Name: Zwiększenie trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę zwiększania trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej. Technika ta wspiera wzrost neuronów, glejów i komórek macierzystych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez program KAMIN izraelskiego Ministerstwa Handlu i Pracy oraz przez Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, US.

Wykorzystanie zwierząt w tym protokole zostało zatwierdzone przez Krajową Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania.
UWAGA: Szkielety koralowców z węglanu wapnia powinny być używane w krystalicznej formie aragonitu. Typy koralowców testowane do tej pory pod kątem kultur nerwowych to Porites Lutea, Stylophora Pylillata i Trachyphyllia Geoffroyi. Szkielety można kupić w całości lub na ziemi.
1. Czyszczenie fragmentów szkieletu koralowca
UWAGA: Następujące kroki powinny być wykonywane w kapturze chemicznym w temperaturze pokojowej, ponieważ opisane poniżej roztwory są niebezpieczne i mogą powodować oparzenia i podrażnienia.
<ol>
	<li>Za pomocą młotka rozbij szkielet koralowca i podziel go na 0,5–2 cm fragmenty. W celu rozpuszczenia pozostałości organicznych i nieorganicznych należy namoczyć fragmenty szkieletu koralowca w 10% roztworze podchlorynu sodu na 10 minut, a następnie przemyć raz wodą podwójnie destylowaną (DDW).</li>
	<li>Aby usunąć pozostałe pozostałości organiczne, namocz fragmenty w 1M roztworze NaOH na 5 minut, a następnie przemyj raz DDW. Kontynuuj usuwanie osadów organicznych, mocząc fragmenty w 30% roztworzeH2O2przez 10 min, a następnie przemyj fragmenty 3x DDW.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej DDW i pozostaw fragmenty koralowca w kapturze do wyschnięcia (1–8 godzin).</li>
</ol>
2. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Przenieść szkiełka nakrywkowe na szklaną szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Dodaj 10 ml 95% etanolu przez 15 minut.</li>
	<li>Usuń etanol i umyj DDW 3x, odczekując 10 minut między każdym myciem. Umieść naczynie na wstępnie podgrzanej płycie grzewczej o temperaturze 80 °C, aż DDW odparuje. Podczas suszenia delikatnie wymieszaj szkiełka nakrywkowe w talerzu, aby nie sklejały się ze sobą.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ziaren szkieletu koralowca
<ol>
	<li>Fragmenty szkieletu koralowca zmielić za pomocą moździerza i tłuczka (mielenie ręczne) aż do całkowitego rozpadu. Rezultatem jest mieszanina ziaren o rozmiarach od 20 μm do 200 μm.</li>
	<li>Alternatywnie mielej fragmenty szkieletu koralowca za pomocą szlifierki elektrycznej z prędkością 1,000 obr./min przez 30 s (długość ostrza = 6 cm; szerokość = 0,5 cm–1,0 cm). Uzyskany rozmiar ziarna jest podobny do zakresu wielkości wytwarzanego przez mielenie ręczne.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie ziaren o określonym zakresie wielkości
UWAGA: Jeśli pożądana jest kontrola nad wielkością ziaren w matrycy, użyj następującej procedury oczyszczania ziarna opartej na filtracji.
<ol>
	<li>Przenieś ziarna na ręczne lub elektryczne sitko filtracyjne o wielkości 40 μm.</li>
	<li>Podziel ziarna na dwa określone zakresy, przesiewając ziarna przez sitko (w przypadku korzystania z sitka elektrycznego zalecane są następujące warunki: wstrząsanie = 600 amplitud/min, odbijanie = 6/s). W wyniku tej procedury uzyskuje się dwie grupy wielkości ziaren, jedną <40 μm, a drugą >40 μm. 
	UWAGA: Te dwa rozmiary można określić za pomocą filtrów siatkowych o różnych oczkach. Jeśli pożądany jest bardziej ograniczony zakres, należy ponownie przesiać każdą grupę z kroku 4.2 przez sitka o różnych oczkach.</li>
	<li>Ziarna należy sterylizować w autoklawie.</li>
</ol>
5. Przygotowanie potraw pokrytych ziarnem koralowym lub szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Do powlekania kolb, płytek lub szalek Petriego 
	UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać w sterylnych warunkach.
	<ol>
		<li>Dodaj ziarna szkieletu koralowca do roztworu poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 20 μg/ml rozpuszczonego w roztworze Hanksa. Zalecane stężenie wynosi 5 mg/10 mg ziaren na 1 ml roztworu PDL.</li>
		<li>Wlać roztwór do kolb i szalek (około 2 ml/25cm2) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Ziarna opadają i przyczepiają się do dna.</li>
		<li>Następnego dnia umyj kolby i naczynia raz sterylnym DDW. Pozostaw kolby i naczynia do wyschnięcia w okapie. 
		UWAGA: Zaleca się używanie świeżo pokrytych kolb i szalisków. Powlekane kolby i szalki mogą być używane do tygodnia po powlekaniu, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Jednak skuteczność matrycy może być zagrożona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe z powłoką (średnica 12 mm, grubość 0,17 mm)
	<ol>
		<li>Dodaj ziarna szkieletu koralowca do DDW w dowolnym stężeniu. Typowe gęstości stosowane w komórkach nerwowych to 5 mg/ml i 10 mg/ml. Wlej 40 μl roztworu ziarnistego na środek szkiełka nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
		<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe na płycie grzewczej podgrzanej do temperatury 80 °C i poczekać na całkowite odparowanie (zwykle 15 minut). W tych warunkach ziarna przylegają do szkiełka nakrywkowego. Powlekane szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie. Przechowywać w sterylnych warunkach.</li>
		<li>Dzień przed posiewem umieść szkiełka nakrywkowe na pokrywce sterylnej płytki 24-dołkowej. Dodać 100 μl roztworu PDL o stężeniu 20 μg/ml do każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj końcówki, aby upewnić się, że płyn pokrywa cały obszar ziarna i resztę powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Przykryj pokrywkę dnem talerza. Owiń boki talerzy folią parafinową. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnego dnia umyj raz DDW i wysusz w kapturze. 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie świeżo powlekanych szkiełek nakrywkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Hodowla zdysocjowanych komórek hipokampa na szkiełkach nakrywkowych pokrytych ziarnami koralowców
UWAGA: Metoda hodowli komórek dysocjacyjnych w hipokampie została zmodyfikowana w stosunku do wcześniej opublikowanych procedur24,27. Przygotowanie kultury opisano dla czterech szczeniąt szczurów. Oczekiwany plon z każdego hipokampa wynosi 1–1,5 x 106 komórek.
<ol>
	<li>Instalacji
	<ol>
		<li>Przygotuj pustą szalkę Petriego o średnicy 60 mm. Wlać 2 ml minimalnej pożywki (MEM) do szalki Petriego o średnicy 60 mm i wyłożyć na lód.</li>
		<li>Wlać 2 ml MEM do naczynia o średnicy 35 mm i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 . Wlać 2 ml MEM do probówki o pojemności 15 ml i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wlać 1 ml pożywki pierwszego dnia do probówki o pojemności 15 ml i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5-10% CO2, 
		UWAGA: Skład pożywki pierwszego dnia opisany jest w Tabeli Materiałów.</li>
		<li>Rozmrozić 200 μl 2,5% roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotuj trzy szklane pipety Pasteura z głowicami o średnicy 0,5 mm, 0,75 mm i 1,0 mm za pomocą płomienia.</li>
		<li>Przygotuj odpowiednie narzędzia chirurgiczne: jedne duże nożyczki, dwie małe nożyczki, jedną dużą pęsetę, cztery małe pęsety i jeden skalpel.</li>
		<li>Przygotuj mikroskop stereoskopowy w kapturze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając dużych nożyczek, złóż w ofierze 0-3-dniowe młode szczura Sprague Dawley, oddzielając ich głowy od ciała na pustej szalce Petriego o średnicy 60 mm (krok 6.1.1). Pozbądź się ciał.</li>
	<li>Podnieś głowę, trzymając ją z ust dużą pęsetą. Przetnij skórę pokrywającą czaszkę małym nożyczkiem.</li>
	<li>Czystymi nożyczkami wejdź pod czaszkę (z boku móżdżku) i przetnij czaszkę w prawo i w lewo, aby umożliwić jej usunięcie. Za pomocą małej pęsety oderwij czaszkę od mózgu.</li>
	<li>Za pomocą czystej pęsety oddzielić mózg od głowy i umieścić go na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 2 ml zimnego MEM (patrz krok 6.1.2).</li>
	<li>Za pomocą dwóch małych pęset przeanalizuj hipokamp pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieść hipokampy do przygotowanej szalki o średnicy 35 mm (z kroku 6.1.2) zawierającej MEM. 
	UWAGA: Kroki 6.3–6.6 należy powtórzyć dla każdego szczeniaka.</li>
	<li>Pokrój hipokamp na plastry o grubości około 1 mm za pomocą skalpela. Dodać 200 μl roztworu trypsyny (rozcieńczonego do końcowego stężenia 0,25%). Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 przez 30 min.</li>
	<li>Po inkubacji dodaj 2 ml zimnego MEM (krok 6.1.2) do naczynia, aby dezaktywować trypsynę. Przenieść trypsynizowaną tkankę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml pożywki pierwszego dnia podgrzanej do temperatury 37 °C (etap 6.1.3) za pomocą szklanej pipety Pasteura o największej średnicy (krok 6.1.5). 
	UWAGA: Najlepszy stosunek podłoża do tkanki (v:v) do dalszego przetwarzania tkanki to 1 ml/8 hipokampów. W miarę możliwości należy unikać przenoszenia pożywki z tkanką.</li>
	<li>Rozcier tkankę, przepuszczając ją przez szklaną pipetę o największej średnicy 10–15 razy. Następnie powtórz ten proces za pomocą szklanej pipety o średnicy medium. Kontynuuj rozcieranie pipetą o najmniejszej średnicy. Unikaj bulgotania, aby zmniejszyć śmierć komórki.</li>
	<li>Pozwól pozostałym kawałkom tkanki zanurzyć się na 2–5 minut, a następnie przenieś supernatant do innej probówki o pojemności 15 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: Preferowana gęstość komórek to 200 000–400 000 komórek/ml. Użyj pożywki pierwszego dnia do rozcieńczenia lub odwirowania w temperaturze 470 x g w celu zagęszczenia komórek.</li>
	<li>Zasiać 100 μl komórek na każdym szklanym szkiełku nakrywkowym. Podczas wysiewu upewnij się, że całe szkiełko nakrywkowe jest pokryte komórkami. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia dodaj 500 μl pożywki wzrostu neuronów do studzienek. 
	UWAGA: Skład pożywki wzrostu neuronów jest opisany w Tabeli Materiałów.</li>
	<li>Delikatnie przenieś każde szkiełko nakrywkowe do odpowiedniego dołka za pomocą pęsety, jednocześnie usuwając pożywkę pierwszego dnia, przechylając szkiełko nakrywkowe. Odessać pozostałe media z pokrywki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5–10% CO2 . Unikaj wymiany pożywki przez cały czas inkubacji. Kultury można utrzymywać w tych warunkach do 1 miesiąca. Głównym problemem jest wilgotność. Dlatego upewnij się, że inkubator jest maksymalnie nawilżony.</li>
</ol>

<ol><li>Pan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+to+manipulate+the+direction+and+functional+strength+between+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 32(2015).</li>
<li>Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Cultured+Rodent+Neurons+to+Human+Brain+Tissue%3A+Model+Systems+for+Pharmacological+and+Translational+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience.</a> ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).</li>
<li>Molnár, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li>
<li>Silva, R. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+primary+nerve+cell+cultures+as+models+for+assessment+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity.</a> Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Overview+of+in+vitro+Methods+to+Study+Microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An Overview of in vitro Methods to Study Microglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).</li>
<li>Ogata, N., Tatebayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+mammalian+brain+neurons+and+its+application+to+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Yakurigaku+Zasshi.+Folia+Pharmacologica+Japonica%22%5BJournal%5D)">Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording.</a> Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).</li>
<li>Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cerebellar+cortex+in+organotypic+slice+cultures%3A+an+in+vitro+model+to+analyze+the+consequences+of+mutations+and+pathologies+on+neuronal+survival%2C+development%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).</li>
<li>Weiss, O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+scar+tissue+formation+in+injured+nervous+tissue+cultivated+on+surface-engineered+coralline+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).</li>
<li>Chen, J., Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+neurons+in+primary+cultures+and+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).</li>
<li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).</li>
<li>Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+considerations+for+live+imaging+of+developing+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).</li>
<li>Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+Glial+Cell+Culture+Systems+and+Applications+for+Neurodegeneration+and+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation.</a> SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).</li>
<li>Karimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+systems+for+stem+cell-based+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).</li>
<li>Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+for+3D+in+vitro+culture+of+neural+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells.</a> Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).</li>
<li>Walker, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Progenitor+Cell+Therapy+Using+Scaffolding+Constructs+for+Central+Nervous+System+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury.</a> Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).</li>
<li>Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+Brain+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for Brain Tissue Engineering.</a> Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).</li>
<li>Lu, T., Li, Y., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+fabrication+and+construction+of+three-dimensional+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering.</a> International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).</li>
<li>Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+Biomaterials+and+Stem+Cells+for+Neural+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration.</a> Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).</li>
<li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+tissue+engineering%3A+scaffold+design+variables+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li>
<li>Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+implantation+of+synthetic+polymer%2Fbiopolymer+matrix%3A+a+new+perspective+for+brain+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair.</a> Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).</li>
<li>Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+physical+structure+and+charge+on+neurite+extension+in+a+3D+hydrogel+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).</li>
<li>Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+scaffolds+and+delivery+systems+to+enhance+axonal+regeneration+after+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).</li>
<li>George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+tissue+engineering+with+structured+hydrogels+in+CNS+models+and+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies.</a> Biotechnology Advances. , (2019).</li>
<li>Shany, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aragonite+crystalline+biomatrices+support+astrocytic+tissue+formation+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo.</a> Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).</li>
<li>Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+hippocampal+mossy+fiber+and+associational-commissural+pathways+in+a+novel+dissociated+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).</li>
<li>Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+survival+and+durability+of+neurons+and+astrocytes+on+3-dimensional+aragonite+biomatrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices.</a> Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).</li>
<li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).</li>
<li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).</li>
<li>Morad, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliosis+of+astrocytes+cultivated+on+coral+skeleton+is+regulated+by+the+matrix+surface+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography.</a> Biomedical Materials. 14 (4), Bristol, England. 045005(2019).</li>
<li>Green, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Therapeutic+Potential+for+Marine+Skeletal+Proteins+in+Bone+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration.</a> Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).</li>
<li>Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+and+Marine-Derived+Porous+Scaffolds+for+Bone+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering.</a> Materials. 11 (9), (2018).</li>
<li>Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li>
<li>Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486</a> (2019).</li>
<li>Drake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+skeletal+organic+matrix+from+the+stony+coral+Stylophora+pistillata%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).</li>
<li>Ramos-Silva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeletal+proteome+of+the+coral+Acropora+millepora%3A+the+evolution+of+calcification+by+co-option+and+domain+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).</li>
<li>Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aragonite+crystalline+matrix+as+an+instructive+microenvironment+for+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).</li>
<li>Morad, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CaCO3+Matrix+Dictates+Astrocytes+Transition+to+Astrogliosis%22">CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis</a>. , Ariel University. Doctoral thesis (2019).</li>
<li>Prada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocean+warming+and+acidification+synergistically+increase+coral+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiona tutaj technika opisuje sposób na poprawę utrzymania i funkcjonalności komórek nerwowych w hodowli. Osiąga się to poprzez przyleganie komórek do matrycy wykonanej z ziaren szkieletu koralowca, która odżywia komórki i wspomaga ich wzrost i aktywność. Zastosowanie tej techniki zwiększa zdolność modelu hodowli neuronowej do naśladowania środowiska komórek w mózgu.
Wprowadzenie matrycy jako substratu hodowlanego ma kilka zalet w porównaniu z innymi substratami stosowanymi w klasycznyc...

Kultury zdysocjowanych komórek nerwowych, w tym przypadku komórek hipokampa, są cennym modelem eksperymentalnym do badania wzrostu i funkcji neuronów, zapewniając wysoką izolację i dostępność komórek1,2,3. Ten typ hodowli jest często używany w neurobiologii, opracowywaniu leków i inżynierii tkankowej ze względu na dużą ilość informacji, które można zebrać, takich jak tempo wzrostu i żywotności, neurotoksyczność, wzrost i sieć neurytów, łączność synaptyczna i plastyczność, modyfikacje morfologiczne, organizacja i okablowanie neurytów itp.1,4,5,6, 7.
Pomimo znaczenia kultur, hodowane komórki są zazwyczaj zmuszane do wzrostu na szklanych szkiełkach nakrywkowych w dwuwymiarowej monowarstwie. Te rygorystyczne modyfikacje środowiskowe znacznie zmniejszają zdolność komórek nerwowych do przetrwania w czasie, ponieważ szklane szkiełka nakrywkowe są substratami niepielęgnującymi o niskiej sile adhezji, wykazującymi mniejszą zdolność do wspierania wzrostu komórek8,9,10,11.
Ponieważ hodowane komórki nerwowe są zmuszone do wzrostu w trudnych warunkach, podstawowym podejściem do zwiększenia ich przetrwania byłoby naśladowanie ich naturalnego środowiska tak bardzo, jak to możliwe12,13. Można to osiągnąć poprzez zastosowanie biomateriałów, które będą działać jak matryce i naśladować macierz zewnątrzkomórkową komórek, umożliwiając im tworzenie struktury przypominającej tkankę i pomagając w ich odżywianiu14.
Wykorzystanie biomateriałów jest obiecującym podejściem do ulepszania kultur komórkowych, ponieważ działają one jak biokompatybilne rusztowania, zapewniając stabilność mechaniczną i poprawiając różnorodność właściwości komórek, w tym adhezję, przeżycie, proliferację, migrację, morfogenezę i różnicowanie15,16,17. W celu poprawy warunków życia komórek in vitro stosuje się kilka rodzajów biomateriałów. Wśród nich są biopolimery, czyli składniki biologiczne, które zwykle są częścią macierzy zewnątrzkomórkowej komórek. Te biomateriały są najczęściej używane jako forma polimeryzowanych środków powlekających lub hydrożeli18,19,20. Z jednej strony, wspomniane powyżej matryce dają komórkom znajome środowisko 3D, w którym mogą rosnąć, zachęcają do ich przylegania do naczynia i zapewniają im mechaniczne wsparcie21,22. Z drugiej strony, ich spolimeryzowana forma i uwięzienie komórek w hydrożelach zaburza dostęp komórek do składników pielęgnacyjnych obecnych w pożywce wzrostowej, a także utrudnia śledzenie komórek metodami mikroskopowymi23.
Egzoszkielety koralowców to biologiczne matryce pochodzenia morskiego. Wykonane są z węglanu wapnia, mają stabilność mechaniczną i są biodegradowalne. Wcześniejsze badania wykorzystujące szkielet koralowca jako matrycę do hodowli komórek nerwowych w hodowli wykazały znacznie większą przyczepność w porównaniu ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi24,25. Ponadto komórki nerwowe wyhodowane na szkielecie koralowca wykazały zdolność do pobierania wapnia, z którego składa się szkielet, który chroni komórki nerwowe w warunkach niedoboru składników odżywczych26. Co więcej, szkielet koralowca jest wspierającą i pielęgnującą matrycą, która zwiększa przeżywalność komórek nerwowych, zachęca do tworzenia sieci neuronowych, podnosi szybkość połączeń synaptycznych i umożliwia tworzenie struktur podobnych do tkanek27,28. Ostatnie badania wykazały również, że topografia powierzchni macierzy szkieletu koralowca odgrywa kluczową rolę w dystrybucji i aktywacji komórek glejowych8,29. Szkielet koralowca jest również skuteczny jako matryca do hodowli innych typów komórek, takich jak osteocyty30,31, hepatocyty i kardiomiocyty w hodowli (dane niepublikowane).
Stąd szkielet koralowca jest obiecującą matrycą do hodowli komórek in vitro. Tak więc protokół szczegółowo opisany poniżej opisuje technikę hodowli komórek nerwowych na szkielecie koralowca w celu wytworzenia bardziej stabilnych i dobrze prosperujących kultur nerwowych niż te osiągnięte istniejącymi metodami. Protokół ten może być również przydatny do hodowli kardiomiocytów, hepatocytów i innych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Greiner</td><td>#60-662160</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A4503</td><td></td></tr><tr><td>D &ndash; glukoza</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>#D5796</td><td></td></tr><tr><td>Sito elektryczne</td><td>Ari Levy</td><td>#3700</td><td></td></tr><tr><td>Serun z płodu bydlęcego (FBS)</td><td>Przemysł biologiczny</td>#<td>04-007-1A Pożywka</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>pierwszego dnia</td><td>85.1% Minimum Essential Eagle' s medium (MEM), 11,5% inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, 1,2% L-glutamina i 2,2% D-glukoza.</td></tr><tr><td>Kolby</td><td>Greiner</td><td>#60-690160</td><td>25cm^2, Hodowla tkankowa traktowana</td></tr><tr><td>Fluoro-deoksy-urydyna</td><td>Sigma</td><td>#F0503</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Menzel-Glaser</td><td>#BNCB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Romical</td><td>#007130-72-19</td><td>Niebezpieczna</td></tr><tr><td>mieszanka składników odżywczych F-12 szynki</td><td>Sigma</td><td>#N4888</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór HANK'S</td><td>Sigma</td><td>#H6648</td><td></td></tr><tr><td>Kwas kynureninowy</td><td>Sigma</td><td>#K3375</td><td></td></tr><tr><td>L - glutamina</td><td>Sigma</td><td>#G7513</td><td></td></tr><tr><td>Sitko ręczne (40&micro; m)</td> <td>VWR</td><td>#10199-654</td><td></td></tr><tr><td>Minimun Essential Eagle (MEM)</td><td>Sigma</td><td>#M2279</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td>De-Groot</td><td>4-P090</td><td></td></tr><tr><td>NaClO (podchloryn sodu)</td><td>Sigma</td><td>#425044</td><td>Niebezpieczne</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>#S8045</td><td>Niebezpieczne</td></tr><tr><td>podłoże</td><td></td><td></td> <td>wzrostu neuronów45% MEM, 40% modyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM), 10% mieszanka składników odżywczych szynka F-12, 0,25% (w/v) albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,75% D-glukoza, 0,25% L-glutamina, 0,5% suplement B-27, 0,1% kwas kynureninowy, 0,01% 70% urydyny i 30% fluoro-deoksyurydyna.</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Greiner</td><td>#60-628160, #60-627160</td><td>odpowiednio 60mm, 35mm.</td></tr><tr><td>Poly D &ndash; Lizyna</td><td>Sigma</td><td>#P7280</td><td></td></tr><tr><td>Inteligentny młynek do zębiny</td><td>KometaBio</td><td>#GR101</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>#15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>#U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

zwiększenie trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Kultury dysocjowanych komórek neuronalnych i glejowych hipokampa są cennym modelem eksperymentalnym do badania wzrostu i funkcji neuronów, zapewniając wysoką izolację komórek i kontrolowane środowisko. Jednak przetrwanie komórek hipokampa in vitro jest zagrożone: większość komórek umiera w ciągu pierwszego tygodnia hodowli. Dlatego tak ważne jest zidentyfikowanie sposobów na zwiększenie trwałości komórek nerwowych w hodowli.
Węglan wapnia w postaci krystalicznego aragonitu pochodzącego ze szkieletu koralowców może być używany jako nadrzędna, aktywna matryca dla kultur neuronalnych. Pielęgnując, chroniąc i aktywując komórki glejowe, szkielet koralowca zwiększa przeżywalność i wzrost tych komórek in vitro lepiej niż inne matryce.
Ten protokół opisuje metodę hodowli komórek hipokampa na matrycy koralowej. Matryca ta jest generowana przez przyczepienie ziaren szkieletów koralowców do naczyń hodowlanych, kolb i szklanych szkiełek nakrywkowych. Ziarna pomagają w poprawie środowiska komórek, wprowadzając je do delikatnego trójwymiarowego (3D) środowiska, aby rosły i tworzyły struktury przypominające tkanki. Środowisko 3D wprowadzone przez szkielet koralowca można zoptymalizować dla komórek poprzez mielenie, co umożliwia kontrolę nad wielkością i gęstością ziaren (tj. chropowatością matrycy), właściwością, która, jak stwierdzono, wpływa na aktywność komórek glejowych. Co więcej, zastosowanie ziaren ułatwia obserwację i analizę kultur, zwłaszcza przy użyciu mikroskopii świetlnej. W związku z tym protokół zawiera procedury generowania i optymalizacji macierzy koralowej jako narzędzia poprawiającego utrzymanie i funkcjonalność komórek nerwowych in vitro.

W celu przygotowania matrycy z szkieletu koralowca, cały szkielet koralowca (Rysunek 1A) rozbito na fragmenty o wielkości 0,5–2 cm za pomocą młotka (Rysunek 1B), a następnie dokładnie oczyszczono z pozostałości organicznych w trzech etapach (krok 1 protokołu), wykorzystując 10% roztwór podchlorynu, 1M roztwór NaOH oraz 30% roztwór H2O2 (Rysunek 1C). Fragmenty koralowca uznano za dobrze oczyszczone, gdy kolor sz...

Zdysocjowana hodowla komórek hipokampa jest kluczowym narzędziem eksperymentalnym w neurobiologii. Przeżycie i funkcja komórek nerwowych w hodowli jest zwiększona, gdy szkielety koralowców są używane jako matryce, ze względu na ich rolę neuroprotekcyjną i neuromodulacyjną. W związku z tym komórki nerwowe hodowane na macierzy koralowej wykazują większą trwałość, a tym samym są bardziej odpowiednie do hodowli.

Zwiększenie trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Znaczenie tego protokołu polega na tym, że zapewnia on nowy sposób na zwiększenie trwałości i wzrostu neuronów, komórek glejowych i macierzystych in vitro. Ma to również zastosowanie do innych komórek. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie matrycy wykonanej ze szkieletu koralowca.Ta matryca pielęgnuje i chroni komórki nerwowe oraz wspomaga ich odrastanie. Będąc wsparciem dla komórek nerwowych in vitro, szkielet koralowca może funkcjonować podobnie jak implant regeneracyjny w miejscach uszkodzenia mózgu. Na początek użyj młotka, aby rozbić szkielet koralowca i podzielić go na fragmenty o długości od 0,5 do dwóch centymetrów.W celu rozpuszczenia pozostałości organicznych i nieorganicznych namocz fragmenty szkieletu koralowca w 10% roztworze podchlorynu sodu przez 10 minut. Następnie umyj raz wodą podwójnie destylowaną. Aby usunąć pozostałe pozostałości organiczne, namocz fragmenty w jednomolowym roztworze wodorotlenku sodu na pięć minut, a następnie przemyj raz wodą podwójnie destylowaną.Kontynuuj usuwanie osadów organicznych, mocząc fragmenty w 30% roztworze nadtlenku wodoru przez 10 minut i umyj fragmenty trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. Usuń jak najwięcej nadmiaru podwójnie destylowanej wody i pozostaw fragmenty koralowców w kapturze do wyschnięcia. Następnie wyczyść szkiełka szklanej pokrywy, mocząc je w 10 mililitrach 95% etanolu na 100-milimetrowej szklanej szalce Petriego.Po 15 minutach usuń etanol i umyj trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą, odczekując 10 minut między każdym myciem. Wyjmij podwójnie destylowaną wodę i umieść naczynie na rozgrzanej do 80 stopni Celsjusza płycie grzewczej. Następnie delikatnie mieszaj szkiełka nakrywkowe, aż podwójnie destylowana woda odparuje.Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie. Zmiel fragmenty szkieletu koralowca za pomocą moździerza i tłuczka aż do całkowitego rozpadu. Uzyskuje się mieszaninę ziaren o rozmiarach od 20 do 200 mikrometrów.Alternatywnie zmiel fragmenty szkieletu koralowca za pomocą szlifierki elektrycznej o długości ostrza sześciu centymetrów i szerokości od 0,5 do jednego centymetra, z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund. Aby oczyścić ziarna, przenieś je na elektryczne sitko filtracyjne o średnicy 40 mikronów. Dostosuj ustawienia filtra elektrycznego do wstrząsania z prędkością 600 amplitud na minutę i odbijania się sześć razy na sekundę.Następnie zautoklawuj ziarna. W sterylnych warunkach dodaj ziarna szkieletu koralowca do 20 mikrogramów na mililitr PDL, rozpuszczonych w roztworze Hanka, aby osiągnąć stężenie pięciu miligramów lub 10 miligramów ziaren na jeden mililitr roztworu PDL. Wlać roztwór do kolb i szalek w stężeniu około dwóch mililitrów na 25 centymetrów kwadratowych i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ziarna opadają i przyczepiają się do dna. Następnego dnia umyj kolby i naczynia sterylną wodą podwójnie destylowaną. Pozostaw kolby i naczynia do wyschnięcia w okapie.Aby pokryć szklane szkiełko nakrywkowe, najpierw dodaj ziarna szkieletu koralowca do podwójnie destylowanej wody o stężeniu pięciu lub 10 miligramów na mililitr. Umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzewczej podgrzanej do 80 stopni Celsjusza. Następnie wlej 40 mikrolitrów roztworu zbożowego na środek szkiełka nakrywkowego i odczekaj 15 minut do całkowitego odparowania.Spowoduje to, że ziarna będą przylegać do szkiełka nakrywkowego. Powlekane szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w sterylnych warunkach. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na wieczku sterylnej płytki 24-dołkowej, dodaj 100 mikrolitrów 20 mikrogramów na mililitr roztworu PDL do każdego szkiełka nakrywkowego.Użyj końcówki, aby upewnić się, że płyn pokrywa cały obszar ziarna i resztę powierzchni szkiełka nakrywkowego. Przykryj pokrywkę dnem talerza i owiń boki miejsca folią parafinową. Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umyj szkiełka nakrywkowe raz wodą podwójnie destylowaną i wysusz w kapturze. Po przygotowaniu głów szczeniąt szczurów trzymaj je z pyska dużą pęsetą. Przetnij skórę pokrywającą czaszkę małym nożyczkiem.Czystymi nożyczkami wejdź pod czaszkę z boku móżdżku i przetnij czaszkę w prawo i w lewo, aby umożliwić jej usunięcie. Za pomocą małej pęsety oderwij czaszkę od mózgu. Oddziel mózg od głowy i umieść go na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej dwa mililitry zimnego MEM.Pod mikroskopem stereoskopowym użyj dwóch małych pęset, aby wypreparować hipokamp. Przenieś hipokampy do przygotowanego 35-milimetrowego naczynia zawierającego MEM. Pokrój hipokampy na około milimetrowe plasterki za pomocą skalpela.Dodaj 200 mikrolitrów roztworu trypsyny. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 10% dwutlenku węgla przez 30 minut. Po inkubacji dodaj dwa mililitry zimnego MEM do naczynia, aby dezaktywować trypsynę.Następnie użyj szklanej pipety Pasteura o największej średnicy, aby przenieść trypsynizowaną tkankę do 15-mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr pożywki pierwszego dnia, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Rozcier tkankę, przepuszczając ją przez szklaną pipetę o największej średnicy 10 do 15 razy. Następnie powtórz ten proces za pomocą szklanej pipety o średnicy medium.Kontynuuj rozcieranie pipetą o najmniejszej średnicy. Unikaj bulgotania, aby zmniejszyć śmierć komórki. Pozwól odłączonym kawałkom tkanki opaść na dwie do pięciu minut.Następnie przenieś supernatant do innej 15-mililitrowej probówki. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Aby osiągnąć preferowaną gęstość komórek od 200 000 do 400 000 komórek na mililitr.Użyj pożywki pierwszego dnia do rozcieńczenia. Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów komórek na każdym szklanym szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że całe szkiełko nakrywkowe jest pokryte komórkami.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 10% dwutlenku węgla. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej neuronów do studzienek. Za pomocą pęsety usuń podłoże z pierwszego dnia, przechylając szkiełko nakrywkowe i delikatnie przenosząc każde szkiełko nakrywkowe do odpowiedniego dołka.Odessać pozostały nośnik z pokrywy. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 10% dwutlenku węgla. Utrzymuj inkubator w maksymalnym nawilżeniu za pomocą tacki z wodą na dnie inkubatora.Nie wymieniaj nośnika. Kultury można utrzymywać w tych warunkach do jednego miesiąca. W tym badaniu zarówno mielenie ręczne, jak i mielenie elektryczne przyniosły podobne wyniki, z mieszanką ziaren o wielkości od 20 do 200 mikrometrów.Sitka ręczne lub elektryczne wytwarzały dwa rodzaje mieszanek zbożowych. Jeden z ziarnami o wielkości od 40 do 200 mikrometrów, a drugi o wielkości 40 mikrometrów lub mniej. Mikrofotografie z kontrastem fazowym pokazują, że hodowla komórek hipokampa na szkiełkach nakrywkowych pokrytych ziarnami szkieletu koralowca tworzyła złożone sieci neuronalne przy braku i obecności macierzy.Barwienie jąder komórkowych wykazało, że 14 dni po wysiewie gęstość komórek była wyższa na matrycy niż na niepowlekanych szkiełkach nakrywkowych. Barwienie białkiem drugim związanym z mikrotubulami wykazało, że na matrycy utworzyła się złożona sieć neuronalna i dendrytyczna w porównaniu z kontrolą. Ponadto komórki glejowe wyhodowane na matrycy szkieletu koralowca uwidocznione za pomocą kwaśnego białka fibrylarnego gleju uległy znaczącym zmianom morfologicznym.Uzyskały ostrzejszy wygląd, z dłuższymi procesami, niż komórki glejowe wyhodowane na podłożu kontrolnym, gdzie wydawały się bardziej okrągłe i płaskie. Podczas izolowania komórek ważne jest, aby pamiętać o szybkiej pracy, utrzymaniu pH poprzez dodanie CO2 w razie potrzeby i pracy tak delikatnie, jak to możliwe, aby zapobiec oderwaniu się ziaren koralowców.

increasing-durability-dissociated-neural-cell-cultures-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hodowli neuronów korowych szczura w obecności warstwy zasilającej z gleju. Hodowane neurony wykazują polaryzację i tworzą synapsy; mogą zostać one oddzielone od gleju w celu wykorzystania w różnych zastosowaniach, takich jak elektrofizjologia, obrazowanie wapnia, testy przeżywalności komórek, immunocytochemia oraz izolacja RNA/DNA/białek.

Bilaminarna kokultura pierwotnych neuronów korowych i gleby szczura

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Ten film prezentuje tworzenie 3D spolaryzowanego modelu tkanki nerwowej z wykorzystaniem rusztowań jedwabno-kolagenowych. Szczegółowo opisuje proces wysiewania komórek neuronalnych na porowatych rusztowaniach z jedwabiu, inkubacji w celu przyczepienia komórek, osadzania rusztowania kolagenem i podkreśla znaczenie wspierającej macierzy kolagenowej w tworzeniu spolaryzowanego modelu tkanki nerwowej 3D.

Opracowanie zmodyfikowanego modelu 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej na bazie jedwabiu

Ten film demonstruje technikę generowania trójwymiarowego systemu modeli wspólnej hodowli pierwotnych ludzkich fibroblastów rogówki i zróżnicowanych komórek neuronalnych. Ten system kohodowli może być wykorzystany do badania interakcji zrębu i nerwów.

Generowanie modelu 3D kokultury ludzkich fibroblastów i neuronów rogówki

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Komórki zrębu szpiku (MSC) o potencjale neuronalnym istnieją w szpiku kostnym. Nasz protokół wzbogaca tę populację komórek poprzez wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, a następnie kieruje je do dojrzałych komórek Schwanna.

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Ten protokół opisuje nowatorski trójwymiarowy model in vitro, w którym komórki zrębu rogówki i zróżnicowane komórki neuronalne są hodowane razem, aby pomóc w badaniu i zrozumieniu interakcji dwóch typów komórek.

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Poznaj metodę zwiększania trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej. Technika ta wspiera wzrost neuronów, glejów i komórek macierzystych in vitro.

Zwiększenie trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej

Przeglądaj więcej filmów