Name: Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Naucz się izolować mitochondria z tkanek raka jajnika i kontrolnych przy użyciu wirowania różnicowego oraz gradientu gęstości. Ta metoda umożliwia ilościową analizę proteomiczną i odkrywanie biomarkerów nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Hunan Provincial Hundred Talent Plan (do X.Z.), Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (do XZ), National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81572278 i 81272798 do XZ), granty z China "863" Plan Project (Grant nr 2014AA020610-1 dla XZ) oraz Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant nr 14JJ7008 dla XZ). X.Z. opracował koncepcję niniejszego manuskryptu, uzyskał ilościowe dane proteomiczne iTRAQ próbek mitochondriów, napisał i zredagował manuskrypt, koordynował odpowiednie prace oraz był odpowiedzialny za wsparcie finansowe i odpowiednie prace. H.L. przygotował próbki mitochondriów. S.Q. uczestniczyła w pracach cząstkowych. X.H.Z brał udział w pisaniu i redagował język angielski. N.L. przeanalizował dane proteomiczne iTROAK. Ostateczny tekst został zatwierdzony przez wszystkich autorów.

Próbki tkanki jajnikowej, w tym tkanki raka jajnika (n = 7) i normalne kontrolne tkanki jajnika (n = 11) zostały użyte do tego protokołu. Obecny protocol3,4,5 jest zatwierdzony przez Komitet Etyki Medycznej Szpitala Xiangya Uniwersytetu Central South w Chinach.
1. Przygotowanie mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika
<ol>
	<li>Przygotować 250 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego, mieszając 210 mM mannitolu, 70 mM sacharozy, 100 mM chlorku potasu (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM kwasu diaminotetraoctowego (EDTA), 0,1 mM glikolu etylenowego kwasu bis(2-aminoetylowego)tetraoctowego (EGTA), 1 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), 2 mM ortowanadanu sodu (V) i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), Odczyn pH 7,4.</li>
	<li>Umieść ~1,5 g tkanek raka jajnika w czystym szklanym naczyniu.</li>
	<li>Dodaj 2 ml wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby 3x delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki.</li>
	<li>Użyj czystych nożyczek okulistycznych, aby całkowicie zmielić tkankę na około 1 mm3 kawałki i przenieś zmielone tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 13,5 ml buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,2 mg/ml nagarzyny, a następnie użyć homogenizatora elektrycznego do homogenizacji (użyj skali 2, 10 s 6x, odstęp 10 s) zmielonych tkanek (2 min, 4 °C).</li>
	<li>Dodać kolejne 3 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkankowych i dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Odwirować przygotowany homogenat tkankowy (1,300 x g, 10 min, 4 °C). Usunąć surową frakcję jądrową (tj. osad) i zachować supernatant.</li>
	<li>Odwirować supernatant (10 000 x g, 10 min, 4 °C). Usuń mikrosomy (tj. supernatant) i zachowaj osad.</li>
	<li>Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego i dobrze zawiesić osad przez lekkie pipetowanie.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę osadów (7 000 x g, 10 min, 4 °C). Odrzuć supernatant i zachowaj surowe mitochondria (tj. osad).</li>
	<li>Dodaj 12 ml pożywki o gradiencie gęstości 25% (tj. Nycodenz), aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria.</li>
	<li>Wykonaj nieciągły gradient gęstości, wypełniając probówkę od dołu do góry 5 ml 34%, 8 ml 30%, 12 ml 25% (zawierającej surowe mitochondria z kroku 1.11), 8 ml 23% i 3 ml pożywki o 20% gradiencie gęstości i odwiruj ją (52 000 x g, 90 min, 4 °C).</li>
	<li>Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria na granicy między pożywką o gradiencie gęstości 25% i 30% do czystej probówki.</li>
	<li>Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości. Odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego w celu ponownego zawieszenia osadu i odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zachować osad.</li>
	<li>Zebrać ostateczną osadkę (tj. oczyszczone mitochondria) i przechowywać ją w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Połącz wszystkie oczyszczone mitochondria z tkanki raka jajnika jako próbkę mitochondriów do ilościowej analizy proteomicznej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mitochondriów z ludzkich tkanek kontrolnych jajnika
<ol>
	<li>Przygotować 250 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
	<li>Umieść ~1,5 g normalnych kontrolnych tkanek jajnika w czystym szklanym naczyniu.</li>
	<li>Dodaj 2 ml wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby 3x delikatnie zmyć krew z powierzchni tkanki.</li>
	<li>Użyj czystych nożyczek okulistycznych, aby całkowicie zmielić tkankę na około 1 mm3 kawałki i przenieś zmielone tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 8 ml 0,05% trypsyny/20 mM EDTA w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) do zmielonych tkanek kontrolnych i trawić (30 min, temperatura pokojowa), co pomaga w lizie tkanek i komórek oraz uwolnieniu mitochondriów. Następnie odwirować (200 x g, 5 min). Odrzucić supernatant i zachować tkanki i komórki.</li>
	<li>Dodać 13,5 ml buforu do izolacji mitochondriów zawierającego 0,2 mg/ml nagarzyny, a następnie użyć homogenizatora elektrycznego do homogenizacji (użyj skali 2, 10 s 6x, odstęp 10 s) zmielonych tkanek (2 min, 4 °C).</li>
	<li>Dodać kolejne 3 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkankowych i dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Odwirować przygotowany homogenat tkankowy (1 300 x g, 10 min, 4°C). Usunąć surową frakcję jądrową (tj. osad) i zachować supernatant.</li>
	<li>Odwirować supernatant (10 000 x g, 10 min, 4°C). Usuń mikrosomy (tj. supernatant) i zachowaj osad.</li>
	<li>Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego, aby dobrze zawiesić osad przez lekkie pipetowanie.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę osadów (7 000 x g, 10 min, 4 °C). Odrzuć supernatant i zachowaj surowe mitochondria (tj. osad).</li>
	<li>Dodaj 12 ml pożywki o gradiencie gęstości 25%, aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria.</li>
	<li>Wykonaj nieciągły gradient gęstości, wypełniając probówkę od dołu do góry 8 ml 38%, 5 ml 34%, 8 ml 30%, 12 ml 25% (zawierającej surowe mitochondria z kroku 2.12), 8 ml 23% i 3 ml pożywki o 20% gradiencie gęstości i odwiruj ją (52 000 x g, 90 min, 4 °C).</li>
	<li>Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria w zakresie od granicy faz od 25% do 30% do granicy faz od 34% do 38% do czystej probówki.</li>
	<li>Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości. Odwirować (15 000 x g, 20 min, 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 2 ml mitochondrialnego buforu izolacyjnego w celu ponownego zawieszenia osadu i odwirować go (15 000 x g, 20 min, 4 °C). Odrzucić supernatant i zachować osad.</li>
	<li>Zebrać ostateczną osadkę (tj. oczyszczone mitochondria) i przechowywać ją w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Połącz wszystkie oczyszczone mitochondria z kontrolnej tkanki jajnika jako próbki mitochondrialne do ilościowej analizy proteomicznej.</li>
</ol>
3. Weryfikacja jakości oczyszczonych próbek mitochondriów tkanek
<ol>
	<li>Pobrać probówkę z oczyszczonymi próbkami mitochondrialnymi (tj. granulkami z tkanek raka jajnika z kroku 1.16 i tkankami kontrolnymi jajnika z kroku 2.17) w celu weryfikacji za pomocą mikroskopii elektronowej (EM). 
	UWAGA: Szczegółowy protokół został opisany wcześniej15,16.</li>
	<li>Przygotować bufor do ekstrakcji białek mitochondrialnych, mieszając 8 M mocznika, 2 M tiomocznik, 40 mM Tris, 1 mM EDTA, 130 mM ditiotreitolu (DTT) i 4% (w:v) 3-((3-cholamidopropylo)dimetyloamonio)-1-propanosulfonianu (CHAPS). Dostosuj pH do 8,52.</li>
	<li>Weź probówkę z oczyszczonymi próbkami mitochondrialnymi (tj. granulkami z tkanek raka jajnika w kroku 1.16 i kontrolnymi tkankami jajnika w kroku 2.17) i dodaj bufor do ekstrakcji białek mitochondrialnych (próbki mitochondrialne do buforu do ekstrakcji białek, 1:5) w celu ponownego zawieszenia osadu. Próbki należy 3x zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Odwirować przy 12 000 x g, 30 min, 4 °C, zebrać supernatant (tj. wyekstrahowaną próbkę białka mitochondrialnego) i zmierzyć zawartość białka za pomocą zestawu do oznaczania białka kwasu bicinchoninowego (BCA).</li>
	<li>Przygotować 50 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), mieszając 9,08 g Tris i 40 ml ddH2O, dostosowując pH do 8,8 za pomocą HCl i dodając ddH2O do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8), mieszając 6,06 g Tris i 40 ml ddH2O, dostosowując pH do 6,8 za pomocą HCl i dodając ddH2O do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 100 ml 30% roztworu akryloamidu-bis, mieszając 29 g akrylamidu, 1 g bis-akrylamidu i 80 ml ddH2O i dodając ddH2O do końcowej objętości 100 ml. Przechowywać w brązowej butelce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 1,000 ml 10x buforu do elektroforezy tris-glicyny, mieszając 29 g glicyny, 58 g Tris, 3,7 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 800 ml ddH2O, a następnie dodając ddH2O do końcowej objętości 1,000 ml.</li>
	<li>Przygotować 10 ml buforu ładującego, mieszając 2 ml gliceryny, 0,02 g błękitu bromofenolowego, 0,4 g SDS, 2 ml Tris-HCl pH 6,8 i 7 ml ddH2O, a następnie dodając ddH2O do końcowej objętości 10 ml.</li>
	<li>Przygotować 10 ml 10% żelu rozdzielczego w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), mieszając 4 ml ddH2O, 3,3 ml 30% roztworu akryloamidu-Bis, 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,1 ml 10% SDS, 0,1 ml 10% nadsiarczanu amonu i 0,004 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Wlej rozdzielczy roztwór żelu SDS-PAGE do płytki między szklanymi płytkami do poziomu dna grzebienia. Dodaj 2 ml alkoholu izopropylowego na wierzch. Pozostaw na 30 min.</li>
	<li>Usuń alkohol izopropylowy i umyj wierzch ddH2O 3x. Wlej 5% roztwór żelu o stężeniu zawierającym 4,1 ml ddH2O, 1,0 ml 30% roztworu acyloamidu-bis, 0,75 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,06 ml 10% SDS, 0,06 ml 10% nadsiarczanu amonu i 0,006 ml TEMED. Natychmiast włóż grzebień do roztworu żelu o zatężeniu, pozostaw na 30 minut, a następnie wyjmij grzebień.</li>
	<li>Przygotować 1x bufor do elektroforezy tris-glicyny, rozcieńczając 100 ml 10x buforu do elektroforezy tris-glicyny 900 ml ddH2O i wlać do zbiornika elektroforetycznego.</li>
	<li>Wymieszać 30 μg białek mitochondrialnych z raka jajnika i kontrolować tkanki jajnika z kroku 3.4 za pomocą buforu ładującego, aby osiągnąć końcową objętość 20 μl. Gotuj mieszaninę przez 5 minut, a następnie oddziel ją za pomocą 10% żelu rozdzielczego SDS-PAGE przy stałym napięciu 100 V. Gdy błękit bromfenolowy dotrze do dna, przerwij elektroforezę.</li>
	<li>Przygotować 1,5 l elektroforetycznego buforu transferowego, mieszając 150 ml 10x buforu do elektroforezy tris-glicyny, 1,050 ml ddH2O i 300 ml metanolu.</li>
	<li>Namoczyć membranę PVDF w 100% metanolu na 10 minut i w elektroforetycznym buforze transferowym na co najmniej 5 minut. Namoczyć pięć arkuszy bibuły filtracyjnej w 1x elekroforetycznym buforze transferowym na co najmniej 5 minut.</li>
	<li>Wyjąć żel SDS-PAGE zawierający białka i zanurzyć go w buforze elektroforetycznym na 10 minut.</li>
	<li>Wykonaj kasetę transferową, umieszczając mokrą gąbkę na białej płytce, trzech arkuszach mokrej bibuły filtracyjnej, membranie PVDF, żelu SDS-PAGE z białkami, dwóch arkuszach mokrej bibuły filtracyjnej i mokrej gąbce od dołu do góry. Unikaj pęcherzyków.</li>
	<li>Umieść kasetę transferową w zbiorniku elektroforetycznym, wlej elektroforetyczny bufor transferowy, a następnie przenoś przez 2 godziny pod stałym prądem 200 mA.</li>
	<li>Przygotować 10x roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowany przez Tris (TBS), mieszając 12,114 g Tris, 29,22 g NaCl i dodając ddH2O do końcowej objętości 500 ml. Przygotuj 2 litry 1x TBST, mieszając 200 ml 10x TBS, 2 ml Tween-20 i 1,798 ml ddH2O. Przygotuj 100 ml roztworu blokującego, mieszając 100 ml TBST i 5 g BSA.</li>
	<li>Po przeniesieniu wyjmij membranę PVDF, umyj ją lekko w TBST przez 5 minut, a następnie zablokuj w roztworze blokującym na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę PVDF (4 °C przez noc) z różnymi pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla różnych organelli subkomórkowych, w tym laminą B (jądro komórkowe; kozie przeciwciało anty-ludzkie 1: 1000 roztwór blokujący), flotyliną-1 (cytomembrana; roztwór blokujący przeciwciało przeciw człowiekowi królikowi 1:500), COX4I1 (mitochondrium; króliczy roztwór blokujący anty-ludzki 1:1,000), GM130 (aparat Golgiego; mysie przeciwciało anty-ludzkie 1:1,000 roztwór blokujący), katalaza (peroksysom; królicze przeciwciało anty-ludzkie 1: 1,000 roztworu blokującego) i katepsyna B (lizosom; królicze przeciwciało anty-ludzkie 1:1,000 roztwór blokujący). Lekko prać w TBST przez 5 min 3x.</li>
	<li>Inkubować membranę PVDF przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (anty-kozioł królika, kozioł anty-królik lub kozioł anty-mysz). Lekko prać w TBST przez 5 min 3x. Wizualizacja za pomocą elektrochemiluminescencji (ECL).</li>
</ol>
4. Analiza iTRAQ-SCX-LC-MS/MS
UWAGA: Szczegółowe procedury dla sekcji 4 odnoszą się do instrukcji iTRAQ (Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Dodać bufor SDT (4% SDS, 100 mM Tris-HCl pH 7,6 i 100 mM DTT) do oczyszczonych próbek mitochondrialnych (tj. granulek z tkanek raka jajnika z kroku 1.16 i tkanek kontrolnych jajnika z kroku 2.17). Wirować próbkę, aż nie będzie widocznego osadu. 
	UWAGA: Stosunek próbki mitochondrialnej do bufora SDT powinien wynosić 1:5.</li>
	<li>Gotować próbkę poddaną działaniu SDT przez 5 minut, schłodzić próbkę na lodzie, a następnie odwirować (2 000 x g, 2 min).</li>
	<li>Zebrać supernatant jako wyekstrahowane próbki białka mitochondrialnego i zmierzyć zawartość białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.</li>
	<li>Weź białka mitochondrialne ekstrahowane SDT (200 μg z każdej próbki) do redukcji, alkilacji, trawienia trypsyną, odsalania i liofilizacji3,4. Wykonać trzy powtórzenia dla każdej próbki.</li>
	<li>Potraktuj peptydy tryptyczne (100 μg każdej próbki) z kroku 4.4 100 mM roztworem bromku tetraetyloamoniowego (pH 8,5) i oznacz peptydy tryptyczne jednym z odczynników iTRAQ 6-plex zgodnie z jego instrukcjami3,4. Oznacz każdą próbkę 3 razy.</li>
	<li>Wymieszaj równo 6 znakowanych próbek peptydu tryptycznego (trzy z tkanek raka jajnika i trzy z kontrolnych tkanek jajnika) i wysusz za pomocą koncentratora próżniowego.</li>
	<li>Frakcjonować zmieszane peptydy znakowane iTRAQ za pomocą chromatografii SCX na 60 frakcji (jedna frakcja na 1 minutę), a następnie łączyć co dwie frakcje jako próbkę frakcjonowaną SCX (n = 30).</li>
	<li>Poddaj każdą próbkę frakcjonowaną SCX analizie LC-MS/MS na spektrometrze mas3,4 sprzężona z systemem nano LC w 60-minutowym gradiencie separacji LC, aby uzyskać dane MS/MS.</li>
	<li>Przeszukaj dane MS/MS w celu zidentyfikowania białek za pomocą wyszukiwarki (Tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj intensywności jonów reporterowych iTRAQ do ilościowego określenia każdego białka i określenia mitochondrialnych białek o zróżnicowanej ekspresji (mtDEP) ze zmianą >1,5 lub <-1,5 krotności i p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Availability+of+healthcare+resources+and+epithelial+ovarian+cancer+stage+of+diagnosis+and+mortality+among+Blacks+and+Whites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites.</a> Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).</li>
<li>Gadducci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+procedures+for+patients+treated+for+epithelial+ovarian+cancer%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecological+Cancer%22%5BJournal%5D)">Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature.</a> International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).</li>
<li>Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+mitochondrial+proteome+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas.</a> Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).</li>
<li>Li, N., Zhan, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lncRNA+SNHG3+regulates+energy+metabolism+of+ovarian+cancer+by+an+analysis+of+mitochondrial+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes.</a> Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).</li>
<li>Li, N., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathway+network+alterations+in+human+ovarian+cancers+identified+with+quantitative+mitochondrial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics.</a> EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).</li>
<li>Deng, P., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+cancer%3A+Potential+roles+of+ATF5+and+the+mitochondrial+UPR%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR.</a> Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).</li>
<li>Georgieva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+redox+imbalance+as+a+diagnostic+marker+of+%22free+radical+diseases%22%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases".</a> Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).</li>
<li>Sotgia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mitochondrial+based+oncology+platform+for+targeting+cancer+stem+cells+%28CSCs%29%3A+MITO-ONC-RX%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX.</a> Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individualized+metabolic+profiling+stratifies+pancreatic+and+biliary+tract+cancer%3A+a+useful+tool+for+innovative+screening+programs+and+predictive+strategies+in+healthcare%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare.</a> EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).</li>
<li>Zhan, X., Long, Y., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+variations+in+proteome+and+metabolome+for+predictive+diagnostics+and+personalized+treatment+algorithms%3A+Innovative+approach+and+examples+for+potential+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application.</a> Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).</li>
<li>Lu, M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crucial+role+of+multiomic+approach+in+cancer+research+and+clinically+relevant+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes.</a> EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).</li>
<li>Hu, R., Wang, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parameter+systematic+strategies+for+predictive%2C+preventive+and+personalised+medicine+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer.</a> EPMA Journal. 4, 2(2013).</li>
<li>Cheng, T., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+for+predictive%2C+preventive%2C+and+personalized+medicine+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EPMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer.</a> EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).</li>
<li>Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentially+mitochondrial+proteomic+dataset+in+human+ovarian+cancer+relative+to+control+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues.</a> Data in Brief. 20, 459-462 (2018).</li>
<li>McMillan, J. D., Eisenback, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+for+analysis+of+mitochondria+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle.</a> Bio-protocol. 8, e2455(2018).</li>
<li>Paul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+TRAF6+inhibits+skeletal+muscle+wasting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).</li>
<li>Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-+and+antioxidant+functions+of+the+peroxisome-mitochondria+connection+and+its+impact+on+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841(2017).</li>
<li>Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome-mitochondria+interplay+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Peroxisome-mitochondria interplay and disease.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).</li>
<li>Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+structure+and+dynamics+by+the+cytoskeleton+and+mechanical+factors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).</li>
<li>Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+characterization+of+mitochondrial+proteome+from+human+T+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).</li>
<li>Zhan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).</li>
<li>Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revival+of+2DE-LC%2FMS+in+proteomics+and+its+potential+for+large-scale+study+of+human+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Med+One%22%5BJournal%5D)">Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms.</a> Med One. 3, e180008(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zmiany mitochondrialne są cechą charakterystyczną raka jajnika. Przygotowanie wysokiej jakości próbek mitochondrialnych z ludzkiego raka jajnika i tkanek kontrolnych do proteomiki ilościowej na dużą skalę przynosi korzyści w dogłębnym zrozumieniu funkcji mitochondriów w patogenezie raka jajnika i zmianach w mitochondrialnej sieci molekularnej, a także pomaga wyjaśnić jego mechanizm molekularny w celu późniejszego odkrycia terapii celowanej i skutecznych biomarkerów opartych na mitochondriach ...

Rak jajnika jest powszechnym nowotworem ginekologicznym o wysokiej śmiertelności, ale niejasnym mechanizmie molekularnym1,2. Większość nowotworów jajnika diagnozuje się w zaawansowanym stadium, co poważnie utrudnia terapię. Zmiany mitochondrialne są cechą charakterystyczną ludzkich nowotworów jajnika, a mitochondria są centrami metabolizmu energetycznego, sygnalizacji komórkowej i stresu oksydacyjnego3,4,5,6,7. Dogłębny wgląd w zmiany proteomu mitochondrialnego w raku jajnika w porównaniu z kontrolną tkanką jajnika przyniesie korzyści w dogłębnym zrozumieniu mechanizmów molekularnych raka jajnika oraz odkryciu skutecznych i wiarygodnych biomarkerów i celów terapeutycznych. Metabolizm mitochondrialny został zaproponowany i uznany za cel terapii przeciwnowotworowej, a terapia antymitochondrialna może ostatecznie być bardzo korzystna w zapobieganiu nawrotom i przerzutom raka8. Indywidualne profilowanie metaboliczne jest już praktykowane jako użyteczne narzędzie do stratyfikacji nowotworów i strategii predykcyjnych9,10.
Długoterminowym celem tych badań jest opracowanie i wykorzystanie ilościowej metody proteomiki mitochondrialnej do badania raka jajnika w celu wyjaśnienia zmian w proteomie mitochondrialnym między rakiem jajnika a tkankami kontrolnymi jajnika oraz zmian ich sieci molekularnej z systematycznego punktu widzenia multiomicznego11,12, co zaowocuje odkryciem biomarkerów molekularnych ukierunkowanych na mitochondria13 W celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych raka jajnika, przewidywania i spersonalizowanego leczenia pacjentek z rakiem jajnika. Znaczniki izobaryczne do oznaczania względnej i bezwzględnej kwantyfikacji (iTRAQ) 3,4 są skuteczną metodą ilościowego określania zmian białek mitochondrialnych. Przygotowanie wysokiej jakości próbek mitochondrialnych z ludzkiego raka jajnika i kontrolnych tkanek jajnika jest warunkiem wstępnym analizy ilościowej proteomów mitochondrialnych iTRAQ3. Preparat mitochondrialny w połączeniu z proteomiką ilościową iTRAQ został z powodzeniem wykorzystany w długoterminowych programach badawczych dotyczących proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika, w tym w ustaleniu map referencyjnych proteomu mitochondrialnego3, analiza profili mitochondrialnych o zróżnicowanej ekspresji4,14 oraz modyfikacje potranslacyjne, w tym fosforylacja, która już doprowadziła do odkrycia ważnych zmian w sieci szlaków sygnałowych w ludzkich nowotworach jajnika5, w tym zmian w metabolizmie energetycznym4, metabolizm lipidów i systemy szlaków mitofagii3.
Poprzednie badania wykazały, że wirowanie o różnicowej prędkości w połączeniu z wirowaniem w gradionym gradiencie gęstości jest skuteczną metodą izolacji i oczyszczania mitochondriów z ludzkiego raka jajnika oraz kontroli tkanek jajnika3,4,5,14. Znakowanie iTRAQ w połączeniu z chromatografią cieczową z silną kationową wymianą (SCX) i chromatografią cieczową (LC)-tandemową spektrometrią mas (MS/MS) jest kluczową techniką wykrywania, identyfikacji i ilościowego oznaczania białek z przygotowanych próbek mitochondrialnych.
Tutaj opisane są szczegółowe protokoły preparacji mitochondriów w połączeniu z proteomiką ilościową iTRAQ. Zostały one z powodzeniem wykorzystane w analizie proteomów mitochondrialnych tkanki ludzkiego raka jajnika. Protokoły obejmują przygotowanie próbek, wirowanie z różnicową prędkością, wirowanie w gradiencie gęstości, ocenę jakości próbek mitochondrialnych, trawienie białek za pomocą trypsyny, znakowanie iTRAK, frakcjonowanie SX, LC, MS/MS, przeszukiwanie baz danych i analizę ilościową białek mitochondrialnych. Co więcej, protokół ten łatwo przekłada się na analizę innych proteomów mitochondrialnych tkanek ludzkich.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Vazyme</td><td>E112</td><td>Zestaw do oznaczania białek BCA to specjalna 3-składnikowa wersja naszych popularnych odczynników BCA, zoptymalizowana do pomiaru (A562nm) całkowitego stężenia białka w rozcieńczonych roztworach białkowych (0,5 do 20 mikrogramów/ml).</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Solarbio</td><td>A8020-5G Frakcja</td><td>szoku cieplnego, pochodzenie australijskie, bez proteazy, niska zawartość kwasów tłuszczowych, niskie IgG, pH 7, &ge; 98%</td></tr> <tr><td>Wirówka</td><td>XiangYi</td><td>TDZ4--WS</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C9426-5G</td><td>BioReagent, odpowiedni do elektroforezy, &ge; 98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) Kwas</td></tr> <tr><td>diaminotetraoctowy (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>798681-100G</td><td>Bezwodny, sypki, Redi-Dri, &ge; 98%</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>1,4-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>Easy nLC</td><td>Proxeon Biosystems (obecnie Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy bis(eter 2-aminoetylowy)kwas tetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-10G</td><td>BioXtra, &ge; 97 .0%</td></tr><tr><td>Homogenizator</td><td>SilentShake</td><td>HYQ-3110</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników iTRAQ</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Applied Biosystems Odczynniki iTRAQ&ndash; Przewodnik po chemii, nr części 4351918A</td></tr><tr><td>Niskotemperaturowa wirówka superszybka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Macklin</td><td>M813424-100G</td><td>Mannitol to poliol (alkohol wielowodorotlenowy) wytwarzany w wyniku uwodornienia fruktozy, który działa jako słodzik, substancja utrzymująca wilgoć i substancja wypełniająca. Ma niską higroskopijność i słabą rozpuszczalność oleju.</td></tr><tr><td>Wyszukiwarka MASCOT</td><td>Matrix Science, Londyn, Wielka Brytania; wersja 2.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nagarse</td><td>Solarbio</td><td>P9090</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksysukcynimid (SDT)</td><td>Sigma</td><td>56480-25G</td><td>Purum, &ge; 97,0% (T)</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Alere/Axis-Shield</td><td>1002424-1</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Solarbio</td><td>P0100-1ML</td><td>PMSF jest inhibitorem proteazy, który reaguje z resztą seryny w celu zahamowania trypsyny, chymotrypsyny, trombiny i papainy.</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Macklin</td><td>P816354-25G</td><td>Chlorek potasu, KCI, znany również jako muriate potasu i sylwit, jest bezbarwnym krystalicznym ciałem stałym o słonym smaku, który topi się w temperaturze 776 stopni; C (1420 Z). Jest rozpuszczalny w wodzie, ale nierozpuszczalny w alkoholu. Chlorek potasu jest stosowany w nawozach, farmaceutykach, fotografii oraz jako substytut soli.</td></tr><tr><td>Proteome Discover 1.4</td><td>Matrix Science, Londyn, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Millipore</td><td>05317</td><td>Jest to 1 rolka, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 &mikro; m wielkości porów, hydrofobowa membrana transferowa PVDF o niskiej fluorescencji tła do western blotting. Jest kompatybilny z sondami fluorescencyjnymi w zakresie widzialnym i podczerwonym.</td></tr><tr><td>Q Exactive spektrometr masowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCX kolumna</td><td>Sigma</td><td>58997</td><td>Jest to 5-&mu; m wielkość cząstek, długość 5 cm i razy; średnica wewnętrzna 4,6 mm (Supelco).</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu (V)</td><td>Macklin</td><td>S817660-25G</td><td>Ortowanadan sodu (Wanadan) jest ogólnym inhibitorem kompetycyjnym dla białkowych fosfataz fosfatyrozylowych. Hamowanie przez ortowanadan sodu jest odwracalne po dodaniu EDTA lub rozcieńczeniu.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Macklin</td><td>S824459-500G</td><td>odczynnik Vetec, 99%</td></tr><tr><td>Thiomocznik</td><td>Sigma</td><td>62-56-6</td><td>ACS, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>Baza Tris</td><td>Baza Sigma</td><td>10708976001</td><td>TRIS jest przydatna w zakresie pH 7,0-9,0. Ma pKa 8,1 przy 25&deg;C.</td></tr><tr><td>Trypsyna (zastosowanie w hodowli komórkowej)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Ten płynny preparat trypsyny zawiera EDTA i czerwień fenolową. Gibco Trypsin-EDTA jest wytwarzany z trypsyny w proszku, napromieniowanej mieszaniny proteaz pochodzących z trzustki świni. Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego pasażowania hodowli komórkowych i pierwotnej dysocjacji tkanek.</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5378-100G</td><td>w proszku, BioReagent, do biologii molekularnej, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr></tbody></table>

przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Rak jajnika to powszechny rak ginekologiczny o wysokiej śmiertelności, ale niejasnym mechanizmie molekularnym. Większość nowotworów jajnika diagnozuje się w zaawansowanym stadium, co poważnie utrudnia terapię. Zmiany mitochondrialne są cechą charakterystyczną ludzkich nowotworów jajnika, a mitochondria są centrami metabolizmu energetycznego, sygnalizacji komórkowej i stresu oksydacyjnego. Dogłębny wgląd w zmiany proteomu mitochondrialnego w raku jajnika w porównaniu z kontrolną tkanką jajnika przyniesie korzyści w dogłębnym zrozumieniu mechanizmów molekularnych raka jajnika oraz odkryciu skutecznych i wiarygodnych biomarkerów i celów terapeutycznych. Przedstawiono skuteczną metodę przygotowania mitochondriów w połączeniu ze znacznikiem izobarycznym do ilościowej proteomiki względnej i bezwzględnej kwantyfikacji (iTRAQ) w celu analizy ludzkiego raka jajnika i kontroli proteomów mitochondrialnych, w tym wirowania o różnej prędkości, wirowania w gradieniu gęstości, oceny jakości próbek mitochondrialnych, trawienia białek trypsyną, znakowania iTRAQ, frakcjonowania silnej kationowymienności (SCX), chromatografii cieczowej (LC), masy tandemowej spektrometria (MS/MS), analiza baz danych i analiza ilościowa białek mitochondrialnych. Udało się zidentyfikować wiele białek, aby zmaksymalizować pokrycie proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika i osiągnąć zróżnicowany profil białek mitochondrialnych w ludzkim raku jajnika.

Wystąpiły różnice w przygotowaniu mitochondriów z tkanek raka jajnika oraz kontrolnych tkanek jajnika. W niniejszym badaniu stwierdzono, że przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika było znacznie łatwiejsze niż z kontrolnych tkanek jajnika3,4. W protokole przygotowania mitochondriów z kontrolnych tkanek jajnika należało wprowadzić pewne ulepszenia. Po pierwsze, przed homogenizacją tkanki konieczne było dodanie 8 mL 0,05% t...

Ten artykuł przedstawia protokół wirowania o różnicowej prędkości w połączeniu z wirowaniem gradientu gęstości w celu oddzielenia mitochondriów od tkanek ludzkiego raka jajnika i kontroli tkanek jajnika do ilościowej analizy proteomicznej, co skutkuje wysokiej jakości próbką mitochondrialną oraz wysokoprzepustową i wysoce odtwarzalną ilościową analizą proteomiczną ludzkiego raka jajnika.

Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Zmiany mitochondrialne odgrywają ważną rolę w ludzkich nowotworach jajnika. Protokół ten ustanawia skuteczną platformę do izolowania i oczyszczania mitochondriów z ludzkiego raka jajnika oraz tkanek kontrolnych do analizy proteomicznej na dużą skalę. Mitochondria, jako centra metabolizmu energetycznego, sygnalizacji komórkowej i stresu oksydacyjnego, wgląd w zmiany proteomu mitochondriów w raku jajnika przynosi korzyści naszemu zrozumieniu mechanizmu molekularnego i jest odkryciem skutecznych biomarkerów i celów terapeutycznych.Technika ta wykorzystuje wirowanie o różnej prędkości w połączeniu z wirowaniem w gradionym gradiencie gęstości w celu oddzielenia mitochondriów od ludzkiego raka jajnika w tkankach kontrolnych, co skutkuje wysokiej jakości próbkami mitochondriów do ilościowej analizy proteomicznej. Preparat mitochondriów, w połączeniu z proteomiką ilościową iTRAQ, został z powodzeniem zastosowany w analizie tkanki ludzkiego raka jajnika, co łatwo przekłada się na analizę innych tkanek, proteomiki mitochondriów. Osoby, które nigdy nie stosowały tej metody, mogą uznać, że wyizolowanie mitochondriów z kontroli jajników może być trudniejsze niż w przypadku tkanek rakowych.Konieczne jest dodanie trypsyny, aby poprawić homogenizację tkanek kontrolnych i dodać dodatkową warstwę pożywki o gradiencie gęstości, aby poprawić separację mitochondriów. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj 250 mililitrów bufora izolacji mitochondriów, jak opisano w protokole tekstowym. Umieść około 1,5 grama tkanek raka jajnika w czystym szklanym naczyniu.Dodaj dwa mililitry wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby lekko zmyć krew z powierzchni tkanki. Powtórz to pranie trzy razy. Następnie użyj czystych nożyczek okulistycznych, aby całkowicie zmielić tkankę na kawałki o wielkości około jednego milimetra sześciennego i przenieść zmielone tkanki do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Dodać 13,5 mililitra mitochondrialnego buforu izolacyjnego zawierającego nagarzę w stężeniu 0,2 miligrama na mililitr. Użyj homogenizatora elektronicznego, aby homogenizować zmielone tkanki przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj kolejne trzy mililitry mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkanek i dobrze je wymieszaj przez pipetowanie.Odwirować przygotowany homogenat tkankowy w temperaturze 1 300 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć osad i zachować supernatant. Następnie odwirować supernatant w temperaturze 10 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Usunąć supernatant zawierający mikrosom i zachować osad. Dodać 2 mililitry mitochondrialnego buforu izolacyjnego i ponownie dokładnie zawiesić osad przez lekkie pipetowanie. Odwirować tę zawiesinę granulek w temperaturze 7 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Odrzucić supernatant i zachować osad, który zawiera surowe mitochondria. Dodaj 12 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości 25%, aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria. Wykonaj nieciągły gradient gęstości zawierający ponownie zawieszone surowe mitochondria, jak opisano w protokole tekstowym, i odwiruj go w temperaturze 52 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut.Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria na granicy między pożywkami gradientowymi 25% i 30% i przenieś je do czystej probówki. Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości. Wirować w temperaturze 15 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.Odrzucić supernatant i zachować osad. Zbierz ostatnią osadkę, która zawiera oczyszczone mitochondria i przechowuj ją w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Najpierw przygotuj 250 mililitrów bufora izolacji mitochondriów, jak opisano w protokole tekstowym.Dodaj około 1,5 grama normalnych kontrolnych tkanek jajnika do czystego szklanego naczynia. Dodaj dwa mililitry wstępnie schłodzonego buforu do izolacji mitochondriów, aby lekko zmyć krew z powierzchni tkanki. Powtórz to pranie trzy razy.Używając czystych nożyczek okulistycznych, całkowicie zmiel tkankę na kawałki o wielkości około 1 milimetra sześciennego i przenieś zmielone tkanki do czystej 50-mililitrowej tuby. Dodaj osiem mililitrów roztworu zawierającego 0,05% trypsyny i 20 milimolowych EDTA i PBS do zmielonych tkanek kontrolnych i trawić w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby pomóc w lizie komórek i uwolnieniu mitochondriów. Wirować przy 200 xg przez pięć minut.Odrzucić supernatant i zachować tkanki i komórki. Dodać 13,5 mililitra mitochondrialnego buforu izolacyjnego zawierającego nagarzę w stężeniu 0,2 miligrama na mililitr i użyć homogenizatora elektrycznego do homogenizacji zmielonych tkanek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie minuty. Dodać kolejne trzy mililitry mitochondrialnego buforu izolacyjnego do homogenatów tkanek i dokładnie wymieszać przez pipetowanie.Odwirować przygotowany homogenat tkankowy w temperaturze 1,300 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Usunąć osad i zachować supernatant. Odwirować supernatant w temperaturze 10 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Usunąć supernatant, który zawiera mikrosomy, i zachować osad. Następnie dodać 2 mililitry mitochondrialnego buforu izolacyjnego i ponownie dokładnie zawiesić osad przez lekkie pipetowanie. Odwirować tę zawiesinę granulek w temperaturze 7 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Odrzucić supernatant i zachować osad zawierający surowe mitochondria. Dodaj 12 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości 25%, aby ponownie zawiesić wyekstrahowane surowe mitochondria. Wykonaj nieciągły gradient gęstości zawierający surowe mitochondria, jak opisano w protokole tekstowym, i odwiruj go w temperaturze 52 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut.Użyj długiej i strzykawki, aby zebrać oczyszczone mitochondria w zakresie od granicy faz między ośrodkami o gradiencie 25 i 30% do granicy faz między ośrodkami o gradinie 34 i 38%. Przenieś oczyszczone mitochondria do czystej probówki. Dodaj bufor izolacyjny mitochondriów do zebranych mitochondriów, aby rozcieńczyć go do trzykrotnej objętości.Wirować przy 15 000 xg i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut i wyrzucić supernatant. Dodaj 2 mililitry buforu do izolacji mitochondriów, aby ponownie zawiesić osad i odwirować w temperaturze 15 000 xg i w czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad.Zbierz ostatnią granulkę i przechowuj ją w temperaturze 20 stopni Celsjusza. W tym badaniu przygotowano wysokiej jakości próbki mitochondrialne z ludzkiego raka jajnika i tkanek kontrolnych do proteomiki ilościowej na dużą skalę. Istnieje kilka różnic w przygotowaniu mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek kontrolnych jajnika, w tym przy użyciu innego nieciągłego gradientu gęstości.Po odwirowaniu oczyszczone mitochondria z tkanek raka jajnika znajdują się na granicy faz od 25% do 30%, podczas gdy te z kontrolnych tkanek jajnika znajdują się w zakresie od granicy faz od 25% do 30%do granicy faz od 34% do 38%Jakość przygotowanych mitochondriów jest następnie oceniana za pomocą wirowania z różnicową prędkością i wirowania w gradiacji gęstości za pomocą mikroskopii elektronowej. Obrazy z mikroskopu elektronowego pokazują, że zarówno w raku jajnika, jak i w tkankach kontrolnych jajnika, głównymi izolowanymi organellami są mitochondria, z wyjątkiem niewielkiej ilości peroksysomów. Jednak zaobserwowano, że morfologia mitochondriów zmienia się bardziej w przypadku raka jajnika niż w tkance kontrolnej jajnika.Jakość przygotowanych mitochondriów jest również oceniana za pomocą western blot. Obrazy Western blot pokazują również, że głównym składnikiem przygotowanych próbek mitochondrialnych z raka jajnika i jajników kontrolnych są mitochondria, z wyjątkiem niewielkiej ilości peroksysomów, co jest zgodne z analizą mikroskopii elektronowej. Rozsądne jest, aby peroksysomy były zawarte w przygotowanych mitochondriach, ponieważ mitochondria w dużym stopniu oddziałują z peroksysomami, co z kolei odzwierciedla funkcjonalną kompletność mitochondriów.Wyniki te świadczą o wysokiej jakości przygotowanych próbek mitochondrialnych. Kiedy wykonuję tę procedurę, bardzo ważne jest, aby całkowicie zmielić tkanki przed homogenizacją i dodać trypsynę do zmielonych tkanek kontrolnych. Ważne jest również, aby wykonać i/lub przygotować nieciągły gradient gęstości dla próbek raka i kontroli.Po tej procedurze można przeprowadzić proteomikę ilościową iTRAQ lub TMT lub fosfoproteomikę w celu wyjaśnienia profilu proteomu mitochondriów raka jajnika, a także można ustalić profil fosfoproteomu w celu wyjaśnienia ról mitochondriów w raku jajnika na dużą głębokość. Technika ta utorowała naukowcom drogę do systematycznego badania proteomu mitochondriów i fosfoproteomu w raku jajnika, skonstruowania systemu sieci szlaków sygnałowych oraz odkrycia wiarygodnych biomarkerów i celów terapeutycznych.

preparation-mitochondria-from-ovarian-cancer-tissues-control-ovarian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje procedurę izolacji mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika za pomocą wirowania o różnej prędkości w połączeniu z wirowaniem w gradiacji gęstości. Wyizolowane mitochondria można wykorzystać do analizy proteomicznej proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika.

Izolacja mitochondriów: technika izolowania mitochondriów od próbki tkanki ludzkiego raka jajnika

Ten protokół opisuje technikę przygotowania próbki poprzez kokulturację eksplantatów jajników z komórkami raka jajowodu. Próbki te są wizualizowane za pomocą obrazowej spektroskopii mas lub IMS w celu wykrycia wymiany małych cząsteczek między komórkami i tkankami, co prowadzi do rozwoju guza.

Modelowanie komunikacji raka jajnika do obrazowania analizy spektrometrii mas: metoda identyfikacji małocząsteczkowych komunikatorów chemicznych w rozwoju przerzutowego guza jajnika

To badanie opisuje szczegółową metodę izolacji i charakterystyki komórek pierwotnego raka jajnika z litych próbek klinicznych. Próbki kliniczne raka jajnika są poddawane trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania żywotnych, wolnych od fibroblastów komórek nabłonkowego raka jajnika (EOC), które doskonale nadają się do dalszych zastosowań.

Metoda pozyskiwania komórek pierwotnego raka jajnika z próbek litych

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i sekwencjonowanie genu 16S rybosomalnego RNA (genu 16S rRNA) w celu odkrycia i rozróżnienia bakterii w nowotworowych i nienowotworowych tkankach jajnika in situ. Różnice składowe i funkcjonalne bakterii przewidywano za pomocą BugBase i Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Charakterystyka i przewidywanie funkcjonalne bakterii w tkankach jajnika

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Ten protokół opisuje ustanowienie trójwymiarowego (3D) modelu ex vivo interakcji komórka rakowa - sieć komórkowa. Model ten stanowi platformę do wyjaśnienia mechanizmów pronowotworowych w niszy tkanki tłuszczowej oraz do testowania nowych terapii.

Model ex vivo przerzutów do otrzewnej raka jajnika z wykorzystaniem ludzkiej sieci

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Protokół ten skutecznie przygotował wystarczającą ilość wysokiej jakości tkanki neowaskularnej z próbek glejaka za pomocą mikrodyssekcji laserowej do ilościowej analizy proteomicznej angiogenezy guza, przezwyciężając ograniczenia badań tradycyjnie koncentrujących się głównie na czynnikach angiogennych oraz dostarczając szeroko zakrojonego profilu proteomicznego angiogenezy glejaka.

Przygotowanie tkanek neowaskularnych z tkanek glejaka ludzkiego do ilościowej analizy proteomiki angiogenezy guza

Naucz się izolować mitochondria z tkanek raka jajnika i kontrolnych przy użyciu wirowania różnicowego oraz gradientu gęstości. Ta metoda umożliwia ilościową analizę proteomiczną i odkrywanie biomarkerów nowotworowych.

Przygotowanie mitochondriów z tkanek raka jajnika i tkanek jajnika kontrolnego do ilościowej analizy proteomicznej

Przeglądaj więcej filmów