Name: Model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz a antracenu i octanu 12-O-tetradekanoilu forbolu-13 (DMBA-TPA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 12 s
Description: Poznaj dwuetapowy model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie DMBA-TPA do badania roli zapalenia w rozwoju raka. Ta metoda pozwala analizować inicjację i progresję nowotworów u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Akademię Fińską (granty 25013080481 i 25013142041 (I.J.), 286377 i 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Fundację Päivikki i Sakari Sohlberg (M.P., T.J.), Fińską Fundację Medyczną (T.P.), Konkurencyjne Finansowanie Badań Państwowych w Obszarze Odpowiedzialności Eksperckiej Szpitala Uniwersyteckiego w Tampere (grant 9V049 i 9X044 (M.P.), 9X011 i 9V010 (T.J.)), Konkurencyjne finansowanie badań przez państwo w obszarze odpowiedzialności ekspertów laboratoriów Fimlab (grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), Fińska Fundacja Kulturalna (M.V.), Fundacja Paulo (T.P.), Fińskie Towarzystwo Walki z Rakiem (M.P.), oraz Fundacja Emila Aaltonena (T.P.).

Opisany tutaj protokół został zatwierdzony przez Narodową Komisję Etyki Zwierząt Finlandii (numer protokołu ESAVI/23659/2018).
1. Zwierzęta doświadczalne, odczynniki i sprzęt
<ol>
	<li>Użyj myszy dopasowanych do wieku i płci. Rozpocznij badanie w wieku 7–9 tygodni, ponieważ skóra u większości myszy jest w fazie telogenu (faza spoczynku) mniej więcej w tym wieku2.</li>
	<li>Obserwuj zachowanie zwierząt podczas badania i jeśli walczą, co często zdarza się w przypadku samców, trzymaj je osobno. Walki mogą powodować skaleczenia skóry, które sprzyjają powstawaniu guza. Samice myszy są preferowane ze względu na ich mniej agresywne zachowanie. Typowa wielkość grupy doświadczalnej waha się między 8–20 zwierzętami na grupę24,25,26,27. 
	UWAGA: Obliczenia mocy oparte na wariancji biologicznej zaobserwowanej we wcześniejszych badaniach pomagają wybrać wystarczająco dużą wielkość grupy. Szczepy użyte jako przykłady w tym artykule to Balb/c i C57BL/6. Jednak wiele innych szczepów myszy, takich jak SENCAR i FVB, zostało użytych z modelem DMBA-TPA, a także Wistar i Sprague-Dawley rats2,28,29. Przed rozpoczęciem badania potrzebna jest licencja od krajowej lub lokalnej komisji ds. pracy ze zwierzętami. Oprócz ogólnych względów związanych z dobrostanem, punktami końcowymi specyficznymi dla modelu są zazwyczaj rak płaskonabłonkowy (SCC) i zakażenie skóry. Zadrapania na skórze spowodowane swędzeniem po zastosowaniu rakotwórczych chemikaliów w acetonie są typowe, ale poza tym zwierzęta nie powinny wykazywać żadnych oznak dyskomfortu. Regularne ważenie (np. 2 razy w miesiącu) pomaga ocenić dobrostan zwierząt.</li>
	<li>Użyj DMBA i TPA, oba rozcieńczone w acetonie. Stężenie robocze DMBA wynosi 250 g/L. Dawka dla jednego zwierzęcia to 50 μg DMBA w 200 μL acetonu. Stężenie podstawowe TPA wynosi 125 g/l, a stężenie po zabiegu 25 g/l. Dawka TPA dla jednego zwierzęcia wynosi 5 μg w 200 μl acetonu. 
	UWAGA: DMBA jest szkodliwy w przypadku połknięcia i może powodować raka. Aceton szybko odparowuje i jest łatwopalny. Może powodować zawroty głowy i podrażniać oczy. Używaj maski oddechowej i/lub pracuj pod przepływem podciśnienia. Zmień rękawice po kontakcie z którąkolwiek z tych substancji chemicznych. Indywidualnie wentylowane klatki zapobiegają rozprzestrzenianiu się chemikaliów podczas trzymania myszy. Po aplikacji należy zebrać końcówki pipet używane do obchodzenia się z DMBA i wyrzucić jako odpady niebezpieczne. 
	UWAGA: DMBA musi być chroniony przed światłem. Rozcieńczony TPA jest przechowywany w temperaturze -20 °C, najlepiej chroniony przed światłem.</li>
	<li>Zaopatrz się w następujący sprzęt: wagę, zwykłą maszynkę do golenia sierści, pipety i końcówki o odpowiednim rozmiarze, zwykłą linijkę, aparat cyfrowy, notatnik i długopis lub komputer do rejestrowania brodawczaków, system do znieczulenia wziewnego lub ogranicznik myszy z otworem z tyłu oraz system narkozy dwutlenkiem węgla do składania ofiar z myszy.</li>
</ol>
2. Indukcja i promocja brodawczaka skórnego
<ol>
	<li>Ogol skórę grzbietu i zważ zwierzę. Później należy ogolić skórę w razie potrzeby, ale nie w momencie ekspozycji na substancję chemiczną. 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas golenia wokół brodawczaków i unikaj wykonywania jakichkolwiek nacięć na skórze. Waż każde zwierzę co 2 tygodnie, aby zauważyć potencjalną utratę wagi.</li>
	<li>Nanieś 50 μg DMBA w 200 μl acetonu miejscowo na ogolony obszar za pomocą pipety 48 godzin po zgoleniu sierści. W razie potrzeby unieruchomić zwierzę za pomocą lekkiego znieczulenia wziewnego lub przytrzymywania myszy.</li>
	<li>Po 7 dniach należy podać pierwszą dawkę TPA. Nakładać miejscowo 5 μg TPA w 200 μl acetonu pipetą 2x w tygodniu, najlepiej w poniedziałek i czwartek lub wtorek i piątek.</li>
	<li>Licz, rejestruj i fotografuj brodawczaki co tydzień. Wyczuwalna masa o średnicy większej niż 1 mm jest uważana za brodawczaka, jeśli utrzymuje się dłużej niż 1 tydzień. Zaznacz każdego brodawczaka na mapie i co tydzień wymieniaj jego rozmiar. Przechowuj zdjęcia cyfrowe.</li>
</ol>
3. Składanie ofiar ze zwierząt i pobieranie próbek
<ol>
	<li>Kontynuuj leczenie, aż odpowiedź guza osiągnie plateau. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że obciążenie brodawczakiem wzrośnie 10-20 tygodni po rozpoczęciu, w zależności od użytego szczepu myszy. Plateau spodziewany jest za 15–20 tygodni. Niewielka część brodawczaków (poniżej 3%) może przekształcić się w SCC w ciągu 20–50 tygodni2.</li>
	<li>Uśmiercaj zwierzęta 24 godziny po ostatnim zastosowaniu TPA. Użyj narkozy dwutlenkiem węgla ze zwichnięciem szyjki macicy lub inną odpowiednią metodą.</li>
	<li>W zależności od pytania badawczego zbierz odpowiedni materiał próbny od zwierząt30,31.
	<ol>
		<li>Na przykład, pobierz próbki krwi przed złożeniem ofiary i oddziel osocze.</li>
		<li>Wytnij kawałki skóry do barwienia immunohistochemicznego (IHC) (np. hematoksylina i eozyna, komórki proliferujące lub zapalne).</li>
		<li>Użyj stempli biopsyjnych, aby pobrać kawałki skóry z tkanką brodawczaka lub skórą bez brodawczaka (leczoną) w celu ekspresji genów (np. qPCR) i/lub analiz białek (np. Western blot lub ELISA).</li>
		<li>Pobrać fragment śledziony i węzłów chłonnych drenujących skórę do analizy cytometrii przepływowej, jeśli pożądana jest bardziej szczegółowa analiza populacji komórek odpornościowych. Można również oddzielić warstwę naskórka i skóry właściwej w celu dalszych analiz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Statystyki
<ol>
	<li>Narysuj krzywą przeżycia Kaplana-Meiera w czasie wolnym od brodawczaka i użyj testu logarytmicznego Mantela-Coxa do przeżycia. Narysuj liniową krzywą liczby brodawczaków na tydzień. Ponieważ są to dane liczbowe, należy użyć modelu regresji nieliniowej. W razie potrzeby skonsultuj się ze statystykiem.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rak skóry wywołany przez DMBA-TPA jest jednym z najczęściej stosowanych modeli raka, ponieważ jest wysoce powtarzalny i dostarcza informacji na temat progresji guza od inicjacji do złośliwości. Kluczowa miara wyniku, czyli tworzenie brodawczaka, jest łatwa i niezawodna ilościowo. Model odnosi się zarówno do inicjacji guza (przeżycia wolnego od guza), jak i progresji (liczby i rozmiarów guza) jednocześnie. Model nadaje się do badania różnych związków, takich jak potencjalne terapie i wpływ poszczególnych genów na progresj...

Nowotwory są jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na opracowanie wiarygodnych eksperymentalnych modeli chorobowych, aby lepiej zrozumieć przebieg choroby oraz zbadać potencjalne podejścia terapeutyczne. Jednym z najczęściej stosowanych eksperymentalnych modeli in vivo do badania rozwoju raka skóry jest dwuetapowy model chemicznie indukowanej kancerogenezy skóry1,2. Model ten stanowi narzędzie do badania inicjacji, promocji i progresji nowotworu, a także specyficznych zjawisk, takich jak infiltracja komórek odpornościowych i angiogeneza.
W celu zastosowania dwuetapowego modelu kancerogenezy skóry, skórę grzbietową myszy poddaje się działaniu dwóch różnych substancji chemicznych, które wspólnie indukują powstawanie guzów. Model ten inicjuje się niską dawką mutagenu, DMBA, po czym następuje długotrwała ekspozycja na promotor nowotworowy, TPA3 (Rycina 1). DMBA powoduje losowe mutacje DNA poprzez tworzenie adduktów kowalencyjnych z DNA komórek naskórka i pierwotnych komórek macierzystych keratynocytów4,5,6,7. Część tych losowych mutacji zachodzi w protoonkogenach, takich jak Hras1 (wykrywa się również mutacje w Kras i Nras), a konwersja protoonkogenów w onkogeny napędza proces tworzenia guza pod wpływem odpowiednich bodźców. Z kolei TPA jest najczęściej stosowanym czynnikiem promującym wzrost nowotworów. Jego celem molekularnym jest kinaza białkowa C (PKC)8. TPA aktywuje również szlak sygnałowy Wnt/β-catenin, który jest kluczowy dla powstawania guzów w tym modelu9. Powtarzalna i przedłużona ekspozycja na czynnik promujący prowadzi do nasilenia sygnalizacji komórkowej, zwiększonej produkcji czynników wzrostu oraz miejscowej reakcji zapalnej, co objawia się zwiększoną syntezą DNA i naciekiem komórek zapalnych w traktowanej skórze.
Zidentyfikowano kluczowe mediatory stanu zapalnego w modelu DMBA-TPA10. Znane jest, że interleukina-17A (IL-17A) wykazuje szczególnie silne działanie tumorigenne w modelu DMBA-TPA11,12. Działa ona w synergii z interleukiną 6 (IL-6) i bierze udział w rekrutacji makrofagów oraz neutrofili13,14. Dodatkowo wykazano, że limfocyty T CD4+ oraz neutrofile wykazują działanie tumorigenne w modelu DMBA-TPA. Wreszcie, makrofagi mogą również promować tumorigenezę w tym modelu15,16,17.
W fazie promowania dochodzi do zwiększenia proliferacji zmutowanych komórek oraz utrzymuje się trwała hiperplazja naskórka1. Prowadzi to do rozwoju brodawczaków skóry w ciągu 10–20 tygodni, po czym brodawczaki zaczynają przekształcać się w guzy złośliwe, czyli raki kolumnowokomórkowe (SCCs)2. Jednak mniej niż 10% brodawczaków przechodzi w stadium złośliwości, choć odsetek ten zależy również od tła genetycznego myszy2,18. Przez dziesięciolecia nie było wiadomo, jaki typ komórek uległ pierwotnej mutacji w guzach prowadzących do złośliwości, mimo że niektóre badania wskazywały na wyraźnie odmienne cechy guzów złośliwych w porównaniu z łagodnymi brodawczakami19,20. Niemniej jednak ostatnie badania znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat klonalnego pochodzenia tworzenia guzów w modelu DMBA-TPA21.22.23. Wykazano, że w tworzeniu guza uczestniczą zarówno komórki nabłonkowe pochodzące ze szpiku kostnego, jak i komórki macierzyste mieszków włosowych22. Badania śledzenia linii komórkowych specyficzne dla poszczególnych etapów ujawniły, że łagodne brodawczaki mają pochodzenie monoklonalne, lecz rekrutują one nowe populacje komórek nabłonkowych21,23. Jednak tylko jeden z klonów komórkowych pełni funkcję drivera kancerogenezy; zawiera on mutację Hras23. Progresja do stadium raka wiąże się z zjawiskiem clonal sweep23.
Karcynogen DMBA inicjuje tworzenie się brodawczaków, a TPA promuje wzrost guza. Zatem proces inicjacji nowotworu można badać oddzielnie od procesu promocji, przerywając eksperyment przed okresem podawania TPA. Ponieważ progresja nowotworu jest monitorowana co tydzień, daje to doskonałą okazję do szczegółowej analizy wzrostu guza w trakcie całego badania. Ponieważ guzy są generowane przez zewnętrzne substancje chemiczne, mutacja onkogenna w linii zarodkowej nie jest konieczna. W związku z tym badanie wpływu tła genetycznego (np. knockout/transgen w porównaniu z typem dzikim) na tumorigenezę jest proste2. Podsumowując, model raka skóry indukowanego DMBA/TPA jest szczególnie użytecznym podejściem do badania roli układu odpornościowego w progresji nowotworu, a także do oceny etapów inicjacji i promocji guza w sposób niezależny lub współzależny.
<img alt="Proces kancerogenezy chemicznej, schemat osi czasu, inicjacja DMBA, promocja TPA, wynik w modelu mysim." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat modelu kancerogenezy skóry indukowanej DMBA-TPA. Kancerogen DMBA jest stosowany miejscowo w celu wywołania mutacji DNA w fazie inicjacji modelu. Agent promujący wzrost TPA jest podawany 2x w tygodniu, aby wzmocnić proliferację komórek podczas fazy promocji, co prowadzi do rozwoju papilniaków w skórze. Zwierzęta są uśmiercane po tym, jak odpowiedź w postaci papilniaków osiągnie plateau, zazwyczaj między 15. a 20. tygodniem, w zależności od tła genetycznego myszy. Niewielka część papilniaków może w dalszym ciągu przekształcić się w SCC w ciągu 20–50 tygodni. Aby badać wczesne zdarzenia w fazie inicjacji i wczesnej promocji, można pobrać próbki (np. krótko po drugiej aplikacji TPA). Przedstawiono reprezentatywne zdjęcie oraz przekrój poprzeczny papilniaków na skórze myszy C57BL/6 po 19 tygodniach leczenia, barwiony hematoksyliną i eozyną. Pasek skali = 0.1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>1000 ul RPT XL Końcówka filtra stopniowego (sterylna), Wkład</td><td>Starlab</td><td>S1182-1730-C</td><td></td></tr><tr><td>300 ul RTP Końcówka filtra stopniowego (sterylna), Wkład</td><td>Starlab</td><td>S1180-9710-C</td><td></td></tr><tr><td>7,12-Dimethylbenz[a]antracen (DMBA)</td><td>Sigma</td><td>D3254-100MG</td><td>Działa szkodliwie w przypadku połknięcia i może powodować raka. Przechowywać w bezpiecznym miejscu.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>1000141011</td><td>szybko odparowuje i jest łatwopalny.</td></tr><tr><td>Attane vet 1000 mg/g</td><td>Piramal Critical Care Limited</td><td></td><td>Płynny izofluran do inhalacji</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia na baterie Isis</td><td>Albert Kerlb GmbH</td><td>GT421</td><td>Do golenia sierści</td></tr><tr><td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td><td>ZeoSys GmbH</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Linijka Linex Nature N1030 30 cm</td><td>Zszywki Business Advantage</td><td>60383</td><td>Do pomiaru brodawczaków</td></tr><tr><td>Średnia komora CO2 300 x 200 x 200 mm - Red</td><td>VetTech Solutions Ltd</td><td>AN045AR</td><td>Na ofiarę</td></tr><tr><td>Mekasoft</td><td>Mekalasi</td><td>23008</td><td>Obrus</td></tr><tr><td>Myszy (Balb/c JRj)</td><td>Janvier labs</td><td></td><td>Możliwe również inne szczepy</td></tr><tr><td>Myszy (C57BL/6JRj)</td><td>Janvier labs</td><td></td><td>Możliwe również inne szczepy</td></tr><tr>Aparat <td></td><td></td><td>cyfrowy Panasonic Lumix DMC-FS5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>Do próbek histologicznych</td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octan forbolu znany również jako 12-octan 12-Otetradecanoylphorbol-13 (TPA)</td><td>Enzo</td><td>BML-PE160-0001</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna PLJ-C/PLJ-G</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>PLJ 600-3CM</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S / S Obudowa</td><td>VetTech Solutions Ltd</td><td>AN044BX</td><td>Do poświęcenia</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Do próbek kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Pipeta Tacta 100-1000 ul</td><td>Sartorius</td><td>LH-729070</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Tacta 20-200 ul</td><td>Sartorius</td><td>LH-729060</td><td></td></tr><tr><td>UNO Anesthetic Key Filler</td><td>Oprzyrządowanie Scintica inc.</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>UNO Maska na twarz dla myszy</td><td>Scintica oprzyrządowanie inc.</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>UNO FM2200 Przepływomierz</td><td>Scintica oprzyrządowanie inc.</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>UNO Gas Exhaust Unit</td><td>Oprzyrządowanie Scintica inc.</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Skrzynka indukcyjna UNO</td><td>Oprzyrządowanie Scintica inc.</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>UNO200VAP Vaporizer</td><td>Scintica oprzyrządowanie inc.</td><td></td><td>Do znieczulenia</td></tr></tbody></table>

model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz[a]antracenu i octanu 12-o-tetradekanoilu forbolu-13 (dmba-tpa)

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

Rak jest jedną z najbardziej wyniszczających chorób człowieka. Eksperymentalne modele nowotworów są ważne, aby uzyskać wgląd w złożone wzajemne oddziaływanie różnych typów komórek i genów w promowaniu progresji nowotworu oraz zapewnić platformę do testowania skuteczności różnych podejść terapeutycznych. Jednym z najczęściej stosowanych eksperymentalnych modeli raka zapalnego jest dwuetapowy model kancerogenezy skóry DMBA-TPA. Powstawanie guza jest indukowane w tym modelu przez miejscowe stosowanie dwóch różnych substancji chemicznych, 7,12-dimetylobenz[a]antracenu (DMBA) i octanu 12-O-tetradekanolofral-13-forbolu (TPA), które razem powodują powstawanie brodawczaka w skórze. Ponieważ głównym wynikiem jest tworzenie się brodawczaka w skórze, model jest idealnym, niezawodnym i powtarzalnym sposobem radzenia sobie zarówno z inicjacją guza (przeżycie wolne od guza), jak i progresją guza (liczba i wielkość widocznych guzów). Efekty leczenia DMBA-TPA są przekazywane za pośrednictwem mechanizmu zapalnego, co sprawia, że model ten jest szczególnie odpowiedni do badania roli układu odpornościowego w tworzeniu nowotworów. Jednak ten model jest ograniczony do skóry i innych powierzchni, na które można nakładać chemikalia. W tym artykule znajduje się szczegółowy protokół umożliwiający pomyślne korzystanie z modelu.

Głównym punktem końcowym jest czas przeżycia (tj. czas do pojawienia się brodawczaka) w grupach leczonych lub grupach genotypowych. Wtórnym punktem końcowym jest liczba brodawczaków na tydzień w każdej grupie (Rysunek 2). Oczekiwanymi wynikami są statystycznie istotne różnice w czasie do pojawienia się brodawczaka oraz w liczbie brodawczaków pomiędzy grupami eksperymentalnymi (dwoma lub więcej). Zaleca się liczenie brodawczaków i wykreślanie krzywej w fazie promocji (TPA), aby uzyskać obraz ...

Dwuetapowa kancerogeneza skóry jest indukowana przez dwie miejscowo stosowane substancje chemiczne. Mutagen 7,12-dimetylobenzantracen) powoduje mutacje w komórkach naskórka, a ciągłe stosowanie ogólnego stymulatora wzrostu octanu 12-O-tetradekanoiloforbol-13 przyspiesza powstawanie brodawczaków skóry.

Model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz[a]antracenu i octanu 12-O-tetradekanoilu forbolu-13 (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Ten dwuetapowy model raka skóry umożliwia badanie roli stanu zapalnego w raku skóry i pozwala na badanie inicjacji guza jako procesu odrębnego od progresji nowotworu. Powstawanie guza w tym modelu jest indukowane chemicznie i pozwala na wykorzystanie szczepów nokautujących do badania wpływu czynników środowiskowych lub kandydatów terapeutycznych. Model doskonale nadaje się do badania roli układu odpornościowego i angiogenezy w nowotworach.Wykazuje podobną patologię choroby do raka płaskonabłonkowego u ludzi. Chociaż ta metoda jest stosunkowo łatwa do przeprowadzenia, niezbędne jest dokładne wyczucie czasu. Ważne jest również, aby podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z DMBA, który jest substancją rakotwórczą.Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść agresywne myszy w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni w oddzielnych klatkach, aby uniknąć walki i zmian skórnych. W celu indukcji brodawczaka skórnego należy najpierw ogolić skórę grzbietową zwierząt doświadczalnych i zważyć myszy indywidualnie. 48 godzin po goleniu za pomocą pipety nałóż 50 mikrogramów DMBA w 200 mikrolitrach acetonu na ogolony obszar każdej znieczulonej myszy.W celu promocji brodawczaka skórnego, siedem dni po zastosowaniu DMBA należy podawać skórze pięć mikrogramów TPA w 200 mikrolitrach acetonu dwa razy w tygodniu do końca eksperymentu. Badaj zwierzęta pod kątem brodawczaków i co tydzień fotografuj i zapisuj wielkość każdego pojedynczego brodawczaka na mapie. Wyczuwalna masa o średnicy większej niż jeden milimetr jest uważana za brodawczaka, jeśli utrzymuje się dłużej niż tydzień.Gdy odpowiedź guza osiągnie plateau, należy pobrać odpowiedni materiał próbki od zwierząt 24 godziny po ostatnim zastosowaniu TPA i pobrać kawałki skóry o pełnej grubości do analizy immunohistochemicznej. Użyj stempla biopsyjnego, aby pobrać fragmenty skóry z próbek skóry brodawczaka i bez brodawczaka do ekspresji genów i/lub analizy białek, a następnie użyj skalpela, aby pobrać fragmenty skóry z brodawczaka i skóry bez brodawczaka do analizy immunohistochemicznej. Następnie zbierz węzły chłonne drenujące skórę i kawałek śledziony do analizy cytometrii przepływowej zgodnie z życzeniem.Statystycznie istotną różnicę w czasie wolnym od brodawczaka i liczbie brodawczaków między grupami eksperymentalnymi obserwuje się zwykle w modelu guza DMBA TPA. Analizy histologiczne są odpowiednie do badania struktury brodawczaków, morfologii skóry lub infiltracji komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania. Niezbędne jest równomierne nakładanie DMBA i TPA na skórę oraz stosowanie TPA w stałych odstępach czasu.Ważne jest również, aby regularnie liczyć brodawczaki. Mechanizmy wpływające na liczbę i czas powstawania guza można badać przy użyciu różnych metod, w tym immunohistochemii, cytometrii przepływowej, ilościowego PCR i analizy białek. Ta konwencjonalna technika może być łatwo zaadaptowana i zastosowana do badania wpływu różnych genów, czynników środowiskowych lub interesujących terapii na inicjację i progresję guza.Podczas wykonywania tej techniki należy zachować ostrożność, ponieważ DMBA jest rakotwórcze, a aceton szybko odparowuje. Zalecana jest odpowiednia maska oddechowa i korzystanie z komory przepływowej.

chemical-induced-skin-carcinogenesis-model-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przedstawiamy protokół, w którym podanie genotoksycznego czynnika azoksymetanu (AOM), a następnie trzy cykle podania prozapalnego dekstranu siarczanu sodu (DSS), pozwala na szybkie i powtarzalne wywołanie guzów okrężnicy u myszy, wykazujących podobieństwa morfologiczne i molekularne do nowotworów związanych z zapaleniem jelita grubego u ludzi.

Modelowanie raka związanego z zapaleniem jelita grubego z wykorzystaniem azoksymetanu (AOM) i dekstranu siarczanowego sodu (DSS)

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. W tym filmie z protokołem metoda oparta na PDT jest stosowana do oceny potencjału fototoksycznego potencjalnego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc.

Test fototoksyczności in vitro: metoda oparta na PDT do oceny potencjału fototoksycznego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc

Ten film opisuje procedurę wywoływania dwuetapowej kancerogenezy skóry w celu zbadania inicjacji guza poprzez miejscowe stosowanie chemikaliów. W pierwszym etapie na skórę modelu mysiego nakłada się mutagen, DMBA, który inicjuje powstawanie nowotworu poprzez powodowanie mutacji w komórkach macierzystych, a następnie stosuje się stymulator wzrostu, TPA, który przyspiesza powstawanie brodawczaka skóry.

Indukowany chemicznie dwuetapowy model kancerogenezy skóry: eksperymentalny mysi model raka skóry in vivo

Ten film opisuje metodę pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w humanizowanym modelu myszy - modelu myszy, który naśladuje ludzką skórę. Określamy minimalną dawkę rumieniową (MED) promieniowania UV, które może powodować rumień lub obrzęk skóry. Metoda może pomóc w ustaleniu skuteczności leków stosowanych w celu zmniejszenia wrażliwości na promieniowanie UV.

Test minimalnej dawki rumieniowej: metoda pomiaru wrażliwości na promieniowanie UV w modelach mysich

Karcynogeneza to proces obejmujący interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem nowotworu. Aby przeanalizować zdarzenia molekularne, należy wyizolować różne populacje komórek na różnych etapach rozwoju raka. Korzystając z mysiego modelu raka podstawnokomórkowego, opisujemy protokół analizy komórek podczas kancerogenezy.

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Melanina naskórkowa jest indukowana przez miejscowe stosowanie forskoliny w mysim modelu człowieka o jasnej karnacji, wrażliwego na promieniowanie UV.    Farmakologiczna manipulacja poziomami cAMP w skórze i ciemnienie naskórka silnie chronią przed stanem zapalnym o podłożu UV (oparzenia słoneczne), mierzonym za pomocą testu minimalnej dawki rumieniowej (MED).

Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Celem tego protokołu jest wywołanie przejściowej produkcji in vivo nieśmiertelnych poziomów reaktywnych form tlenu (ROS) w skórze myszy, co dodatkowo promuje reakcje fizjologiczne w tkance.

Stymulacja nisz komórek macierzystych i regeneracji tkanek w skórze myszy za pomocą przełączanej fotogeneracji reaktywnych form tlenu in situ zależnej od protoporfiryny IX

Zstandaryzowany protokół indukowania przedwczesnego starzenia się w HNM z użyciem tBHP, zstandaryzowane protokoły do analizy kluczowych markerów starzenia się, w tym zatrzymania wzrostu, aktywności SA-β-galaktozydazy i czynników SASP.

Znormalizowany protokół wywoływania starzenia się przedwczesnego wywołanego stresem w pierwotnych ludzkich melanocytach z użyciem hydronadtlenku tert-butylu

Poznaj dwuetapowy model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie DMBA-TPA do badania roli zapalenia w rozwoju raka. Ta metoda pozwala analizować inicjację i progresję nowotworów u myszy.

Model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz a antracenu i octanu 12-O-tetradekanoilu forbolu-13 (DMBA-TPA) (Wideo) | JoVE Journal

Model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz[a]antracenu i octanu 12-O-tetradekanoilu forbolu-13 (DMBA-TPA)

Przeglądaj więcej filmów