Klonalne śledzenie genetyczne przy użyciu myszy konfetti do badania zmineralizowanych tkanek

Poprzez genetyczne znakowanie pojedynczych komórek białkami fluorescencyjnymi i śledzenie tych komórek w czasie, mysz Confetti pozwoliła naukowcom ujawnić nowe informacje na temat wielu procesów biologicznych. Nasz protokół minimalizuje czas opóźnienia między pobraniem tkanki a obrazowaniem, może być stosowany do dowolnej zmineralizowanej lub niezmineralizowanej tkanki i zachowuje fluorescencję przez kilka lat. Metoda ta jest bardzo przydatna we wszystkich dziedzinach medycyny regeneracyjnej i biologii rozwoju, ponieważ może być stosowana do różnych populacji komórkowych w celu zbadania ich losu i kinetyki, o ile dostępna jest odpowiednia linia Cre.

Nasze instrukcje krok po kroku pokażą najtrudniejszy krok do rozróżnienia różnic w sygnałach fluorescencyjnych emitowanych przez różne białka fluorescencyjne. Zacznij od przygotowania tkanki myszy do obrazowania. W przypadku tkanek miękkich oraz zmineralizowanych kości piszczelowych i udowych myszy w wieku do 45 dni, utrwal tkankę we wstępnie schłodzonym 3,7% formaldehydzie PBS i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez sześć godzin, delikatnie tocząc się na rotatorze.

W przypadku tkanek zmineralizowanych, takich jak piszczele i kości udowe, od myszy w wieku powyżej 45 dni, przygotuj jeden litr 10% roztworu EDTA o pH dostosowanym do 8,05 wodorotlenkiem sodu i rozcieńcz formaldehyd do 3,7%używając tego roztworu. Napraw tkankę, trzymając ją przez noc w 3,7% formaldehydzie PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść go we wstępnie schłodzonym roztworze formaldehydu EDTA i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, obracając się przez 48 godzin, pamiętając o trzykrotnej wymianie roztworu podczas inkubacji.

Następnie umieść chusteczkę we wstępnie schłodzonej 30% sacharozy, upewniając się, że pojemnik jest wypełniony po brzegi i delikatnie obracaj go przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rano za pomocą kleszczy usuń tkankę z roztworu sacharozy i płucz ją w pięciu mililitrach związku o optymalnej temperaturze cięcia lub OCT przez kilka sekund. Napełnij wstępnie oznakowany kriomoder OCT i umieść tkankę na dnie, pracując szybko, aby uniknąć zbyt długiego pozostawania próbki w temperaturze pokojowej.

Osadź próbkę, umieszczając formę na suchym lodzie i czekając, aż OCT zastygnie. Jeśli próbki nie zostaną natychmiast wykorzystane, można je przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wyjmij blok z formy.

Umieść OCT między górną częścią bloku a uchwytem i schłodzić go w kriostacie przez co najmniej pięć minut lub do momentu, gdy OCT całkowicie zastygnie. Wstępnie schłodzić uchwyt próbki i uchwyt ostrza do temperatury minus 20 stopni Celsjusza, a następnie umieścić próbkę w uchwycie uchwytu, a ostrze w uchwycie ostrza i pozostawić do zrównoważenia przez kilka minut. Do analizy poporodowej płytki wzrostowej przygotuj skrawki o wielkości od 30 do 160 mikrometrów.

Za pomocą kriostatu przyciąć blok i przyciąć skrawki tkanek do odpowiedniej grubości i zebrać je na szkiełkach. Następnie wysusz szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż całkowicie wyschną i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do 36 miesięcy. Gdy szkiełko będzie gotowe do użycia, wyjmij je z zamrażarki i doprowadź do temperatury pokojowej w uchwycie na szkiełka.

Aby usunąć OCT, delikatnie nałóż PBS na szkiełko za pomocą pipety Pasteura. W przypadku odcinków o grubości 160 mikrometrów inkubować szkiełko przez 15 minut, usunąć płyn i nakładać świeży PBS przez kolejne pięć minut. Zamontuj szkiełka w roztworze 75% tiodieetanolu w temperaturze pokojowej z szkiełkami nakrywkowymi o długości 60 milimetrów.

W pierwszej kolejności należy wybrać kanał RFP, klikając na niego w zakładce kanały, co powoduje wyświetlenie szczegółów kanału w zakładce ścieżki światła. Następnie kliknij pole wyboru obok T-PMT. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka i umieść interesującą tkankę bezpośrednio między ścieżką światła a soczewką obiektywu.

Aby zlokalizować tkankę, usuń zaznaczenie pól YFP i CFP pod nagłówkiem ścieżek na karcie kanałów. Wybierz kanał T-PMT w nagłówku ścieżek, a następnie kliknij na żywo na karcie akwizycji i zwiększ wzmocnienie kanału T-PMT, aby zobrazować wybór tkanki na ekranie. Dostosuj położenie szkiełka, aby zlokalizować obszar zainteresowania i ustawić ostrość za pomocą odpowiedniego pokrętła mikroskopu.

Następnie kliknij stop na karcie akwizycji, aby wyłączyć ekspozycję lasera. Zdefiniuj parametry obrazowania zgodnie z instrukcjami rękopisu i w razie potrzeby dostosuj rozmiar otworu. Sprawdź konfigurację, aby upewnić się, że nagrane sygnały nie nakładają się na siebie, a następnie wybierz wszystkie trzy kanały w zakładce kanałów i naciśnij przycisk przyciągania.

Przewijaj między kanałami wyświetlania na wynikowym obrazie, klikając podświetlone na niebiesko pola nad każdym kanałem na karcie wymiarów i ręcznie sprawdź, czy kanały na ekranie nakładają się na siebie. Jeśli sygnały nakładają się na siebie, dostosuj ponownie parametry, aż będzie można je od siebie odróżnić. Protokół ten został wykorzystany do znakowania chondrocytów w chrząstce nasadowej i wizualizacji ich klonalnej ekspansji wraz z wiekiem.

Odcinek środkowy określono poprzez wizualizację więzadła krzyżowego i zobrazowano klony w bliższej płytce wzrostu piszczelowej. Pojedyncze komórki, które były Col2-dodatnie i zostały znakowane białkami fluorescencyjnymi Confetti po podaniu tamoksyfenu, przeszły ekspansję klonalną, a następnie pozostały na płytce wzrostowej. Sygnał fluorescencyjny można uwidocznić po długotrwałym przechowywaniu.

Niektóre skrawki były przechowywane przez ponad trzy lata przed przygotowaniem i obrazowaniem. Rekonstrukcja trójwymiarowa została przeprowadzona automatycznie za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i wyeksportowana w postaci wideo. Jedna sekcja uszkodzona podczas etapu kriosekcji zawiera obszar o tak wysokim poziomie rekombinacji, że uniemożliwiłby analizę klonalną, co pokazuje jeden z typowych problemów napotykanych w tym protokole.

W zależności od pytania badawczego, bardzo ważne może być użycie linii Cre, która specjalnie oznacza interesujące Cię komórki. Dlatego zalecamy sprawdzenie fluorescencji w tych komórkach wkrótce po rekombinacji. Stosowanie indukowalnych linii Cre jest niezbędne, ponieważ trwająca rekombinacja DNA w nieindukowalnych liniach Cre może zmienić profil fluorescencyjny rozpuszczonych komórek, uniemożliwiając w ten sposób analizę klonalną.

Protokół ten może być łączony z zaburzeniami funkcjonalnymi, takimi jak genetycznie zmodyfikowane szczepy, leczenie farmakologiczne, interwencje chirurgiczne, a także barwienie immunofluorescencyjne przygotowanych skrawków.