	<li>W przypadku tkanek zmineralizowanych, w tym kości piszczelowych i udowych w wieku powyżej około P45, wymagany jest etap odwapnienia.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l 10% roztworu EDTA/dH2O o pH dostosowanym do 8,05 przy użyciu wodorotlenku sodu. Następnie rozcieńczyć formaldehyd do 3,7% za pomocą tego roztworu. Stężenie robocze EDTA wyniesie 9%.</li>
		<li>Utrwalić tkankę, umieszczając ją na noc we wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie/PBS, delikatnie tocząc na rotatorze w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umieścić tkankę we wstępnie schłodzonym roztworze 3,7% formaldehydu/9% EDTA/dH2O (pH 8,05) i delikatnie obrócić w temperaturze 4 °C w objętości co najmniej 10 razy większej niż objętość tkanki. Powtórz ten krok, umieszczając kości w świeżym, wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie/9% EDTA/dH2O przez 3x przez następne 48 godzin 
		UWAGA: To krótkie odwapnienie wystarczy, aby umożliwić przecięcie kości udowej i piszczelowej myszy w wieku do 6 miesięcy. W przypadku tkanek gęściej zmineralizowanych może być konieczne dalsze odwapnienie w celu poprawy histologii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść tkankę do wstępnie schłodzonej 30% sacharozy/dH2O. Upewnij się, że pojemnik jest wypełniony po brzegi i delikatnie obracaj przez noc w temperaturze 4 °C. Użyj objętości co najmniej 10 razy większej niż objętość tkanki. Tkanka często unosi się na wodzie, gdy po raz pierwszy zostanie umieszczona w tym roztworze i opadnie na dno butelki do rana.</li>
	<li>Aby usunąć pozostały roztwór sacharozy, należy krótko przemyć tkankę, wyjmując ją z roztworu sacharozy za pomocą kleszczyków i całkowicie pokrywając próbkę około 5 ml związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na kilka sekund.</li>
	<li>Napełnij wstępnie oznakowany kriomold OCT i umieść tkankę na dnie. Pracuj szybko, aby próbki nie pozostawały zbyt długo w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Ważne jest, aby umieścić próbkę w dogodnej orientacji na etapie cięcia. Aby zwiększyć szanse na przecięcie przez całe kolumny płytki wzrostu po śledzeniu za pomocą Col2CreERT:Confetti, umieść przyśrodkową stronę skierowaną w dół, używając głowy kości udowej jako prowadnicy i umieść próbkę jak najbardziej płasko do dna formy.</li>
	<li>Osadź próbkę, umieszczając formę na suchym lodzie i czekając, aż OCT całkowicie zastygnie. Umieść krioformy tak płasko, jak to możliwe, aby uniknąć ruchu/przesuwania się tkanki w formie. Po zakończeniu przechowywać próbki w temperaturze -20 °C, jeśli nie są natychmiast używane. 
	UWAGA: Zużyć w ciągu 12 tygodni, ponieważ z wiekiem klocki stają się trudniejsze do krojenia.</li>
</ol>
5. Podział na sekcje
UWAGA: Wykonaj kriosekcję za pomocą kriostatu z jednorazowymi ostrzami odpowiednimi do twardych tkanek. Odpowiedni jest każdy standardowy kriostat.
<ol>
	<li>Wyjmij blok z formy i przymocuj go do uchwytu, nakładając OCT między górną część bloku a uchwyt i schładzając w kriostacie w temperaturze -20 °C przez co najmniej 5 minut, tak aby OCT całkowicie zastygł.</li>
	<li>Schłodzić wstępnie zarówno uchwyt próbki, jak i uchwyt ostrza do temperatury -20 °C, a następnie umieścić próbkę/uchwyt w uchwycie uchwytu, a ostrze w uchwycie ostrza, aby zrównoważyć przez kilka minut. 
	UWAGA: Podane temperatury mogą różnić się o kilka stopni w zależności od kriostatu i tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Użyj kriostatu, aby przyciąć blok i wyciąć skrawki tkanki o odpowiedniej grubości, aby umożliwić wizualizację klonów w tkance będącej przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Do analizy płytki wzrostu pourodzeniowego przygotuj skrawki o wielkości 30−160 μm i zbierz je na szkiełkach. Niektóre modele kriostatu mogą zezwalać na zbieranie grubych sekcji tylko przy użyciu ustawienia trymowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszyć szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż całkowicie wyschną. 
	UWAGA: Czas trwania tego etapu może się różnić w zależności od właściwości tkanki i grubości przekroju. Temperatura w pomieszczeniu również może mieć wpływ na szybkość tego kroku.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 36 miesięcy lub, w przypadku natychmiastowego przetwarzania, przejść do kroku 6.2.</li>
</ol>
6. Przygotowanie i montaż prowadnicy
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełko z zamrażarki i podnieś poziomo do temperatury pokojowej w uchwycie na szkiełka. Poczekaj, aż kondensacja odparuje.</li>
	<li>Usuń OCT za pomocą pipety Pasteura, aby delikatnie nałożyć PBS w temperaturze pokojowej na szkiełko. Im grubszy przekrój, tym dłuższy czas jest wymagany. W przypadku odcinków o grubości 160 μm należy wykonać dwa płukania: inkubować raz przez 15 minut i usunąć płyn, a następnie nałożyć świeży PBS na 5 minut i usunąć płyn. 
	UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie OCT i może być zmieniany w zależności od właściwości tkanki i grubości przekroju, w zależności od potrzeb. Temperatura w pomieszczeniu prawdopodobnie wpłynie na szybkość tego kroku.</li>
	<li>Szkiełka należy zamontować w roztworze 75% 2,2-tiodieetanolu/dH2Ow temperaturze pokojowej z szkiełkami nakrywkowymi o długości 60 mm. 
	UWAGA: Preparaty można przygotować bezpośrednio przed obrazowaniem, ale sygnał fluorescencyjny jest stabilny przez 1-2 tygodnie, jeśli jest trzymany z dala od światła w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Ustaw mikroskop.
	<ol>
		<li>Włącz mikroskop i otwórz oprogramowanie. Kliknij przycisk Uruchom system.</li>
		<li>Wybierz kanały, klikając najpierw Smart Setup na karcie Akwizycja, a następnie wybierając trzy kanały odpowiadające czerwonemu białku fluorescencyjnemu (RFP), żółtemu białku fluorescencyjnemu (YFP) i białku cyjanu fluorescencyjnemu (CFP) pod nagłówkiem Barwnik. Kliknij Najlepszy sygnał, a następnie Zastosuj, aby wybrać lasery. 
		UWAGA: Zawartość zakładki Akwizycja jest pokazana w Pliku uzupełniającym 1A. Jeśli wymagane kanały nie są obecne, dodaj je za pomocą przycisku "+" pod nagłówkiem Barwnik. Niezbędne informacje dotyczące lasera, długości fal wzbudzenia i zakresu rejestrowanych długości fal emisji są pokazane dla trzech białek fluorescencyjnych Confetti w pliku uzupełniającym 1B-D.</li>
		<li>Wybierz soczewkę obiektywu 20x pod nagłówkiem Obiektyw na karcie Tryb akwizycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlokalizuj płytkę wzrostową lub inną tkankę będącą przedmiotem zainteresowania.
	<ol>
		<li>Aby zapewnić odrębny widok, najpierw wybierz kanał zapytania ofertowego, klikając jego nazwę na karcie Kanały. Powoduje to, że szczegóły kanału zapytania ofertowego są wyświetlane w zakładce Ścieżka światła. Kliknij pole wyboru obok T-PMT. 
		Uwaga: Kanał T-PMT pokazuje nieodbite światło laserowe, które służy do wizualizacji niefluorescencyjnych części tkanki.</li>
		<li>Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i umieść płytkę wzrostową lub inną tkankę zainteresowania bezpośrednio między ścieżką światła a soczewką obiektywu.</li>
		<li>Aby uprościć lokalizację tkanki, usuń zaznaczenie kanałów YFP i CFP, zaznaczając pola wyboru pod nagłówkiem Ścieżki na karcie Kanały.</li>
		<li>Wybierz kanał T-PMT, klikając jego nazwę w nagłówku Ścieżki. Kliknij opcję Live (Na żywo) w zakładce Acquisition (Akwizycja) i zwiększ Gain (Master) dla kanału T-PMT, aby zobrazować sekcję tkanki na ekranie, która jest pokazana w skali szarości.</li>
		<li>Przesuń pozycję szkiełka za pomocą joysticka, aby zlokalizować obszar zainteresowania, a następnie ustaw ostrość za pomocą odpowiedniego pokrętła mikroskopu.</li>
		<li>Kliknij przycisk Stop (Zatrzymaj) na karcie Acquisition (Akwizycja), aby wyłączyć ekspozycję lasera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdefiniuj parametry obrazowania.
	<ol>
		<li>Użyj pól wyboru na karcie Kanały, aby wybrać jeden z kanałów, a następnie kliknij opcję Na żywo na karcie Pozyskiwanie, aby wyświetlić obraz tego kanału na ekranie. Następnie, za pomocą lewego przycisku myszy myszy, wyreguluj suwaki, aby ustawić zakres emitowanego sygnału fluorescencyjnego, który jest zbierany, moc lasera (suwak pod nagłówkiem Lasery), wzmocnienie (Master) i przesunięcie cyfrowe w zakładce Kanały, aby wyświetlić komórki oznaczone konfetti na ekranie. Wartości wytyczne dla wszystkich tych parametrów są podane w pliku uzupełniającym 1B-D dla zapytań ofertowych, YFP i CFP. Wykonaj ten krok dla każdego kanału, jeden po drugim. 
		UWAGA: Aby upewnić się, że wizualizowany sygnał nie jest autofluorescencją, jako kontrolę ujemną na tym etapie można użyć przekroju zwierzęcia z ujemnym wynikiem Cre. Ponieważ T-PMT został połączony z laserem RFP (krok 7.2.1), dostosowanie mocy lasera do zapytania ofertowego wpłynie na sygnał T-PMT.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosuj rozmiar otworu, aby zwiększyć wykrywanie fluorescencji. 
		UWAGA: Im większy rozmiar otworka, tym więcej sygnału fluorescencyjnego jest wykrywane w kierunku Z. Wskazówką w tym zakresie jest wynikowa jednostka Airy Unit (AU), która jest automatycznie wskazywana pod wskaźnikiem otworkowym, gdzie 1 AU jest optymalne dla jakości obrazu. Zbyt duże zwiększenie AU zakłóci późniejszą analizę, ponieważ trudniej będzie rozróżnić poszczególne komórki w kierunku Z).</li>
		<li>Sprawdź konfigurację, aby upewnić się, że nagrane sygnały nie nakładają się na siebie.
		<ol>
			<li>Kliknij pola wyboru na karcie Kanały, aby wybrać wszystkie trzy kanały i naciśnij przycisk Snap na karcie Akwizycja.</li>
			<li>Na wynikowym obrazie przewijaj między wyświetlanymi kanałami, klikając podświetlone na niebiesko pola nad każdym wymienionym kanałem na karcie Wymiary. Ręcznie sprawdź, czy kanały na ekranie nakładają się na siebie. Jeśli sygnały nakładają się na siebie (np. jeśli każda czerwona komórka jest również żółta), wróć do początku kroku 7.3 i powtórz czynność, dostosowując parametry nakładających się kanałów, aż będzie można je od siebie odróżnić. Upewnij się, że dla każdej etykiety (tj. RFP, YFP lub CFP) można wizualizować co najmniej jeden klon zawierający tylko jedną z etykiet.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdobądź obraz.
	<ol>
		<li>Wybierz kartę Acquisition Mode (Tryb akwizycji), aby określić jakość obrazu za pomocą wartości Frame Size (Rozmiar klatki), Szybkość i Averaging Number (Liczba uśredniania). 
		UWAGA: Typowe ustawienia dla tych eksperymentów są wskazane w pliku uzupełniającym 1A. Zmniejszenie powiększenia pod nagłówkiem Obszar skanowania na karcie Akwizycja może zwiększyć pole widzenia bez zmiany czasu wymaganego do uzyskania obrazu.</li>
		<li>Na karcie Pozyskiwanie pod nagłówkiem Akwizycja wymiarowa kliknij pole wyboru Z-Stack. Otwórz kartę Z-stack, aby ustawić interwał między obrazami w kierunku Z na 2,5 μm.</li>
		<li>Aby ustawić prawidłowe lokalizacje, wybierz tylko RFP/T-PMT na karcie Kanały i kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić czerwone klony z widocznym konturem tkanki. Ustaw pierwszy i ostatni plasterek, klikając Ustaw pierwszy i Ustaw ostatni na odpowiednim plasterku, regulując ostrość za pomocą pokrętła mikroskopu.</li>
		<li>Kliknij kartę Skanowanie kafelków na karcie Akwizycja i wprowadź łączną liczbę kafelków w kierunku poziomym i pionowym w odpowiednich polach.</li>
		<li>Aby przechwycić obraz, wybierz wszystkie żądane kanały na karcie Kanały, a następnie kliknij przycisk Przyciągaj, aby zebrać pojedynczy obraz, lub przycisk Rozpocznij eksperyment, aby zebrać skan stosu/kafelka Z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazu kliknij Plik, a następnie Zapisz jako i zapisz obraz w typie pliku, który zachowuje jak najwięcej informacji o ustawieniach mikroskopu, aby umożliwić późniejsze przejrzenie i ponowne wykorzystanie.</li>
	<li>Wykonuj dalszą analizę za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainbow%3A+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li>
<li>Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ending+the+message%3A+poly%28A%29+signals+then+and+now%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ending the message: poly(A) signals then and now.</a> Genes & Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+The+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li>
<li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li>
<li>Füllgrabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Lgr6%2B+Progenitor+Cells+in+the+Hair+Follicle%2C+Sebaceous+Gland%2C+and+Interfollicular+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).</li>
<li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344(2018).</li>
<li>Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolour+lineage+tracing+reveals+clonal+dynamics+of+squamous+carcinoma+evolution+from+initiation+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).</li>
<li>Yoo, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Castration-Resistant+Bmi1%2BSox2%2B+Cells+in+Driving+Recurrence+in+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).</li>
<li>McConnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Regulates+Progenitor+Cell+Quiescence+and+Differentiation+in+the+Airway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway.</a> Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+cells+are+self-renewing+chondrocyte+progenitors%2C+which+form+the+articular+cartilage+in+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+Journal%22%5BJournal%5D)">Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice.</a> Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).</li>
<li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radical+switch+in+clonality+reveals+a+stem+cell+niche+in+the+epiphyseal+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate.</a> Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).</li>
<li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, 25902(2017).</li>
<li>Kozhemyakina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Prg4-expressing+articular+cartilage+progenitor+cell+population+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice.</a> Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).</li>
<li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreERT+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li>
<li>Mizuhashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+zone+of+the+growth+plate+houses+a+unique+class+of+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells.</a> Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).</li>
<li>Reinert, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tamoxifen-Induced+Cre+loxP+Recombination+Is+Prolonged+in+Pancreatic+Islets+of+Adult+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice.</a> PloS One. 7 (3), 33529(2012).</li>
<li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+response+of+primary+human+bone+marrow+stromal+cells+to+recombinant+human+bone+morphogenic+protein-2+in+the+early+and+late+stages+of+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation.</a> Development, Growth & Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).</li>
<li>Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+In+Vivo+model+for+combinatorial+fluorescence+labeling+in+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate.</a> The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).</li>
<li>Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., Sävendahl, L., Chagin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mTORC1+in+chondrocytes+does+not+affect+proliferation+or+differentiation%2C+but+causes+the+resting+zone+of+the+growth+plate+to+become+disordered%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Reports%22%5BJournal%5D)">Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered.</a> Bone Reports. 8, 64-71 (2018).</li>
<li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+precursors+contribute+to+skeletal+formation+during+embryonic+development+in+mice+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Model Confetti był szeroko stosowany do badania zmineralizowanych tkanek chrzęstnych 12,13,14 i do opisania zoptymalizowanego protokołu. Myszy konfetti2 z jedną kopią lub dwiema kopiami allelu R26R-Confetti mogą być używane do hodowli i eksperymentów. Rekombinacja u myszy z jednym allelem konstruktu Brainbow 2.1 da cztery potencjalne znaczniki: czerwone białko fluorescencyjne (RFP, cytoplazmatyczne), żółte białko fluorescencyjne (YFP, cytoplazmatyczne), cyjanowe białko fluorescencyjne (CFP, zlokalizowane w błonie) i zielone białko fluorescencyjne (GFP, zlokalizowane w jądrze), podczas gdy rekombinacja u homozygotycznych myszy Confetti (tj. zawierających dwie kopie konstruktu Brainbow 2.1) da 10 możliwych wyjść kolorystycznych (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+CFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). Jednakże, ponieważ zdarzenia wycinania i inwersji DNA zachodzą w sposób stochastyczny, rekombinacja w celu wytworzenia GFP zachodzi tylko w niewielkiej części komórek, jak wcześniej opisano2, i pozornie różni się w zależności od typu komórki lub użytej linii Cre 2,12,13. W związku z tym, biorąc pod uwagę niskie występowanie zdarzeń rekombinacji prowadzących do ekspresji GFP, sześć wyjść kolorystycznych jest najczęstszych u homozygotycznych myszy Confetti.
Ważną kwestią przy planowaniu eksperymentów z myszką Confetti jest znalezienie odpowiedniej odmiany Cre. Po pierwsze, ponieważ allel konfetti ma kilka miejsc loxP, jedno zdarzenie rekombinacji nie wyklucza drugiego4. Oznacza to, że jeśli komórka jest znakowana i dzieli się, aby wytworzyć klon jednego koloru, drugie zdarzenie rekombinacji w jednej z jej komórek potomnych wygeneruje inny kolor, maskując w ten sposób prawdziwą ekspansję klonalną. W związku z tym nieindukowalne szczepy Cre, w których enzym jest zawsze aktywny, jeśli aktywny jest odpowiadający mu promotor, nie są wskazane. Po drugie, w niektórych szczepach ekspresja rekombinazy Cre często odbywa się kosztem endogennego białka, tworząc w ten sposób własny fenotyp (np. w przypadku szczepu myszy knock-in Prg4-GFPCreERT2, w którym myszy mają dwa allele Cre15), więc pożądana jest pojedyncza kopia allelu Cre. We wszystkich opisanych eksperymentach pojedyncza kopia Col2CreERT16 była przenoszona przez samca lub samicę rodzica w celu wygenerowania myszy Col2CreERT: Confetti, jak opisano13. Następnie ważnym czynnikiem jest specyfika linii Cre dla typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Na przykład Col2CreERT jest specyficzny dla chondrocytów, ale znakuje kilka odrębnych populacji chondrocytów we wczesnej chrząstce poporodowej17. Wreszcie, aktywność różnych szczepów Cre może się znacznie zmieniać wraz z wiekiem zwierzęcia, ponieważ endogenna aktywność promotora wykorzystywanego do ekspresji Cre zmienia się, nawet w komórkach tego samego typu (np. Prg4-GFPCreERT2, który może wymagać większej liczby dawek tamoksyfenu, aby oznaczyć komórki strefy powierzchownej jako myszy w wieku15 lat).
Liczba znakowanych komórek będzie odzwierciedlona przez ilość podanego tamoksyfenu, dlatego nie zawsze pożądane jest podanie maksymalnej dawki, ponieważ odróżnienie klonów od siebie może być trudne. Ze względu na to, że ekspresja Cre będzie się różnić w zależności od regulacji różnych promotorów, a także wraz z wiekiem, dawka tamoksyfenu będzie musiała zostać dostosowana w celu optymalizacji etykietowania. Ważne jest, aby pamiętać, że komórki nie są fluorescencyjne natychmiast po wyzwoleniu rekombinacji, ponieważ potrzeba czasu, aby rekombinacja zaszła, a powstałe białka fluorescencyjne zgromadziły się wystarczająco do obrazowania. Potrzebny jest szeroki zakres godzin (od 24 do 72 godzin), na który wydaje się, że ma wpływ linia Cre, typ komórki i wiek zwierzęcia. Ze względu na to, że tamoksyfen może być biologicznie aktywny długo po podaniu18 , zawsze zaleca się dokładne sprawdzenie skuteczności rekombinacji w każdym modelu.
Na etapie mikroskopii konfokalnej wzbudzenie białek fluorescencyjnych konfetti wymaga penetracji tkanki światłem laserowym. Ponieważ różne tkanki mają różne właściwości, światło lasera może nie przenikać przez odcinki wszystkich tkanek o grubości 160 μm. Jednak takie grube odcinki można wykorzystać do chrząstki płytki wzrostowej, jak użyto na rysunku 2, rysunku 3. Należy pamiętać, że każdy mikroskop jest inny i jest mało prawdopodobne, że opisane ustawienia (plik uzupełniający 1) będą działać idealnie bez drobnych korekt. Jednym z głównych wyzwań jest rozróżnienie różnych białek fluorescencyjnych, aby upewnić się, że nie dochodzi do zanieczyszczenia z jednego kanału do drugiego. Na przykład sygnał w kanale YFP spowodowany fluorescencją pochodzącą z GFP nakłada się na kanały YFP i RFP. Kanały YFP i CFP również muszą być dokładnie sprawdzone. Można to zrobić na kilka sposobów. Po pierwsze, zakres emisji długości fal światła fluorescencyjnego, które są rejestrowane dla każdego białka fluorescencyjnego, może zostać zawężony. Po drugie, regulacja mocy lasera w połączeniu z cyfrowym wzmocnieniem może zoptymalizować sygnał. W tym badaniu te kroki były wystarczające, ale opierają się na silnym sygnale fluorescencyjnym. Oznacza to, że teoretycznie nieefektywne przetwarzanie tkanek może zmniejszyć aktywność białek fluorescencyjnych, a słabe źródło światła laserowego może zakłócić separację kanałów.
Jedną z zalet myszy Confetti jest to, że można ją łączyć z dużą liczbą dostępnych genetycznie zmutowanych szczepów, dzięki czemu można badać wpływ określonych genów na dynamikę klonalną 10,11,12,13,14,19,20, choć z pewnymi ograniczeniami. Na przykład rekombinacji alleli konfetti i genu będącego przedmiotem zainteresowania nie można rozdzielić w przypadku stosowania mutantów opartych na Cre loxP w połączeniu ze śledzeniem linii klonalnej. Niemniej jednak, takie zbiegające się zdarzenia rekombinacji mogą być skuteczne 10,14,20. Na przykład, możliwość ta została wykorzystana do zbadania zwiększonej liczby komórek w strefie spoczynku myszy po pourodzeniowej ablacji TSC1 specyficznej dla chondrocytów na płytce wzrostowej21 i ujawniła klonalne pokrewieństwo między tymi komórkami w czasie13. Dodatkowo, specyficzna tkankowo analiza klonalna przy użyciu myszy Confetti może być stosowana ze zmutowanymi myszami nieopartymi na Cre loxP11, a także możliwe jest połączenie tych podejść z farmakologicznymi 8,9,13 i / lub modelami chirurgicznymi8 w celu wizualizacji odpowiedzi klonalnych na inne zaburzenia funkcjonalne. Kolejne możliwości pojawiają się przy łączeniu skrawków znakowanych konfetti z immunodetekcją białek endogennych metodą immunofluorescencji. Taka analiza pozwala na identyfikację śledzonych komórek i ich kolokalizację ze znanym markerem. Dzięki opisanej tutaj metodzie utrwalania możliwe jest przeprowadzenie immunofluorescencji i nadal wizualizacja fluorescencji z białek fluorescencyjnych Confetti12,13. Jednak we wspomnianych pracach pobieranie antygenu nie było wymagane. Ostre metody odzyskiwania antygenu, takie jak gotowanie w buforze cytrynianowym, prowadzą do całkowitej utraty fluorescencji konfetti. Chociaż białka fluorescencyjne Confetti można następnie wykryć za pomocą przeciwciał22, może dojść do utraty tożsamości klonalnej.
Podsumowując, użycie modelu Confetti do oznaczania komórek in vivo jest pouczającym narzędziem do analizy losu tych komórek w czasie. Opisana metoda zapewnia szybki i skuteczny sposób bezpośredniej wizualizacji ekspresji białek fluorescencyjnych w tkankach zmineralizowanych.

Ulepszone metody monitorowania zachowania komórek są pożądane w celu zwiększenia wydajności eksperymentu przy użyciu modeli zwierzęcych. Jednym z najbardziej pouczających podejść do monitorowania zachowania komórek in vivo jest śledzenie linii klonalnej za pomocą wielokolorowych szczepów myszy reporterowych1, w tym szeroko stosowanego R26R-Confetti (Confetti) mouse2. Poprzez genetyczne znakowanie pojedynczych komórek białkami fluorescencyjnymi i śledzenie tych komórek w czasie, naukowcy z wielu dziedzin wykorzystali mysz Confetti do ujawnienia wglądu w wiele różnych systemów biologicznych.
Mysz Confetti to system reporterowy oparty na loxP, w którym rekombinacja DNA zależna od Cre powoduje trwałą ekspresję jednego z kilku możliwych białek fluorescencyjnych w sposób stochastyczny2. Allel R26R-Confetti zawiera wszechobecnie wyrażany promotor CAGG, który znajduje się bezpośrednio przed Neo R-cassette2, którego sekwencja poliadenylacji kończy transkrypcję3, po którym następuje Brainbow 2.1 construct4. W związku z tym rekombinacja za pośrednictwem Cre jednocześnie wycina kasetęNeo R i prowadzi do produkcji pewnych białek fluorescencyjnych w zależności od tego, które części konstruktu Brainbow 2.1 zostaną wycięte. Ta cecha sprawia, że mysz Confetti jest niezwykle elastyczna, ponieważ może być używana do celowania w dowolną populację komórkową myszy, dla której dostępny jest określony szczep Cre. Skrzyżowanie specyficznego tkankowo szczepu Cre ze szczepem R26R-Confetti zapewnia specyfikę etykietowania. Jednak szczep Cre powinien być również indukowalny (np. CreERT lub CreERT2, które wymagają wiązania tamoksyfenu, aby umożliwić im wejście do jądra i wywołanie rekombinacji DNA5), tak aby znakowanie można było osiągnąć w określonych punktach czasowych. W ten sposób populacja komórkowa może być znakowana poprzez wstrzyknięcie powstałego potomstwa CreERT-dodatniego / dodatniego konfetti z tamoksyfenem w pożądanym punkcie czasowym i śledzone do pewnego wieku, kiedy można pobrać interesujące tkanki do analizy. Po przetworzeniu tkanki, komórki znakowane fluorescencyjnie mogą być bezpośrednio wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, dzięki czemu potomstwo każdej początkowo znakowanej komórki można oddzielić od potomstwa wygenerowanego przez dowolną inną znakowaną komórkę na podstawie ich specyficznych znaczników fluorescencyjnych, umożliwiając w ten sposób ocenę klonalności (tj. klonalne śledzenie genetyczne).
Ze względu na elastyczność modelu Confetti, został on zastosowany do badania rozwoju i utrzymania wielu różnych tkanek w zdrowiu i chorobie2,6,7,8,9,10,11. Jednym z powszechnych sposobów wykorzystania modelu jest oznaczenie określonej populacji komórek i określenie, do których tkanek one (i/lub ich potomstwo) się przyczyniły. Jednym z takich odkryć przy użyciu tego podejścia było to, że ząb dorosły składa się z komórek o pochodzeniu glejowym6. Innym zastosowaniem modelu jest badanie homeostazy komórek macierzystych. Na przykład, model Confetti ujawnił, że nisze komórek macierzystych w kryptach jelitowych stopniowo stają się monoklonalne, ponieważ niektóre klony komórek macierzystych dominują podczas konkurencji między komórkami macierzystymi2. Model może być również wykorzystany do oceny proliferacji komórek, co jest szczególnie przydatne do badania wolno dzielących się komórek. Na przykład oceniono tworzenie klonów w chrząstce stawowej12 i zbadano krótkoterminowy wpływ antagonisty jeża na chondrocyty płytki wzrostu u pięciotygodniowych myszy13.
Pomimo względnej prostoty modelu Confetti, sygnał fluorescencyjny może być technicznie trudny do zachowania do momentu zebrania obrazu, szczególnie podczas analizy zmineralizowanych tkanek. W tym przypadku protokół opisuje zoptymalizowany model do wykorzystania myszy Confetti z kością postnatalną (do 6 miesiąca życia), umożliwiając bezpośrednią wizualizację białek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii konfokalnej bez konieczności immunodetekcji. Ten uproszczony protokół można zastosować do tkanek niezmineralizowanych. Ponadto dołączono opis sposobu przechowywania próbek w celu zachowania sygnału fluorescencyjnego przez dłuższy okres co najmniej 3 lat. Zarys protokołu znajduje się w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>2,2-tiodieetanol</td><td>Sigma</td><td>MKCF9328</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe o długości 60 mm</td><td>Mendel-Gl&auml; zer</td><td>220588</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold (standard)</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo</td><td>Model: NX70</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrza kriostatu</td><td>Histolab</td><td>207500014</td><td>Specjalnie do stosowania z twardymi tkankami</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Scharlan</td><td>AC0960005P</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat formaldehydu</td><td>Merck</td><td>8.18708.1000</td><td></td></tr><tr><td>Butelki szklane</td><td>Sigma</td><td>V7130</td><td>Może być stosowany do rozcieńczania tamoksyfenu oraz do utrwalania i przetwarzania tkanek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu do rekonstrukcji 3D</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>11-8162</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura</td><td>102094-104</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td><td>Sigma S0389</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost UltraPlus</td><td>Mendel-Gl&auml; zer</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Zen2 oprogramowanie</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Darmowe oprogramowanie do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej</td></tr></tbody></table>

klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Oznaczanie pojedynczej komórki w ciele w celu monitorowania, jakie typy komórek może ona spowodować i śledzenia jej migracji przez organizm lub określania jej długowieczności, może być skutecznym sposobem na ujawnienie mechanizmów rozwoju i utrzymania tkanek. Jednym z najważniejszych dostępnych obecnie narzędzi do monitorowania komórek in vivo jest model myszy Confetti. Model Confetti może być wykorzystany do genetycznego znakowania pojedynczych komórek u żywych myszy różnymi białkami fluorescencyjnymi w sposób specyficzny dla typu komórki i monitorowania ich losu, a także losu ich potomstwa w czasie, w procesie zwanym klonalnym śledzeniem genetycznym lub śledzeniem linii klonalnej. Model ten został opracowany prawie dekadę temu i przyczynił się do lepszego zrozumienia wielu procesów biologicznych, w szczególności związanych z biologią komórek macierzystych, rozwojem i odnawianiem dorosłych tkanek. Jednak zachowanie sygnału fluorescencyjnego do czasu zebrania obrazu i jednoczesnego uchwycenia różnych sygnałów fluorescencyjnych jest technicznie trudne, szczególnie w przypadku tkanki zmineralizowanej. W tej publikacji opisano krok po kroku protokół użycia modelu Confetti do analizy chrząstki płytki wzrostu, którą można zastosować do dowolnej zmineralizowanej lub niezmineralizowanej tkanki.

Aby oznakować chondrocyty w chrząstce nasadowej i zwizualizować ich ekspansję klonalną wraz z wiekiem przy użyciu tamoksyfenu podanego w dniu P1, oznakowano myszy Col2CreERT:Confetti, a następnie w dniu P27 pobrano ich kończyny dolne. Przekrój centralny wyznaczono poprzez wizualizację więzadła krzyżowego (Rysunek 2A), a następnie zwizualizowano klony w proksymalnej płytce wzrostu kości piszczelowej (Rysunek 2B). Dane te wykazują, że pojedyncze komórki, które w dniu P1 były Col2-dodatnie i zostały oznakowane fluorescencyjnymi białkami Confetti po podaniu tamoksyfenu, uległy ekspansji klonalnej i w dalszym ciągu pozostawały w płytce wzrostu do dnia P27. Wstępne zmiany w ekspansji klonalnej z podobnego punktu czasowego rozwoju można zobaczyć na Rysunku 1 w niedawnej publikacji13.
Aby przedstawić przykład sygnału fluorescencyjnego po długoterminowym przechowywaniu (krok 5.5), pobrany skrawek przechowywano bezpośrednio po (patrz Rycina 2A, B) przez ponad 3 lata przed jego przygotowaniem i obrazowaniem (Rysunek 2C, Wideo 1).
Aby zaprezentować niektóre typowe problemy związane z protokołem, na Rysunku 3A przedstawiono fragment przekroju, który uległ uszkodzeniu podczas etapu kriosekcjonowania. Powiększony obszar przekroju (pomiędzy płytką wzrostu a chrząstką stawową) na Rysunku 3B pokazuje, że taka dawka tamoksyfenu prowadzi do tak wysokiego poziomu rekombinacji w tym obszarze, że uniemożliwiłoby to analizę klonalną.
<img alt="Proces obrazowania tkanki mysiej; schemat szczegółowo przedstawiający etapy mikroskopii konfokalnej i przechowywania w określonej temperaturze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd eksperymentalny. Schemat blokowy podsumowujący kluczowe etapy metody. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe więzadła krzyżowego przedstawiające strukturę piszczeli i kości udowej, podkreślające anatomię więzadła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazy Confetti z myszy Col2CreERT:Confetti. (A) Próbki od myszy Col2CreERT:Confetti przetworzono bez dekalcyfikacji i bez etapu długotrwałego przechowywania. Przekrój centralny zlokalizowano, wykorzystując więzadło krzyżowe jako marker. Obraz ten uzyskano za pomocą skanowania kafelkowego po detekcji RFP przy użyciu T-PMT (Pasek skali = 300 µm). (B) Po rekonstrukcji 3D pokazano kolumny klonalne w bliższej części piszczeli w obrębie płytki wzrostu widocznej na (A). (C) Przetworzono do obrazowania i rekonstrukcji 3D sąsiedni preparat do tego pokazanego na (A) i (B), który był przechowywany w warunkach długoterminowych przez ponad 3 lata. RFP, YFP i CFP pokazano na (B) i (C) (Paski skali = 50 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz z wielokolorowej mikroskopii fluorescencyjnej; analiza struktury komórkowej; badanie ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Problemy występujące podczas stosowania metody. (A) Białe przerywane linie wyznaczają pęknięcie w przekroju przez płytkę wzrostu myszy Col2CreERT:Confetti (Pasek skali = 50 µm). Obszar w białej ramce przedstawiono w panelu (B) (Pasek skali = 25 µm). Na obu panelach widoczne są RFP, YFP i CFP, a w panelu (A) przedstawiono również kanał światła laserowego nieodbitego (T-PMT) w celu wizualizacji tkanki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Trójwymiarowa rekonstrukcja płytki wzrostu myszy Col2CreERT: Confetti. Preparat wykonany z myszy Col2CreERT: Confetti był przechowywany w długoterminowym magazynie przez ponad 3 lata po wykonaniu sekcji, a następnie poddano go obrazowaniu. Rekonstrukcja trójwymiarowa została przeprowadzona automatycznie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i wyeksportowana jako wideo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Plik uzupełniający 1: Typowa konfiguracja mikroskopu konfokalnego. (A) Główne elementy sterujące w karcie Acquisition. (B−D) Przedstawiono parametry laserów, długość fali wzbudzenia oraz zakres rejestrowanych długości fal emisji dla trzech fluorescencyjnych białek Confetti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ta metoda opisuje użycie modelu myszy R26R-Confetti (Confetti) do badania zmineralizowanych tkanek, obejmując wszystkie etapy od strategii hodowlanej do pozyskiwania obrazów. Dołączony jest ogólny protokół, który można zastosować do wszystkich tkanek miękkich oraz zmodyfikowany protokół, który można zastosować do tkanek zmineralizowanych.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Poprzez genetyczne znakowanie pojedynczych komórek białkami fluorescencyjnymi i śledzenie tych komórek w czasie, mysz Confetti pozwoliła naukowcom ujawnić nowe informacje na temat wielu procesów biologicznych. Nasz protokół minimalizuje czas opóźnienia między pobraniem tkanki a obrazowaniem, może być stosowany do dowolnej zmineralizowanej lub niezmineralizowanej tkanki i zachowuje fluorescencję przez kilka lat. Metoda ta jest bardzo przydatna we wszystkich dziedzinach medycyny regeneracyjnej i biologii rozwoju, ponieważ może być stosowana do różnych populacji komórkowych w celu zbadania ich losu i kinetyki, o ile dostępna jest odpowiednia linia Cre.Nasze instrukcje krok po kroku pokażą najtrudniejszy krok do rozróżnienia różnic w sygnałach fluorescencyjnych emitowanych przez różne białka fluorescencyjne. Zacznij od przygotowania tkanki myszy do obrazowania. W przypadku tkanek miękkich oraz zmineralizowanych kości piszczelowych i udowych myszy w wieku do 45 dni, utrwal tkankę we wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie PBS i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez sześć godzin, delikatnie tocząc się na rotatorze.W przypadku tkanek zmineralizowanych, takich jak piszczele i kości udowe, od myszy w wieku powyżej 45 dni, przygotuj jeden litr 10% roztworu EDTA o pH dostosowanym do 8,05 wodorotlenkiem sodu i rozcieńcz formaldehyd do 3,7%używając tego roztworu. Napraw tkankę, trzymając ją przez noc w 3,7% formaldehydzie PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść go we wstępnie schłodzonym roztworze formaldehydu EDTA i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, obracając się przez 48 godzin, pamiętając o trzykrotnej wymianie roztworu podczas inkubacji.Następnie umieść chusteczkę we wstępnie schłodzonej 30% sacharozy, upewniając się, że pojemnik jest wypełniony po brzegi i delikatnie obracaj go przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rano za pomocą kleszczy usuń tkankę z roztworu sacharozy i płucz ją w pięciu mililitrach związku o optymalnej temperaturze cięcia lub OCT przez kilka sekund. Napełnij wstępnie oznakowany kriomoder OCT i umieść tkankę na dnie, pracując szybko, aby uniknąć zbyt długiego pozostawania próbki w temperaturze pokojowej.Osadź próbkę, umieszczając formę na suchym lodzie i czekając, aż OCT zastygnie. Jeśli próbki nie zostaną natychmiast wykorzystane, można je przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wyjmij blok z formy.Umieść OCT między górną częścią bloku a uchwytem i schłodzić go w kriostacie przez co najmniej pięć minut lub do momentu, gdy OCT całkowicie zastygnie. Wstępnie schłodzić uchwyt próbki i uchwyt ostrza do temperatury minus 20 stopni Celsjusza, a następnie umieścić próbkę w uchwycie uchwytu, a ostrze w uchwycie ostrza i pozostawić do zrównoważenia przez kilka minut. Do analizy poporodowej płytki wzrostowej przygotuj skrawki o wielkości od 30 do 160 mikrometrów.Za pomocą kriostatu przyciąć blok i przyciąć skrawki tkanek do odpowiedniej grubości i zebrać je na szkiełkach. Następnie wysusz szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż całkowicie wyschną i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do 36 miesięcy. Gdy szkiełko będzie gotowe do użycia, wyjmij je z zamrażarki i doprowadź do temperatury pokojowej w uchwycie na szkiełka.Aby usunąć OCT, delikatnie nałóż PBS na szkiełko za pomocą pipety Pasteura. W przypadku odcinków o grubości 160 mikrometrów inkubować szkiełko przez 15 minut, usunąć płyn i nakładać świeży PBS przez kolejne pięć minut. Zamontuj szkiełka w roztworze 75% tiodieetanolu w temperaturze pokojowej z szkiełkami nakrywkowymi o długości 60 milimetrów.W pierwszej kolejności należy wybrać kanał RFP, klikając na niego w zakładce kanały, co powoduje wyświetlenie szczegółów kanału w zakładce ścieżki światła. Następnie kliknij pole wyboru obok T-PMT. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i umieść interesującą tkankę bezpośrednio między ścieżką światła a soczewką obiektywu.Aby zlokalizować tkankę, usuń zaznaczenie pól YFP i CFP pod nagłówkiem ścieżek na karcie kanałów. Wybierz kanał T-PMT w nagłówku ścieżek, a następnie kliknij na żywo na karcie akwizycji i zwiększ wzmocnienie kanału T-PMT, aby zobrazować wybór tkanki na ekranie. Dostosuj położenie szkiełka, aby zlokalizować obszar zainteresowania i ustawić ostrość za pomocą odpowiedniego pokrętła mikroskopu.Następnie kliknij stop na karcie akwizycji, aby wyłączyć ekspozycję lasera. Zdefiniuj parametry obrazowania zgodnie z instrukcjami rękopisu i w razie potrzeby dostosuj rozmiar otworu. Sprawdź konfigurację, aby upewnić się, że nagrane sygnały nie nakładają się na siebie, a następnie wybierz wszystkie trzy kanały w zakładce kanałów i naciśnij przycisk przyciągania.Przewijaj między kanałami wyświetlania na wynikowym obrazie, klikając podświetlone na niebiesko pola nad każdym kanałem na karcie wymiarów i ręcznie sprawdź, czy kanały na ekranie nakładają się na siebie. Jeśli sygnały nakładają się na siebie, dostosuj ponownie parametry, aż będzie można je od siebie odróżnić. Protokół ten został wykorzystany do znakowania chondrocytów w chrząstce nasadowej i wizualizacji ich klonalnej ekspansji wraz z wiekiem.Odcinek środkowy określono poprzez wizualizację więzadła krzyżowego i zobrazowano klony w bliższej płytce wzrostu piszczelowej. Pojedyncze komórki, które były Col2-dodatnie i zostały znakowane białkami fluorescencyjnymi Confetti po podaniu tamoksyfenu, przeszły ekspansję klonalną, a następnie pozostały na płytce wzrostowej. Sygnał fluorescencyjny można uwidocznić po długotrwałym przechowywaniu.Niektóre skrawki były przechowywane przez ponad trzy lata przed przygotowaniem i obrazowaniem. Rekonstrukcja trójwymiarowa została przeprowadzona automatycznie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i wyeksportowana w postaci wideo. Jedna sekcja uszkodzona podczas etapu kriosekcji zawiera obszar o tak wysokim poziomie rekombinacji, że uniemożliwiłby analizę klonalną, co pokazuje jeden z typowych problemów napotykanych w tym protokole.W zależności od pytania badawczego, bardzo ważne może być użycie linii Cre, która specjalnie oznacza interesujące Cię komórki. Dlatego zalecamy sprawdzenie fluorescencji w tych komórkach wkrótce po rekombinacji. Stosowanie indukowalnych linii Cre jest niezbędne, ponieważ trwająca rekombinacja DNA w nieindukowalnych liniach Cre może zmienić profil fluorescencyjny rozpuszczonych komórek, uniemożliwiając w ten sposób analizę klonalną.Protokół ten może być łączony z zaburzeniami funkcjonalnymi, takimi jak genetycznie zmodyfikowane szczepy, leczenie farmakologiczne, interwencje chirurgiczne, a także barwienie immunofluorescencyjne przygotowanych skrawków.

clonal-genetic-tracing-using-confetti-mouse-to-study-mineralized

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

Opracowaliśmy dwa zestawy kombinacji śledzenia u myszy Rosa26tdtomato (wszechobecne w wszystkich komórkach)/Cre (specyficznie wyrażane w chondrocytach): jeden z 2.3Col1a1-GFP (specyficzny dla osteoblastów) i jeden z immunofluorescencją (specyficzny dla komórek kostnych). Dane wskazują na bezpośrednią transformację chondrocytów w komórki kostne.

Kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Siekacz myszy zawiera cenne komórki zachowujące etykietę w swojej niszy komórek macierzystych. Dysponujemy nowatorskim sposobem na bezstronne wykrywanie i ilościowe określanie komórek zachowujących etykiety; W naszym badaniu wykorzystano znakowanie EdU i podejście do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu żuchwy z materiału PEGASOS.

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe komórek zatrzymujących znaczniki w siekaczach myszy przy użyciu podejścia do rekonstrukcji 3D po oczyszczeniu tkanek

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj metodę klonalnego śledzenia genetycznego w tkankach zmineralizowanych myszy Confetti. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, sekcjonowanie kriostatowe i mikroskopię fluorescencyjną do badania dynamiki komórek chrząstki.

Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Przeglądaj więcej filmów