Model kancerogenezy skóry indukowanej chemicznie z wykorzystaniem dimetylobenz[a]antracenu i octanu 12-O-tetradekanoilu forbolu-13 (DMBA-TPA)
19 grudnia 2019
Dwuetapowa kancerogeneza skóry jest indukowana przez dwie miejscowo stosowane substancje chemiczne. Mutagen 7,12-dimetylobenzantracen) powoduje mutacje w komórkach naskórka, a ciągłe stosowanie ogólnego stymulatora wzrostu octanu 12-O-tetradekanoiloforbol-13 przyspiesza powstawanie brodawczaków skóry.
Ten dwuetapowy model raka skóry umożliwia badanie roli stanu zapalnego w raku skóry i pozwala na badanie inicjacji guza jako procesu odrębnego od progresji nowotworu. Powstawanie guza w tym modelu jest indukowane chemicznie i pozwala na wykorzystanie szczepów nokautujących do badania wpływu czynników środowiskowych lub kandydatów terapeutycznych. Model doskonale nadaje się do badania roli układu odpornościowego i angiogenezy w nowotworach.
Wykazuje podobną patologię choroby do raka płaskonabłonkowego u ludzi. Chociaż ta metoda jest stosunkowo łatwa do przeprowadzenia, niezbędne jest dokładne wyczucie czasu. Ważne jest również, aby podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z DMBA, który jest substancją rakotwórczą.
Przed rozpoczęciem eksperymentu umieść agresywne myszy w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni w oddzielnych klatkach, aby uniknąć walki i zmian skórnych. W celu indukcji brodawczaka skórnego należy najpierw ogolić skórę grzbietową zwierząt doświadczalnych i zważyć myszy indywidualnie. 48 godzin po goleniu za pomocą pipety nałóż 50 mikrogramów DMBA w 200 mikrolitrach acetonu na ogolony obszar każdej znieczulonej myszy.
W celu promocji brodawczaka skórnego, siedem dni po zastosowaniu DMBA należy podawać skórze pięć mikrogramów TPA w 200 mikrolitrach acetonu dwa razy w tygodniu do końca eksperymentu. Badaj zwierzęta pod kątem brodawczaków i co tydzień fotografuj i zapisuj wielkość każdego pojedynczego brodawczaka na mapie. Wyczuwalna masa o średnicy większej niż jeden milimetr jest uważana za brodawczaka, jeśli utrzymuje się dłużej niż tydzień.
Gdy odpowiedź guza osiągnie plateau, należy pobrać odpowiedni materiał próbki od zwierząt 24 godziny po ostatnim zastosowaniu TPA i pobrać kawałki skóry o pełnej grubości do analizy immunohistochemicznej. Użyj stempla biopsyjnego, aby pobrać fragmenty skóry z próbek skóry brodawczaka i bez brodawczaka do ekspresji genów i/lub analizy białek, a następnie użyj skalpela, aby pobrać fragmenty skóry z brodawczaka i skóry bez brodawczaka do analizy immunohistochemicznej. Następnie zbierz węzły chłonne drenujące skórę i kawałek śledziony do analizy cytometrii przepływowej zgodnie z życzeniem.
Statystycznie istotną różnicę w czasie wolnym od brodawczaka i liczbie brodawczaków między grupami eksperymentalnymi obserwuje się zwykle w modelu guza DMBA TPA. Analizy histologiczne są odpowiednie do badania struktury brodawczaków, morfologii skóry lub infiltracji komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania. Niezbędne jest równomierne nakładanie DMBA i TPA na skórę oraz stosowanie TPA w stałych odstępach czasu.
Ważne jest również, aby regularnie liczyć brodawczaki. Mechanizmy wpływające na liczbę i czas powstawania guza można badać przy użyciu różnych metod, w tym immunohistochemii, cytometrii przepływowej, ilościowego PCR i analizy białek. Ta konwencjonalna technika może być łatwo zaadaptowana i zastosowana do badania wpływu różnych genów, czynników środowiskowych lub interesujących terapii na inicjację i progresję guza.
Podczas wykonywania tej techniki należy zachować ostrożność, ponieważ DMBA jest rakotwórcze, a aceton szybko odparowuje. Zalecana jest odpowiednia maska oddechowa i korzystanie z komory przepływowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia dwuetapowy model kancerogenezy skóry, który pozwala badaczom na analizę roli stanu zapalnego w raku skóry. Model ten wykorzystuje mutagen oraz stymulator wzrostu w celu indukcji tworzenia nowotworów, dostarczając informacji na temat inicjacji i progresji guza.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Kancerogeneza
- Stan zapalny
Wstęp
- Dwuetapowa kancerogeneza skóry obejmuje zastosowanie mutagenu i stymulatora wzrostu.
- Model ten jest istotny w badaniach nad rakiem kolczystokomórkowym.
- Precyzyjne ramy czasowe oraz środki bezpieczeństwa są kluczowe w konfiguracji eksperymentalnej.
- Szczepy knockout mogą być wykorzystywane do badania czynników środowiskowych i terapeutycznych.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów inicjacji i progresji nowotworu.
- Ocena roli układu odpornościowego w raku skóry.
- Ocena angiogenezy w kontekście nowotworów indukowanych chemicznie.
Zastosowane metody
- Miejscowe podanie 7,12-dimetylbenzo[a]antracenu (DMBA).
- Ciągłe podawanie 12-O-tetradekanoiloforbolu-13-octanu (TPA).
- Wykorzystanie szczepów z nokautem genów do badań nad czynnikami środowiskowymi.
- Monitorowanie powstawania i progresji guzów w czasie.
Główne wyniki
- Model pomyślnie naśladuje patologię raka płaskonabłonkowego u ludzi.
- Stan zapalny odgrywa istotną rolę w rozwoju nowotworu.
- Dokładne określenie czasu jest niezbędne dla powtarzalności wyników.
- Protokoły bezpieczeństwa są konieczne podczas pracy z substancjami rakotwórczymi.
Wnioski
- Model dwuetapowy jest skuteczny w badaniu mechanizmów raka skóry.
- Zapewnia on platformę do testowania potencjalnych kandydatów terapeutycznych.
- Dalsze badania mogą pogłębić zrozumienie biologii nowotworów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dwuetapowy model kancerogenezy skóry indukowanej DMBA-TPA stanowi wiarygodną platformę do analizy inicjacji i progresji nowotworów w przedklinicznych badaniach onkologicznych. Jego powtarzalność oraz ilościowe wyniki pomiarów wspierają mechanistyczną weryfikację ryzyk związanych ze szlakami zapalnymi i immunologicznym promowaniem nowotworów. Umożliwia to podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o dane na etapie wczesnego odkrywania oraz priorytetyzację portfolio w programach dermatologicznych i immunoonkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie inicjacji guza w przeciwieństwie do jego progresji przy użyciu chemicznych czynników drażniących podawanych w odstępach czasowych.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celów w kancerogenezie indukowanej stanem zapalnym poprzez analizę szczepów z nokautem genów.
- Wartość naukowa: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację infiltracji komórek odpornościowych oraz wkładu angiogenezy w tworzenie guza.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość użytkowa: Generuje zestandaryzowane, mierzalne wartości liczby brodawek oraz wskaźniki wzrostu do przesiewu związków.
- Wartość użytkowa: Dostarcza powtarzalne wyniki czasu do powstania guza oraz wielokrotności zmian, odpowiednie do standaryzacji testu.
- Wartość użytkowa: Umożliwia skalowalną ocenę kandydatów terapeutycznych wpływających na etapy inicjacji lub promocji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Modeluje patologię raka kolistościennego u ludzi, co pozwala na zastosowanie w badaniach nad wskazaniami w onkologii dermatologicznej.
- Wartość translacyjna: Łączy mechanizmy zapalne z progresją nowotworu, wspierając przedkliniczną walidację zgodną z biomarkerami.
- Wartość translacyjna: Stanowi platformę do testowania środków immunomodulujących i antyangiogennych w fizjologicznie istotnym kontekście.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w obszarze immunoonkologii oraz modulacji szlaków zapalnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących oddziaływań gen-środowisko w kancerogenezie z wykorzystaniem indukowalnych lub konstytutywnych modeli nokautowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych punktów końcowych, takich jak czas utajenia i obciążenie brodawczakami, w celu analizy zależności dawka-odpowiedź oraz optymalizacji związków wiodących.
- Analityka: Generuje odczyty histopatologiczne, cytometryczne i molekularne w celu skorelowania wyników fenotypowych z mechanizmem działania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej poprzez wspólne osie zapalne i angiogenne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę kancerogenezy zapalnej do przesiewania w różnych wskazaniach w przypadku nowotworów skóry i nabłonka.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozdzielenie faz inicjacji i promocji w rozwoju nowotworu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji dawkowania substancji chemicznych, czasu trwania oraz aplikacji kontrolowanej pod kątem bezpieczeństwa.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów w modelach nowotworów indukowanych stanami zapalnymi.
- Wpływ na portfolio: Dostarcza podstaw do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wskaźniki przeżycia bez nowotworu oraz postępu choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z substancjami rakotwórczymi oraz w podawaniu leków miejscowych w modelach gryzoni.
- Zależność od infrastruktury wentylacyjnej i środków ochrony indywidualnej ze względu na lotność i rakotwórczość DMBA.
- Konieczność standaryzacji chowu zwierząt w celu wyeliminowania czynników zakłócających wynikających z walk lub zmian skórnych.
- Wymaga przeszkolenia w zakresie spójnego pomiaru guzów i monitorowania podłużnego w celu uzyskania wiarygodnych punktów końcowych.
- Ograniczenie do powierzchni skórnych lub dostępnych nabłonkowych, co zawęża zastosowanie do badań nad podawaniem miejscowym lub błon śluzowych.
