Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna
February 6th, 2020
Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.
Protokół ten umożliwia sterowane informacyjnie składanie sekwencji oligomerycznych poprzez dynamiczne oddziaływania kowalencyjne, naprawdę naśladując selektywną hybrydyzację sekwencji kwasów nukleinowych, ale ze zwiększoną siłą wiązań międzyniciowych. Dynamiczne zespoły kowalencyjne są zwykle ograniczone do prostych architektur ze względu na ich ograniczoną zdolność do przegrupowania wiązań i korekcji błędów. W przeciwieństwie do tego, podnosząc stężenie kwasu Lewisa w celu wpłynięcia na dysocjację wiązań, a następnie katalizowania rearanżacji wiązań, technika ta łagodzi powszechne ograniczenia pułapkowania kinetycznego systemów samoorganizacji.
Metoda ta może być stosowana w różnych dziedzinach, które wykorzystują reakcje przegrupowania wiązań kowalencyjnych, od kowalencyjnych struktur organicznych o wyjątkowo niskich wskaźnikach defektów po interfejsy tkanek biomateriałowych, które są w stanie dostosować się i dostosować do ciągłej przebudowy substratu tkankowego. Wykonując tę technikę po raz pierwszy, osoby mogą znaleźć kinetycznie uwięzione zespoły nawet po dłuższym czasie wyżarzania. Radzimy początkującym użytkownikom, aby podjęli próbę hybrydyzacji między oligomerami zawierającymi wyłącznie reszty aldehydowe i wyłącznie aminowe, upraszczając zakodowane informacje, a tym samym hybrydyzację.
Aby rozpocząć tę procedurę, zważ 0,125 grama fotolabilnej stałej żywicy nośnej FMOC i dodaj ją do spiekanego naczynia reakcyjnego automatycznego syntezatora. Włóż naczynie do części mikrofalowej syntezatora. Napełnij główną butelkę z rozpuszczalnikiem DMF, a butelkę odochronną roztworem 20%4-metylopipryrydyny w DMF i opróżnij odpady.
Następnie przygotuj jeden molowy roztwór kwasu bromooctowego i DIC w DMF o łącznej objętości 1,5 mililitra dla każdej pozostałości w sekwencji i 0,47 mililitra bezwodnika octowego na 4,53 mililitra DMF, aby uzyskać pięciomililitrowy roztwór zamykający. Przygotować 0,5 molowe roztwory każdej aminy pierwszorzędowej do użycia w NMP. Całkowita objętość każdego roztworu powinna wynosić 2,5 mililitra na każdą pozostałość odpowiedniej pierwszorzędowej aminy plus dodatkowe 2,5 mililitra.
Dodaj wszystkie rozwiązania do automatycznego rozdzielacza syntezatora. Za pomocą automatycznego syntezatora peptydów spęczniej żywicę, rozszczep grupę FMOC i przeprowadź reakcję przemieszczenia, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie zasaliizować ścianki naczynia reakcyjnego ze spiekanego szkła wyposażonego w trójdrogowy kurek, wypełniając je do góry roztworem 5% dichlorodimetylosilanu w DCE.
Pozostaw na 30 minut, a następnie opróżnij naczynie i umyj je DCE i metanolem. Po wyschnięciu naczynia przenieś do niego żywicę. Umyj żywicę trzy razy za pomocą DCM, używając pięciu mililitrów na każde pranie, jednocześnie bulgocząc azotem przez jedno ramię i wciągając odkurzacz drugim.
Wysuszyć i przechowywać żywicę i dołączony oligopeptoid do czasu deprotekcji i rozszczepienia. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, ponownie spęcznij żywicę, jeśli była przechowywana dłużej niż jeden dzień, bulgocząc ją pięcioma mililitrami DMF przez 10 minut. Opróżnij naczynie i dodaj małe mieszadło magnetyczne i trzy mililitry suchego DCM do szklanego naczynia peptydowego.
Odważyć 0,1 równoważnika katalizatora palladowego i 25 równoważników fenylosilanu na grupę allokową. Użyć zacisku, aby ustawić naczynie reakcyjne pod kątem nad płytką mieszającą, tak aby żywica była delikatnie mieszana, pozostając zawieszona w rozpuszczalniku i zakryj naczynie, aby zapobiec parowaniu DCM. Po godzinie odfiltruj roztwór i przemyj żywicę trzykrotnie DCM, używając pięciu mililitrów na pranie.
Następnie powtórz deprotekcję alloc jeszcze raz. Następnie przepłucz żywicę sekwencyjnie metanolem i DCM dwa razy i przenieś żywicę i mieszadło magnetyczne do 20-mililitrowej fiolki. Zanurz żywicę w DMF, wymieszaj i rozetnij zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Następnie użyj filtra strzykawkowego, aby oddzielić uwolniony oligopeptoid od żywicy i usunąć rozpuszczalnik pod próżnią. Rozpuść peptoidy w mieszaninie 50-50 wody i acetonitrylu i oczyść za pomocą preparatywnej HPLC o odwróconych fazach. Połącz oczyszczone frakcje, a następnie zamroź je i liofilizuj, aby uzyskać białawy proszek.
Analizuj proszek za pomocą spektrometrii mas ESI i MALDI. Aby ocenić czystość, należy przeprowadzić analityczną HPLC oczyszczonych oligopeptoidów. Najpierw należy przygotować 10-milimolowe roztwory podstawowe każdej sekwencji oligopeptoidalnej używanej do samoorganizacji oraz 10-milimolowy roztwór podstawowy triflatu skandu w bezwodnym acetonitrylu.
Dodaj 20 mikrolitrów każdego podstawowego roztworu peptydu do trzymililitrowej fiolki wyposażonej w mieszadło magnetyczne. Dodać 1,5 równoważnika roztworu triflatu skandu na potencjalne wiązanie aminowe z roztworu podstawowego i dodać tyle wody i acetonitrylu, aby utworzyć 200 mikrolitrów 2% roztworu wody i acetonitrylu. Mieszaj delikatnie w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby uzyskać acetylową deprotekcję aldehydu i dysocjację wszystkich pasm.
Następnie napełnij fiolkę 200 mikrolitrami chloroformu i dwoma mililitrami wody. Delikatnie wstrząsnąć fiolką. Pozostaw mieszaninę na co najmniej 15 minut.
Po całkowitym oddzieleniu faz wyekstrahuj warstwę organiczną za pomocą strzykawki o pojemności mikrolitrów. Przenieś warstwę organiczną do nowej fiolki i wymieszaj w temperaturze 70 stopni Celsjusza w celu wyżarzania oligomerów, które zwykle trwa sześć godzin. Aby zademonstrować zdolność peptydów kodowanych informacją do przechodzenia selektywnej sekwencji, dynamicznej samoorganizacji kowalencyjnej w drabinki molekularne, syntetyzuje się reprezentatywną nić i hybrydyzuje się ją z komplementarną sekwencją peptoidową.
Monomery NPAM i NPAL są stosowane jako dynamiczne pary reagentów kowalencyjnych z NEEE, wspomagające rozpuszczalność końcowych produktów samoorganizujących się. Po zakończeniu syntezy submonomeru w fazie stałej grupa allokowa jest usuwana. Przed i po deprotekcji części żywicy zostały rozszczepione w świetle 405 nanometrów i scharakteryzowane za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylaną.
Sekwencja jest oczyszczana za pomocą HPLC przygotowawczej, a następnie liofilizowana w celu uzyskania białawego proszku, a czystość potwierdza się za pomocą analitycznej HPLC. Oligopeptoid jest następnie hybrydyzowany z jego komplementarną sekwencją, aby zapewnić drabinę w rejestrze potwierdzoną przez MALDI-MS. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać, aby odczekać wystarczająco dużo czasu, aby warstwy całkowicie się rozdzieliły, aż frakcja wodna stanie się przezroczysta, co najmniej 15 minut, aby zapewnić wystarczającą ekstrakcję katalizatorem.
Po zakończeniu tej procedury montażu należy przeprowadzić spektrometrię mas w celu określenia zakresu hybrydyzacji. Dodatkowo spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie lub NMR fluoru może być wykorzystana do oceny stężenia skandu po ekstrakcji. Chociaż technika ta została opracowana niedawno, przewidujemy, że podejście biomimetyczne opisane w naszej pracy będzie miało zasadnicze znaczenie w kierowaniu przyszłym projektowaniem i składaniem złożonych nanostruktur sterowanym informacjami.
Niektóre z użytych tutaj odczynników są niebezpieczne. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z tymi lub innymi chemikaliami. Nosić wszystkie środki ochrony osobistej i wykonywać wszystkie eksperymenty wewnątrz dygestorium.
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę syntezy oligomerów peptoidowych z zakodowanymi informacjami i ich sekwencyjnego samozbierania się w drabinki molekularne. Podejście wykorzystuje dynamiczne kowalencyjne oddziaływania, zwiększające siłę wiązań i umożliwiające złożone architektury.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biochemia
- Chemia polimerów
- Nauki o materiałach
Tło
- Dynamiczne kowalencyjne skupiska są ograniczone w architekturze z powodu ograniczeń przegrupowań wiązań.
- Wzmożona koncentracja kwasu Lewisa może zwiększyć dysocjację i przegrupowanie wiązań.
- Ta metoda może przynieść korzyści różnym dziedzinom, w tym biomateriałom i kowalencyjnym strukturom organicznym.
- Po raz pierwszy użytkownicy mogą napotkać skupiska zablokowane kinetycznie.
Cel badania
- Opracowanie protokołu syntezy oligomerów peptoidowych.
- Umożliwienie selektywnego względem sekwencji samozbierania się tych oligomerów.
- Pokonanie ograniczeń tradycyjnych dynamicznych systemów kowalencyjnych.
Zastosowane metody
- Ważenie i przygotowanie fotolabielnej żywicy z wsparciem stałym FMOC.
- Wykorzystanie zautomatyzowanego syntezatora peptydów do syntezy oligomerów.
- Zastosowanie katalizatorów palladowych do reakcji deprotekcji.
- Oczyszczanie syntetyzowanych peptoidów za pomocą HPLC przygotowawczej o odwrotnej fazie.
Główne wyniki
- Pomyślne syntetyzowano i oczyszczono peptoidy z zakodowanymi informacjami.
- Wykazano selektywne względem sekwencji dynamiczne kowalencyjne samozbieranie się.
- Uzyskano wysokie poziomy czystości potwierdzone przez analityczną HPLC.
- Zcharakteryzowano syntetyzowane produkty za pomocą spektrometrii mas.
Wnioski
- Protokół umożliwia tworzenie złożonych struktur peptoidowych.
- Dostarcza ram dla przyszłych zastosowań w naukach o materiałach.
- Ta metoda zwiększa potencjał chemii dynamicznej kowalencyjnej w różnych dziedzinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables sequence-directed self-assembly of information-encoded peptoids using dynamic covalent chemistry, addressing kinetic trapping limitations that hinder complex architecture formation in biomaterials and drug delivery systems. By mimicking nucleic acid hybridization with enhanced bond strength, it provides a platform for predictive design of stable, functional nanostructures relevant to target validation and assay development. The method supports mechanistic de-risking through precise control over molecular assembly, improving confidence in preclinical model reproducibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through sequence-specific peptoid hybridization, clarifying target engagement mechanisms.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation via information-directed molecular ladder formation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by reducing mechanistic ambiguity in early-stage target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates sequence-encoded peptoid libraries suitable for phenotypic screening against biological targets.
- Operational Value: Delivers standardized, quantifiable assemblies characterized by MALDI-MS, enabling reliable compound evaluation.
- Scalability: Uses automated peptide synthesis and HPLC purification for platform reuse across discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by encoding bioactive sequences into peptoid oligomers for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions through sequence-selective self-assembly readouts that correlate with functional outcomes.
- Biomarker Alignment: Enables exploration of peptoid-based translational biomarkers via stable, information-encoded nanostructures.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical research, enabling iterative design-test cycles for information-encoded therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via sequence-specific peptoid interactions that mimic protein-protein or nucleic acid interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible peptoid libraries with quantifiable hybridization outputs for hit identification.
- Analytics: Provides MALDI-MS and ESI-MS readouts that enable quantitative comparison of assembly efficiency under varying conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating stable peptoid architectures suitable for efficacy and safety profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for encoding diverse sequences into peptoid scaffolds across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing false positives from kinetically trapped assemblies.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through solid-phase synthesis and HPLC purification workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through reliable mechanistic insights.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural and functional data for advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organic synthesis, mass spectrometry, and automated peptide synthesizer operation.
- Needs access to HPLC, ESI-MS, MALDI-MS, and inert atmosphere handling for air-sensitive reagents.
- Demands cross-team standardization of sequence design, purification, and assembly protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to diverse peptoid sequences or alternative dynamic covalent pairs.
- Limited by the need for careful Lewis acid titration to avoid incomplete deprotection or over-dissociation, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:20
Solid-phase Submonomer Synthesis of Oligo(peptoids)
6:01
Sequence-selective Ladder Self-assembly Through Dissociation/Extraction/Annealing
7:22
Results: Analysis of Information-bearing Peptoids and Their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly
8:31
Conclusion
