Zwiększenie trwałości zdysocjowanych kultur komórek nerwowych z wykorzystaniem biologicznie aktywnej matrycy koralowej
3 czerwca 2020
Zdysocjowana hodowla komórek hipokampa jest kluczowym narzędziem eksperymentalnym w neurobiologii. Przeżycie i funkcja komórek nerwowych w hodowli jest zwiększona, gdy szkielety koralowców są używane jako matryce, ze względu na ich rolę neuroprotekcyjną i neuromodulacyjną. W związku z tym komórki nerwowe hodowane na macierzy koralowej wykazują większą trwałość, a tym samym są bardziej odpowiednie do hodowli.
Znaczenie tego protokołu polega na tym, że zapewnia on nowy sposób na zwiększenie trwałości i wzrostu neuronów, komórek glejowych i macierzystych in vitro. Ma to również zastosowanie do innych komórek. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie matrycy wykonanej ze szkieletu koralowca.
Ta matryca pielęgnuje i chroni komórki nerwowe oraz wspomaga ich odrastanie. Będąc wsparciem dla komórek nerwowych in vitro, szkielet koralowca może funkcjonować podobnie jak implant regeneracyjny w miejscach uszkodzenia mózgu. Na początek użyj młotka, aby rozbić szkielet koralowca i podzielić go na fragmenty o długości od 0,5 do dwóch centymetrów.
W celu rozpuszczenia pozostałości organicznych i nieorganicznych namocz fragmenty szkieletu koralowca w 10% roztworze podchlorynu sodu przez 10 minut. Następnie umyj raz wodą podwójnie destylowaną. Aby usunąć pozostałe pozostałości organiczne, namocz fragmenty w jednomolowym roztworze wodorotlenku sodu na pięć minut, a następnie przemyj raz wodą podwójnie destylowaną.
Kontynuuj usuwanie osadów organicznych, mocząc fragmenty w 30% roztworze nadtlenku wodoru przez 10 minut i umyj fragmenty trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. Usuń jak najwięcej nadmiaru podwójnie destylowanej wody i pozostaw fragmenty koralowców w kapturze do wyschnięcia. Następnie wyczyść szkiełka szklanej pokrywy, mocząc je w 10 mililitrach 95% etanolu na 100-milimetrowej szklanej szalce Petriego.
Po 15 minutach usuń etanol i umyj trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą, odczekując 10 minut między każdym myciem. Wyjmij podwójnie destylowaną wodę i umieść naczynie na rozgrzanej do 80 stopni Celsjusza płycie grzewczej. Następnie delikatnie mieszaj szkiełka nakrywkowe, aż podwójnie destylowana woda odparuje.
Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie. Zmiel fragmenty szkieletu koralowca za pomocą moździerza i tłuczka aż do całkowitego rozpadu. Uzyskuje się mieszaninę ziaren o rozmiarach od 20 do 200 mikrometrów.
Alternatywnie zmiel fragmenty szkieletu koralowca za pomocą szlifierki elektrycznej o długości ostrza sześciu centymetrów i szerokości od 0,5 do jednego centymetra, z prędkością 1000 obr./min przez 30 sekund. Aby oczyścić ziarna, przenieś je na elektryczne sitko filtracyjne o średnicy 40 mikronów. Dostosuj ustawienia filtra elektrycznego do wstrząsania z prędkością 600 amplitud na minutę i odbijania się sześć razy na sekundę.
Następnie zautoklawuj ziarna. W sterylnych warunkach dodaj ziarna szkieletu koralowca do 20 mikrogramów na mililitr PDL, rozpuszczonych w roztworze Hanka, aby osiągnąć stężenie pięciu miligramów lub 10 miligramów ziaren na jeden mililitr roztworu PDL. Wlać roztwór do kolb i szalek w stężeniu około dwóch mililitrów na 25 centymetrów kwadratowych i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Ziarna opadają i przyczepiają się do dna. Następnego dnia umyj kolby i naczynia sterylną wodą podwójnie destylowaną. Pozostaw kolby i naczynia do wyschnięcia w okapie.
Aby pokryć szklane szkiełko nakrywkowe, najpierw dodaj ziarna szkieletu koralowca do podwójnie destylowanej wody o stężeniu pięciu lub 10 miligramów na mililitr. Umieść szkiełka nakrywkowe na płycie grzewczej podgrzanej do 80 stopni Celsjusza. Następnie wlej 40 mikrolitrów roztworu zbożowego na środek szkiełka nakrywkowego i odczekaj 15 minut do całkowitego odparowania.
Spowoduje to, że ziarna będą przylegać do szkiełka nakrywkowego. Powlekane szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w sterylnych warunkach. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe na wieczku sterylnej płytki 24-dołkowej, dodaj 100 mikrolitrów 20 mikrogramów na mililitr roztworu PDL do każdego szkiełka nakrywkowego.
Użyj końcówki, aby upewnić się, że płyn pokrywa cały obszar ziarna i resztę powierzchni szkiełka nakrywkowego. Przykryj pokrywkę dnem talerza i owiń boki miejsca folią parafinową. Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia umyj szkiełka nakrywkowe raz wodą podwójnie destylowaną i wysusz w kapturze. Po przygotowaniu głów szczeniąt szczurów trzymaj je z pyska dużą pęsetą. Przetnij skórę pokrywającą czaszkę małym nożyczkiem.
Czystymi nożyczkami wejdź pod czaszkę z boku móżdżku i przetnij czaszkę w prawo i w lewo, aby umożliwić jej usunięcie. Za pomocą małej pęsety oderwij czaszkę od mózgu. Oddziel mózg od głowy i umieść go na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej dwa mililitry zimnego MEM.
Pod mikroskopem stereoskopowym użyj dwóch małych pęset, aby wypreparować hipokamp. Przenieś hipokampy do przygotowanego 35-milimetrowego naczynia zawierającego MEM. Pokrój hipokampy na około milimetrowe plasterki za pomocą skalpela.
Dodaj 200 mikrolitrów roztworu trypsyny. Delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 10% dwutlenku węgla przez 30 minut. Po inkubacji dodaj dwa mililitry zimnego MEM do naczynia, aby dezaktywować trypsynę.
Następnie użyj szklanej pipety Pasteura o największej średnicy, aby przenieść trypsynizowaną tkankę do 15-mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr pożywki pierwszego dnia, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Rozcier tkankę, przepuszczając ją przez szklaną pipetę o największej średnicy 10 do 15 razy. Następnie powtórz ten proces za pomocą szklanej pipety o średnicy medium.
Kontynuuj rozcieranie pipetą o najmniejszej średnicy. Unikaj bulgotania, aby zmniejszyć śmierć komórki. Pozwól odłączonym kawałkom tkanki opaść na dwie do pięciu minut.
Następnie przenieś supernatant do innej 15-mililitrowej probówki. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Aby osiągnąć preferowaną gęstość komórek od 200 000 do 400 000 komórek na mililitr.
Użyj pożywki pierwszego dnia do rozcieńczenia. Następnie wysiewaj 100 mikrolitrów komórek na każdym szklanym szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że całe szkiełko nakrywkowe jest pokryte komórkami.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 10% dwutlenku węgla. Następnego dnia dodaj 500 mikrolitrów pożywki wzrostowej neuronów do studzienek. Za pomocą pęsety usuń podłoże z pierwszego dnia, przechylając szkiełko nakrywkowe i delikatnie przenosząc każde szkiełko nakrywkowe do odpowiedniego dołka.
Odessać pozostały nośnik z pokrywy. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i od pięciu do 10% dwutlenku węgla. Utrzymuj inkubator w maksymalnym nawilżeniu za pomocą tacki z wodą na dnie inkubatora.
Nie wymieniaj nośnika. Kultury można utrzymywać w tych warunkach do jednego miesiąca. W tym badaniu zarówno mielenie ręczne, jak i mielenie elektryczne przyniosły podobne wyniki, z mieszanką ziaren o wielkości od 20 do 200 mikrometrów.
Sitka ręczne lub elektryczne wytwarzały dwa rodzaje mieszanek zbożowych. Jeden z ziarnami o wielkości od 40 do 200 mikrometrów, a drugi o wielkości 40 mikrometrów lub mniej. Mikrofotografie z kontrastem fazowym pokazują, że hodowla komórek hipokampa na szkiełkach nakrywkowych pokrytych ziarnami szkieletu koralowca tworzyła złożone sieci neuronalne przy braku i obecności macierzy.
Barwienie jąder komórkowych wykazało, że 14 dni po wysiewie gęstość komórek była wyższa na matrycy niż na niepowlekanych szkiełkach nakrywkowych. Barwienie białkiem drugim związanym z mikrotubulami wykazało, że na matrycy utworzyła się złożona sieć neuronalna i dendrytyczna w porównaniu z kontrolą. Ponadto komórki glejowe wyhodowane na matrycy szkieletu koralowca uwidocznione za pomocą kwaśnego białka fibrylarnego gleju uległy znaczącym zmianom morfologicznym.
Uzyskały ostrzejszy wygląd, z dłuższymi procesami, niż komórki glejowe wyhodowane na podłożu kontrolnym, gdzie wydawały się bardziej okrągłe i płaskie. Podczas izolowania komórek ważne jest, aby pamiętać o szybkiej pracy, utrzymaniu pH poprzez dodanie CO2 w razie potrzeby i pracy tak delikatnie, jak to możliwe, aby zapobiec oderwaniu się ziaren koralowców.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Rozdzielony hodowlą komórek hipokampu jest ulepszany przez użycie szkieletów koralowych jako matryc, które zapewniają korzyści neuroprotekcyjne i neuromodulacyjne. Ta metoda zwiększa trwałość i wzrost komórek nerwowych in vitro, czyniąc je bardziej przydatnymi do zastosowań badawczych.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Hodowla komórek
- Neurobiologia
Tło
- Szkielety koralowe służą jako wspierająca matryca dla komórek nerwowych.
- Poprawiają przetrwanie i funkcjonowanie komórek w hodowli.
- Ta technika może mieć zastosowania w medycynie regeneracyjnej.
- Szkielety koralowe mogą chronić i pielęgnować komórki nerwowe.
Cel badania
- Aby poprawić trwałość i wzrost neuronów, gligi i komórek macierzystych in vitro.
- Aby zbadać potencjał szkieletów koralowców jako matrycy dla hodowli komórek.
- Aby ocenić przydatność tej metody dla innych typów komórek.
Stosowane metody
- Kruszenie szkieletu koralowego na fragmenty o długości od 0,5 do 2 centymetrów.
- Używanie matrycy koralowej do wspierania wzrostu komórek nerwowych.
- Ocenianie trwałości i funkcji komórek w hodowli.
- Porównywanie wyników z tradycyjnymi metodami hodowli komórek.
Główne wyniki
- Komórki nerwowe hodowane na szkieletach koralowych wykazują wyższą trwałość.
- Matryca koralowa promuje odrost i wspiera funkcję komórek.
- Ta metoda może funkcjonować podobnie jak implanty regeneracyjne.
- Może być stosowana dla różnych typów komórek poza komórkami nerwowymi.
Wnioski
- Szkielety koralowe zwiększają żywotność hodowanych komórek nerwowych.
- Ta technika oferuje obiecujące podejście do badań in vitro.
- Potencjalne zastosowania w terapiach regeneracyjnych w urazach mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Durable dissociated neural cell cultures are critical for early-stage neuroscience drug discovery, enabling extended mechanistic studies and functional assays. The use of a biologically active coralline matrix addresses the persistent challenge of rapid cell death in vitro, supporting more reliable target validation and phenotypic screening. This matrix-driven approach enhances predictive confidence at key inflection points in neurobiology-focused R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Improves survival and growth of primary hippocampal neurons and glia for mechanistic interrogation.
- Enables extended observation of neural network formation and cellular responses.
- Supports functional target validation by maintaining viable, responsive cultures.
- Facilitates biological de-risking by reducing culture-induced artifacts.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible 3D substrate for standardized neural assays.
- Enhances assay reliability by supporting higher cell densities and network complexity.
- Improves imaging and quantitative analysis through matrix-controlled cell distribution.
- Enables scalable preparation of culture-ready plates for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Offers a more physiologically relevant in vitro system for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by maintaining neural phenotype and function.
- Reduces risk of false negatives in neurotoxicity and efficacy screens.
- Facilitates alignment with disease-relevant cellular behaviors.
Pipeline & Workflow Integration
This matrix-based culture method fits at the interface of early discovery and assay development, enabling robust neural models for downstream screening and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis by sustaining viable neural networks.
- Screening: Delivers reproducible, high-density cultures for quantitative phenotypic assays.
- Analytics: Enables consistent measurement of cell density, morphology, and network complexity.
- Translational Research: Provides a platform for evaluating disease-relevant cellular responses.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable matrix preparation adaptable across neural cell types and studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural assays.
- Operational Value: Standardizes culture conditions, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by reducing early-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurobiology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural cell isolation and 3D culture techniques.
- Needs access to grinding, filtration, and sterilization equipment for matrix preparation.
- Demands cross-team standardization of matrix grain size and density for reproducibility.
- Adaptable to various neural and glial cell types with protocol optimization.
- Matrix detachment and pH stability must be managed during culture handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Cleaning the Coral Skeleton Pieces and Glass Coverslips
2:07
Preparation of Coral Skeleton Grains
2:52
Preparation of Coral Grain‐Coated Dishes or Coverslips
4:40
Cultivation of Hippocampal Dissociated Cells on Coral Skeleton Grain‐Coated Glass Coverslips
7:26
Results: Coral Skeleton Grains and Hippocampal Neural Cells on the Matrix
8:52
Conclusion
