Name: Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę oceny czynności serca in vitro przy użyciu kardiomiocytów ze skórą. Technika ta umożliwia badanie funkcji miofilamentów z małych biopsii i ocenę interwencji terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Portugalskiej Fundacji na rzecz Nauki i Technologii (FCT), Unii Europejskiej, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) i Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) za finansowanie jednostki badawczej UnIC (UID/IC/00051/2013). Projekt ten jest wspierany przez FEDER w ramach COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektu DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), wspieranego przez Regionalny Program Operacyjny Norte Portugal (NORTE 2020), w ramach umowy partnerstwa Portugalia 2020, za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (EFRR), projektu NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), wspieranego przez europejskie fundusze strukturalne i inwestycyjne, regionalnego programu operacyjnego Lizbony programu na rok 2020. Patrícia Rodrigues była finansowana przez FCT (SFRH/BD/96026/2013), a João Almeida-Coelho przez Universidade do Porto/FMUP i FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

<ol><li>Leite-Moreira, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+compliance%3A+a+novel+adaptive+biological+mechanism+following+acute+cardiac+load%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocardial+stiffness+by+%CE%B2-adrenergic+stimulation+-+its+role+in+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart.</a> Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).</li>
<li>Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCokkinos%2C+DV+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).</li>
<li>van der Velden, J., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Disorders+and+Pathophysiology+of+Sarcomeric+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).</li>
<li>Garnier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+procedures+for+mechanical+manipulation+of+isolated+cardiac+myocytes%3A+a+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge.</a> Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).</li>
<li>Brady, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+isolated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.</a> Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).</li>
<li>Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFalcao-Pires%2C+I+%22Introduction+to+Translational+Cardiovascular+Research%22">Introduction to Translational Cardiovascular Research</a>. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).</li>
<li>Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teaching+calcium-induced+calcium+release+in+cardiomyocytes+using+a+classic+paper+by+Fabiato%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+Physiology+Education%22%5BJournal%5D)">Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato.</a> Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Maximum+Isometric+Force+Generated+by+Permeabilized+Skeletal+Muscle+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695(2015).</li>
<li>Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+structure+and+theories+of+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle structure and theories of contraction.</a> Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).</li>
<li>Sequeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+role+of+ADP+and+Ca%282%2B%29+in+diastolic+myocardial+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness.</a> Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).</li>
<li>Edes, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+tension+redevelopment+is+not+modulated+by+sarcomere+length+in+permeabilized+human%2C+murine%2C+and+porcine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Regulatory+Integrative+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes.</a> American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics%3A+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Hamdani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+titin+hypophosphorylation+importantly+contributes+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+in+a+rat+metabolic+risk+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model.</a> Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).</li>
<li>Miranda-Silva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+biventricular+alterations+in+myocardial+%28reverse%29+remodelling+in+aortic+banding-induced+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2956(2019).</li>
<li>Rodrigues, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+myocardial+changes+induced+by+doxorubicin+in+the+nonfailing+dilated+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology+Heart+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle.</a> American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).</li>
<li>van der Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+myofilament+function+contribute+to+left+ventricular+dysfunction+in+pigs+early+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).</li>
<li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li>
<li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li>
<li>Lim, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthracyclines+induce+calpain-dependent+titin+proteolysis+and+necrosis+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biology+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes.</a> Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).</li>
<li>Woulfe, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+of+Isolating+Myofibrils+From+Primary+Cardiomyocyte+Culture+Suitable+for+Myofibril+Mechanical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study.</a> Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12(2019).</li>
<li>Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+cardiac+biophysical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Cardiology+Science+Practice%22%5BJournal%5D)">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą stanowi ważną technikę wyjaśniającą modyfikacje zachodzące na poziomie kardiomiocytów w kontekście fizjologicznym (np. rozciągnięcie) i patologicznym (np. niedokrwienie). Metodologia ta ma kilka zalet, takich jak wymóg minimalnej ilości mięśnia sercowego do oceny funkcji kardiomiocytów uzyskanych z rozmrożonych próbek; Wykorzystując kardiomiocyty z szerokiej gamy gatunków (myszy13, szczur 1,14,15, królik16, świnia17, pies18, świnka morska19 i człowiek20) oraz różne lokalizacje serca, w tym przedsionki, lewą i prawą komorę lub określony obszar zawału serca. Co więcej, technika ta pozwala na dostarczanie określonych stężeń Ca2+ i energii (ATP) przy jednoczesnym pomiarze funkcji struktur regulacyjnych i kurczliwych w ich natywnej konfiguracji.
Pomimo prostoty tej techniki, istnieje kilka krytycznych kroków. Istotne jest, aby zagwarantować jakość każdego etapu od samego początku, w tym pobierania próbek. Białka miofilamentowe są podatne na proteazy21. W związku z tym obowiązkowe jest przechowywanie próbek w ciekłym azocie natychmiast po ich pobraniu. Świeże próbki, które nie były wcześniej zamrażane, będą wytwarzać znacznie większe siły, dlatego nie zaleca się mieszania pomiarów wykonanych w próbkach świeżych i mrożonych w tym samym protokole. Drugim najbardziej krytycznym etapem jest ekstrakcja kardiomiocytów. Podczas tej procedury bardzo ważne jest, aby przez większość czasu utrzymywać próbkę na lodzie. Koktajl inhibitorów proteazy może być stosowany w celu zmniejszenia ryzyka degradacji białka podczas ekstrakcji/przepuszczalności22. Po trzecie, próbki należy ciąć na mniejsze kawałki za pomocą precyzyjnych ruchów skalpela, ponieważ zauważyliśmy obniżoną jakość kardiomiocytów, gdy ten krok został zignorowany. Kolejnym krytycznym krokiem jest mycie kardiomiocytów, ponieważ trudno jest uzyskać właściwą równowagę między wymywaniem Tritona (przenika komórkę, ale sprzyja jej odklejaniu) a utrzymaniem jak największej liczby komórek w supernatancie. Ważne jest, aby najpierw spróbować ekstrakcji i liczby wymywania dla każdej próbki, gatunku lub protokołu. Na przykład w naszych rękach zauważyliśmy, że ekstrakcje tkanek otyłych szczurów ZSF1 mają "tłusty" aspekt, co sprawiało, że komórki te były bardziej śliskie podczas klejenia, ale nie trudniejsze do zmierzenia. Sposobem na obejście tego problemu było przeprowadzenie większej liczby eksperymentów, aby uzyskać rozsądną liczbę komórek na zwierzę. Ponadto ważne jest, aby wybrać dobrą komórkę do klejenia, a mianowicie o dobrym prążkowaniu i rozsądnej długości. Jeśli kardiomiocyt nie ma tych cech, w większości przypadków odczepia się od końcówek igły lub wytwarza żadną lub małą siłę. Ważne jest również, aby użyć odpowiedniego kleju do mocowania kardiomiocytów, biorąc pod uwagę czas klejenia i jego skuteczność w przyklejaniu komórki do igły. W naszych rękach klej silikonowy (Tabela Materiałów) utwardza się szybko (10-15 min) i wystarczająco mocno. Wreszcie ostatni krytyczny krok związany jest z ostrożnym podniesieniem kardiomiocytu 5 minut po sklejeniu komórki (aby uniknąć przyklejenia komórki do szkiełka nakrywkowego) i przed przeniesieniem jej do studzienek (aby uniknąć przeciągania komórki przez etap mikroskopu). Tabela 7 podsumowuje rozwiązywanie problemów związanych z tą techniką, jej podstawowe przyczyny i możliwe rozwiązania w celu przezwyciężenia częstych problemów.
Głównym ograniczeniem tej metody jest to, że nie może ona odpowiedzieć na wszystkie pytania związane z kurczliwością miofilamentów, takie jak szybkość aktywacji/dezaktywacji miofilamentów. W warunkach in vivo depolaryzacja błony, wewnątrzkomórkowy wzrost Ca2 + i jego dyfuzja do miofilamentów muszą nastąpić, aby miocyty się skurczyły, podczas gdy w kardiomiocytach ze skórą dyfuzja Ca2 + do miofilamentów następuje natychmiast, gdy komórka jest zanurzona w roztworze Ca2 + . To szybsze tempo dyfuzji Ca2 + spowoduje odchylenie analizy aktywacji/dezaktywacji miofilamentów23.
Na eksperymenty te mają wpływ różne czynniki, w tym temperatura, pH roztworu, perturbacja mechaniczna (luz-ponowne rozciąganie vs. luz) i procedury mocowania komórek (wiązanie szpilkami vs. klej), wszystkie te zmienne odpowiadają za rozbieżności w literaturze pod względem ktr i zależnego od długości sarkomeru wzrostu siły 4,12.
Przyszły postęp tej techniki obejmuje przeprowadzanie badań funkcjonalnych w nienaruszonych, a nie permeabilizowanych kardiomiocytach. Ta technika ma tę wadę, że polega na wykorzystaniu kardiomiocytów świeżo wyizolowanych (wcześniej nie zamrożonych). Kolejną ważną kwestią, która nie jest bezpośrednio związana z tą metodyką, ale może mieć na nią istotny wpływ, jest maksymalny okres przechowywania zamrożonej próbki. W szczególności obowiązkowe jest ustalenie stopnia degradacji miofilamentów w czasie przechowywania (tj. jak długo można przechowywać zamrożone próbki, aby zapewnić dobrą jakość danych funkcjonalnych pochodzących z wyekstrahowanych kardiomiocytów).

Tradycyjnie, ocena właściwości mechanicznych mięśnia sercowego była podejmowana głównie w preparatach wielokomórkowych, takich jak mięśnie brodawkowate i beleczki1,2. Wielokomórkowe paski mięśnia sercowego obejmują niejednorodną populację komórek, w tym kurczliwe kardiomiocyty o nieznanym wzorcu orientacji i generowania siły, aktywności elektrycznej i rozkładu stresu/naprężenia, a także otaczającą macierz tkanki łącznej3,4. Preparat bez kolagenu i zawierający pojedynczy kardiomiocyt pozwoliłby na pomiar długości sarkomeru i właściwości kurczliwości mostka krzyżowego w bardzo precyzyjny i kontrolowany sposób5,6. Dlatego w ciągu ostatnich czterech dekad opracowano kilka metodologii pozwalających na badanie właściwości mechanicznych, kurczliwych i relaksacyjnych pojedynczego kardiomiocytu6,7. Funkcja kurczliwości tych komórek jest silnie zależna od długości sarkomeru i kinetyki cyklu krzyżowego3. W związku z tym pożądane jest badanie funkcji mięśni bezpośrednio w pojedynczych izolowanych komórkach serca, biorąc pod uwagę, że pozwala to na ocenę długości i wydajności sarkomeru, a także funkcji mostka krzyżowego i właściwości skurczowych. Jednak izolowanie i przyłączanie funkcjonalnych kardiomiocytów z rozsądną rozdzielczością sarkomeru optycznego przy jednoczesnym rejestrowaniu pomiaru siły na poziomie μN jest nadal trudne i ewoluuje3,6. Innym wyzwaniem jest logistyka, którą należy zainstalować, aby wyizolować kardiomiocyty ze świeżo pobranych biopsji. Na przykład nieprzewidywalność pobierania biopsji u ludzi może zagrozić wykonalności eksperymentów.
Ponadto, kwestie etyczne dotyczące zastępowania, ograniczania i udoskonalania eksperymentów na zwierzętach na potrzeby procedur naukowych (zasady 3R) promowały zmiany w badaniach na poziomie komórkowym i tkankowym, najlepiej w biopsjach ludzkich lub w mniejszych próbkach zwierzęcych. Rzeczywiście, stopniowe udoskonalanie metodologii oceny funkcji serca in vitro na mniejszym poziomie złożoności pozwala na właściwą integrację wyników z całym ciałem i przełożenie ich na scenariusz kliniczny7. Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie próbek przechowywanych w temperaturze -80 °C do ekstrakcji kardiomiocytów może być atrakcyjną alternatywą.
Tkanka mięśnia sercowego jest cięta na małe kawałki i homogenizowana za pomocą moździerza i tłuczka. Wynikiem tej homogenizacji jest zawieszenie oskórowanych, wiązkowych i izolowanych komórek o różnym stopniu uszkodzenia sarkolemmalnego, w którym mioplazma jest wystawiona na działanie pożywki do kąpieli, a wszystkie składniki komórkowe są wypłukiwane. Struktury takie jak miofibryle, które są dalej oddalone od sarkolemmy, są zachowane. W ten sposób skracanie sarkomeru i właściwości funkcjonalne związane z aparatem miofibrylarnym pozostają nienaruszone i mogą być rejestrowane8,9.
System pomiaru siły kardiomiocytów składa się z silnika elektromagnetycznego, używanego do regulacji długości kardiomiocytów, oraz przetwornika siły, który mierzy izometryczny skurcz kardiomiocytów. Przepuszczalny lub oskórowany kardiomiocyt umieszcza się w komorze doświadczalnej zawierającej roztwór relaksujący ([Ca2+] < 10 nM) i przykleja silikonem do 2 cienkich igieł: jednej przymocowanej do silnika, a drugiej do przetwornika siły. Układ optyczny służy do określania morfologii kardiomiocytów i długości sarkomerów. Protokół eksperymentalny często składa się z serii zapisów sił na roztworach buforowych zawierających różne stężenia Ca2 +, określenia kinetyki mostka krzyżowego aktyna-miozyna oraz pomiaru biernego napięcia zamontowanych kardiomiocytów na wcześniej określonych długościach sarkomeru (Figura 1). Izolacja permeabilizowanych kardiomiocytów z próbek mięśnia sercowego zamrożonych w ciekłym azocie (a następnie przechowywanych w temperaturze -80 °C) jest techniką wykorzystującą mechanikę komórkową i biochemię białek do pomiaru maksymalnej siły aktywowanej Ca2+ (aktywnej) na pole przekroju poprzecznego (Taktywne, kN∙m-2), napięcia niezależnego od Ca2+ (pasywnego) (T pasywnego, kN∙m-2), czułość miofilamentów Ca2+ (pCa50), kooperatywność miofilamentów (nHill), szybkość przebudowy siły (ktr), a także zależności długości sarkomeru Taktywnego, Tpasywnego, pCa50, nHill i ktr.
Celem tego protokołu jest zilustrowanie i podsumowanie potencjału systemu pomiaru siły kardiomiocytów jako wiarygodnej procedury oceny funkcjonalnych właściwości mechanicznych kardiomiocytów jednoskórnych wyizolowanych z zamrożonych próbek różnych gatunków.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan soli disodowej hydrat (Na2ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia (CaCO3)</td><td>Merck</td><td>1.02067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>VWR</td><td>24720.157</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2.6H2O)</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorku magnezu (MgCl2 1M)</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>N,N-bis(2-hydroksyetylo)tauryna (BES)</td><td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej fosfokreatyny (Na2PCr)</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Merck</td><td>8.14353.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy (C3H6O2)</td><td>Merck</td><td>8.00605.0500</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa rurka do wyciskania</td><td>Marineland</td><td>31003</td><td></td></tr><tr><td>Tritiplex (EGTA)</td><td>Merck</td><td>1.08435.0025</td><td></td></tr><tr><td>Triton&reg; X-100 10%</td> <td>Merck</td><td>648463</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy (GKH GT Motor Control)</td><td>Kontroler długości Terre Haute Glas-col</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(model 315C-I)</td><td>Przetwornik siły Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(model 403 A)</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ASI 600A</td><td>Aurora Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sotware VSL (model 900B)</td><td>Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony Aurora (IX51)</td><td>Olimp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

W tym artykule opisujemy kroki wymagane do wyizolowania pojedynczego permeabilizowanego ("oskórowanego") kardiomiocytu i podłączenia go do aparatu do pomiaru siły oraz silnika w celu przeprowadzenia badań funkcjonalnych. Badania te pozwolą na pomiar sztywności kardiomiocytów (siły biernej) i jej aktywacji różnymi roztworami zawierającymi wapń (Ca2+) w celu określenia m.in.: maksymalnego rozwoju siły, czułości miofilamentu Ca2+ (pCa50), kooperatywności (nHill) oraz szybkości przebudowy siły (ktr). Metoda ta umożliwia również określenie wpływu leków działających bezpośrednio na miofilamenty oraz ekspresji egzogennych białek rekombinowanych zarówno na właściwości aktywne, jak i bierne kardiomiocytów. Klinicznie badania kardiomiocytów ze skórą podkreślają patofizjologię wielu chorób mięśnia sercowego i umożliwiają ocenę in vitro wpływu interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na mięśnie sercowe. Podsumowując, technika ta umożliwia wyjaśnienie patofizjologii serca poprzez badanie korelacji między parametrami in vitro i in vivo w modelach zwierzęcych a tkankami ludzkimi uzyskanymi podczas operacji na otwartym sercu lub przeszczepu.

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Technika ta umożliwia wyjaśnienie patofizjologii chorób serca poprzez badanie korelacji między parametrami in vitro i in vivo w modelach zwierzęcych i ludzkich. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie funkcji głębokich miofilamentów przy użyciu bardzo małych biopsji lub próbek, które były przechowywane w stanie zamrożonym. Technika ta pozwala na ocenę in vitro wpływu interwencji terapeutycznych na miofilamenty.Przed przystąpieniem do eksperymentu zaleca się kilkukrotne przećwiczenie ekstrakcji kardiomiocytów, aby nauczyć się wybierać, sklejać i aktywować kardiomiocyty o dobrym rozmiarze, prążkowaniu i kształcie. Przed przystąpieniem do zabiegu należy wyregulować temperaturę aparatury badawczej w komorze do 15 stopni Celsjusza i włączyć przetwornik siły oraz silnik. Rozmrozić od trzech do pięciu mikrogramów próbki mięśnia sercowego na szalce Petriego zawierającej 2,5 mililitra relaksującego roztworu ISO i użyć skalpela, aby precyzyjnie pociąć tkankę na małe kawałki, nie powodując niepotrzebnego uszkodzenia komórek.Gdy cała tkanka zostanie przecięta, użyj przeciętej końcówki pipety, aby przenieść całą objętość roztworu i fragmenty tkanki do szkła Pottera-Elvehjema i użyj młynka, aby mechanicznie rozbić tkankę z prędkością od 30 do 40 obrotów na minutę. Po uzyskaniu dobrej zawiesiny komórek dodaj 250 mikrolitrów Tritonu do 15-mililitrowej probówki zawierającej 2,25 mililitra relax ISO i dodaj zawiesinę komórek do powstałego roztworu. Delikatnie odwróć probówkę trzy razy, aby wymieszać i pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na jedną minutę, a następnie wykonaj czterominutową inkubację na lodzie.Pod koniec inkubacji lodu doprowadzić końcową objętość probówki do 15 mililitrów z dodatkowym ISO relaksacyjnym i trzykrotnie wymieszać probówki przez odwrócenie, jak pokazano, następnie odwirować komórki, a następnie ostrożnie usunąć prawie cały płyn z wyjątkiem ostatnich trzech mililitrów supernatantu. Po ostatnim wypłukaniu usunąć supernatant do objętości od pięciu do 10 mililitrów zawiesiny komórek. W przypadku selekcji kardiomiocytów ze skórą, dodaj kroplę zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe umieszczone na szkiełku podstawowym w odwróconym uchwycie na szkiełko mikroskopowe i użyj obiektywu 20X, aby wybrać pojedynczy kardiomiocyt w kształcie pręcika o dobrym układzie prążkowania i rozmiarze.Za pomocą dwóch rąk obróć szkiełko nakrywkowe, aż wybrany kardiomiocyt zostanie ustawiony poziomo z końcami wyrównanymi z igłą przetwornika siły i silnikiem, a następnie użyj końcówki pipety, aby umieścić cienką linię kleju wzdłuż boku szkiełka nakrywkowego. Aby skleić komórkę na miejscu, zanurz końcówki igieł przetwornika siły i silnika w linii kleju, aby utworzyć aureolę kleju wokół obu końcówek i szybko przesuń końcówkę igły przetwornika siły w dół, tak aby przykleiła się do jednej krawędzi kardiomiocytu. Powtórz tę procedurę z końcówką silnika i drugim końcem komórki.Po pięciu do ośmiu minutach przesuń oba mikromanipulatory jednocześnie, aby podnieść igły o około 15 mikrometrów, aby uniknąć przyklejania komórki do szkiełka nakrywkowego. Aby zmierzyć siły czynne i bierne oraz wrażliwość na wapń, należy napełnić pierwszą studzienkę doświadczalną 55 do 100 mikrolitrami roztworu relaksującego, a drugą studzienkę doświadczalną napełnić 55 do 100 mikrolitrami roztworu aktywującego. Za pomocą oprogramowania kamery ustaw obszar zainteresowania na obszar kardiomiocytu z wyraźnym wzorem prążkowania i ustaw długość sarkomeru na 2,2 mikrometra.Zmierz odległość między dwoma skrajnościami kardiomiocytu i zapisz wartość jako długość miocytów w oprogramowaniu. Następnie przesuń igły nieco wyżej i delikatnie przesuń stolik mikroskopu, tak aby komórka przesunęła się od szkiełka nakrywkowego do studzienki zawierającej roztwór relaksujący z tyłu stolika. Wybierz protokół, który zawiera skrócenie dwóch komórek, które ma nastąpić, gdy komórka jest sekwencyjnie wyłaniana w roztworach wapnia i relaksujących.Aby wywołać skurcz izometryczny, przesuń stolik mikroskopu tak, aby kardiomiocyt przesunął się z roztworu relaksującego do aktywującego. Po osiągnięciu plateau siły rozpocznij rejestrowanie danych siły. Po 10 sekundach przełącz komórkę na roztwór relaksujący i zapisuj dane do momentu zatrzymania testu.Aby określić wrażliwość na wapń, należy zastąpić roztwór aktywujący 55 do 100 mikrolitrami każdego roztworu wapnia i zapisać dane, jak pokazano poniżej. Pod koniec pomiaru rozciągnij końcówki przetwornika siły i silnika, aby usunąć igły z komórki i użyj bawełnianego wacika nasączonego acetonem, aby ostrożnie usunąć aureolę kleju z końcówek igły. Chociaż po długotrwałych eksperymentach spodziewany jest pewien stopień pogorszenia i zmniejszenia siły, wartości napięcia czynnego w funkcjonalnych permeabilizowanych kardiomiocytach powinny być względnie stabilne.W tym miejscu pokazano reprezentatywne ślady siły trzech z ośmiu zapisów siły potrzebnych do przeprowadzenia protokołu wrażliwości miofilamentu na wapń. Przenosząc komórkę do studzienki zawierającej roztwór aktywujący, kardiomiocyty zaczynają wytwarzać siłę, aż osiągną plateau. Po szybkim teście luzu można uzyskać wartości bazowe siły zerowej.Nachylenie ostatniej części tej krzywej można wykorzystać do określenia wartości szybkości przebudowy siły, która jest miarą pozornej szybkości mocowania i odłączania mostu poprzecznego. Po przeniesieniu komórki z powrotem do studzienki zawierającej roztwór relaksujący, komórka rozluźnia się, a jej siła spada. Oprócz wrażliwości miofilamentu na wapń i pomiarów aktywacji zależnej od długości, można obliczyć zależności długości sarkomeru od napięcia biernego i zależności długości sarkomeru siły aktywowanej wapniem na pole przekroju poprzecznego oraz napięcie niezależne od wapnia.Na koniec należy zauważyć, że sposób, w jaki kardiomiocyty są izolowane, znacząco wpływa na wyniki. Wykorzystanie kardiomiocytów ze skórą do oceny funkcji serca in vitro jest ważną techniką wyjaśniającą zmiany zachodzące na poziomie komórkowym, a także badającą mechanizmy miofilamentów w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych. Ta metoda ma tę zaletę, że wymaga minimalnej ilości próbki mięśnia sercowego i pozwala na użycie kardiomiocytów z szerokiego zakresu gatunków, lokalizacji serca i patologii.

in-vitro-assessment-of-cardiac-function-using-skinned-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Nasierdzie jest niezbędnym źródłem multipotencjalnych komórek progenitorowych układu sercowo-naczyniowego i czynników parakrynnych, które są niezbędne do rozwoju i regeneracji układu sercowo-naczyniowego. Opisujemy tutaj metodę hodowli embrionalnych komórek nasierdziowych myszy.

In vitro Hodowla komórek nasierdzia z zarodka serca myszy

Tutaj pokazujemy generowanie ludzkiej tkanki serca z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pochodzących z kardiomiocytów. Przedstawiono metodę analizy siły skurczu oraz przykładową zmianę wzorca skurczu przez inhibitor kanału hERG E-4031. Metoda ta wykazuje wysoki poziom odporności i przydatności do badań przesiewowych leków sercowych.

Zautomatyzowana analiza skurczów ludzkiej zmodyfikowanej tkanki serca do badań przesiewowych bezpieczeństwa leków sercowych

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Prezentujemy model choroby niedokrwiennej serca za pomocą kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, wraz z metodą ilościowej oceny uszkodzeń tkanek spowodowanych niedokrwieniem. Model ten może stanowić użyteczną platformę do badań przesiewowych leków i dalszych badań nad chorobą niedokrwienną serca.

Model choroby niedokrwiennej serca i porównanie wideo skurczu kardiomiocytów przy użyciu kardiomiocytów pochodzących z hiPSC

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Opisujemy tutaj, założenie i zastosowanie mysiej linii reporterowej Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (określanej poniżej jako αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) do oceny przeprogramowania serca. Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) wyizolowane ze szczepu myszy są przekształcane w indukowane kardiomiocyty (iCM), co pozwala na wygodną i efektywną ocenę skuteczności przeprogramowania i funkcjonalnego dojrzewania iCM poprzez strumień wapnia (Ca2+).

Ocena in vitro przeprogramowania serca poprzez pomiar specyficznego dla serca strumienia wapnia za pomocą reportera GCaMP3

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) stanowią alternatywę dla wykorzystywania zwierząt do przedklinicznych badań przesiewowych kardiotoksyczności. Ograniczeniem dla powszechnego stosowania hiPSC-CM w przedklinicznych badaniach przesiewowych toksyczności jest niedojrzały, podobny do płodu fenotyp komórek. Poniżej przedstawiono protokoły solidnego i szybkiego dojrzewania hiPSC-CM.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe kardiotoksyczności z wykorzystaniem dojrzałych, indukowanych przez człowieka monowarstw kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Poznaj metodę oceny czynności serca in vitro przy użyciu kardiomiocytów ze skórą. Technika ta umożliwia badanie funkcji miofilamentów z małych biopsii i ocenę interwencji terapeutycznych.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Przeglądaj więcej filmów