Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Technika ta umożliwia wyjaśnienie patofizjologii chorób serca poprzez badanie korelacji między parametrami in vitro i in vivo w modelach zwierzęcych i ludzkich. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie funkcji głębokich miofilamentów przy użyciu bardzo małych biopsji lub próbek, które były przechowywane w stanie zamrożonym. Technika ta pozwala na ocenę in vitro wpływu interwencji terapeutycznych na miofilamenty.

Przed przystąpieniem do eksperymentu zaleca się kilkukrotne przećwiczenie ekstrakcji kardiomiocytów, aby nauczyć się wybierać, sklejać i aktywować kardiomiocyty o dobrym rozmiarze, prążkowaniu i kształcie. Przed przystąpieniem do zabiegu należy wyregulować temperaturę aparatury badawczej w komorze do 15 stopni Celsjusza i włączyć przetwornik siły oraz silnik. Rozmrozić od trzech do pięciu mikrogramów próbki mięśnia sercowego na szalce Petriego zawierającej 2,5 mililitra relaksującego roztworu ISO i użyć skalpela, aby precyzyjnie pociąć tkankę na małe kawałki, nie powodując niepotrzebnego uszkodzenia komórek.

Gdy cała tkanka zostanie przecięta, użyj przeciętej końcówki pipety, aby przenieść całą objętość roztworu i fragmenty tkanki do szkła Pottera-Elvehjema i użyj młynka, aby mechanicznie rozbić tkankę z prędkością od 30 do 40 obrotów na minutę. Po uzyskaniu dobrej zawiesiny komórek dodaj 250 mikrolitrów Tritonu do 15-mililitrowej probówki zawierającej 2,25 mililitra relax ISO i dodaj zawiesinę komórek do powstałego roztworu. Delikatnie odwróć probówkę trzy razy, aby wymieszać i pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na jedną minutę, a następnie wykonaj czterominutową inkubację na lodzie.

Pod koniec inkubacji lodu doprowadzić końcową objętość probówki do 15 mililitrów z dodatkowym ISO relaksacyjnym i trzykrotnie wymieszać probówki przez odwrócenie, jak pokazano, następnie odwirować komórki, a następnie ostrożnie usunąć prawie cały płyn z wyjątkiem ostatnich trzech mililitrów supernatantu. Po ostatnim wypłukaniu usunąć supernatant do objętości od pięciu do 10 mililitrów zawiesiny komórek. W przypadku selekcji kardiomiocytów ze skórą, dodaj kroplę zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe umieszczone na szkiełku podstawowym w odwróconym uchwycie na szkiełko mikroskopowe i użyj obiektywu 20X, aby wybrać pojedynczy kardiomiocyt w kształcie pręcika o dobrym układzie prążkowania i rozmiarze.

Za pomocą dwóch rąk obróć szkiełko nakrywkowe, aż wybrany kardiomiocyt zostanie ustawiony poziomo z końcami wyrównanymi z igłą przetwornika siły i silnikiem, a następnie użyj końcówki pipety, aby umieścić cienką linię kleju wzdłuż boku szkiełka nakrywkowego. Aby skleić komórkę na miejscu, zanurz końcówki igieł przetwornika siły i silnika w linii kleju, aby utworzyć aureolę kleju wokół obu końcówek i szybko przesuń końcówkę igły przetwornika siły w dół, tak aby przykleiła się do jednej krawędzi kardiomiocytu. Powtórz tę procedurę z końcówką silnika i drugim końcem komórki.

Po pięciu do ośmiu minutach przesuń oba mikromanipulatory jednocześnie, aby podnieść igły o około 15 mikrometrów, aby uniknąć przyklejania komórki do szkiełka nakrywkowego. Aby zmierzyć siły czynne i bierne oraz wrażliwość na wapń, należy napełnić pierwszą studzienkę doświadczalną 55 do 100 mikrolitrami roztworu relaksującego, a drugą studzienkę doświadczalną napełnić 55 do 100 mikrolitrami roztworu aktywującego. Za pomocą oprogramowania kamery ustaw obszar zainteresowania na obszar kardiomiocytu z wyraźnym wzorem prążkowania i ustaw długość sarkomeru na 2,2 mikrometra.

Zmierz odległość między dwoma skrajnościami kardiomiocytu i zapisz wartość jako długość miocytów w oprogramowaniu. Następnie przesuń igły nieco wyżej i delikatnie przesuń stolik mikroskopu, tak aby komórka przesunęła się od szkiełka nakrywkowego do studzienki zawierającej roztwór relaksujący z tyłu stolika. Wybierz protokół, który zawiera skrócenie dwóch komórek, które ma nastąpić, gdy komórka jest sekwencyjnie wyłaniana w roztworach wapnia i relaksujących.

Aby wywołać skurcz izometryczny, przesuń stolik mikroskopu tak, aby kardiomiocyt przesunął się z roztworu relaksującego do aktywującego. Po osiągnięciu plateau siły rozpocznij rejestrowanie danych siły. Po 10 sekundach przełącz komórkę na roztwór relaksujący i zapisuj dane do momentu zatrzymania testu.

Aby określić wrażliwość na wapń, należy zastąpić roztwór aktywujący 55 do 100 mikrolitrami każdego roztworu wapnia i zapisać dane, jak pokazano poniżej. Pod koniec pomiaru rozciągnij końcówki przetwornika siły i silnika, aby usunąć igły z komórki i użyj bawełnianego wacika nasączonego acetonem, aby ostrożnie usunąć aureolę kleju z końcówek igły. Chociaż po długotrwałych eksperymentach spodziewany jest pewien stopień pogorszenia i zmniejszenia siły, wartości napięcia czynnego w funkcjonalnych permeabilizowanych kardiomiocytach powinny być względnie stabilne.

W tym miejscu pokazano reprezentatywne ślady siły trzech z ośmiu zapisów siły potrzebnych do przeprowadzenia protokołu wrażliwości miofilamentu na wapń. Przenosząc komórkę do studzienki zawierającej roztwór aktywujący, kardiomiocyty zaczynają wytwarzać siłę, aż osiągną plateau. Po szybkim teście luzu można uzyskać wartości bazowe siły zerowej.

Nachylenie ostatniej części tej krzywej można wykorzystać do określenia wartości szybkości przebudowy siły, która jest miarą pozornej szybkości mocowania i odłączania mostu poprzecznego. Po przeniesieniu komórki z powrotem do studzienki zawierającej roztwór relaksujący, komórka rozluźnia się, a jej siła spada. Oprócz wrażliwości miofilamentu na wapń i pomiarów aktywacji zależnej od długości, można obliczyć zależności długości sarkomeru od napięcia biernego i zależności długości sarkomeru siły aktywowanej wapniem na pole przekroju poprzecznego oraz napięcie niezależne od wapnia.

Na koniec należy zauważyć, że sposób, w jaki kardiomiocyty są izolowane, znacząco wpływa na wyniki. Wykorzystanie kardiomiocytów ze skórą do oceny funkcji serca in vitro jest ważną techniką wyjaśniającą zmiany zachodzące na poziomie komórkowym, a także badającą mechanizmy miofilamentów w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych. Ta metoda ma tę zaletę, że wymaga minimalnej ilości próbki mięśnia sercowego i pozwala na użycie kardiomiocytów z szerokiego zakresu gatunków, lokalizacji serca i patologii.