Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery

Strumienie węgla w kriosferze są jeszcze prawie nie oszacowane, ale są kluczowe dla zmian klimatycznych. Prezentujemy nowatorskie prototypowe urządzenie, które rejestruje potencjał fototroficzny w środowiskach nadraglacyjnych w oparciu o technologię emisji fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.), oferując dane o wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej w warunkach in situ.

Ogólnym celem tego badania jest kalibracja i przetestowanie nowatorskiego urządzenia, które może być używane do pomiarów biomarkerów in situ w siedliskach kriosferycznych. Urządzenie oparte jest na technologii Laser-Induced Fluorescence Emission (Laserowej Emisji Fluorescencji), określanej jako LIFE. Obecne standardowe metody pobierania próbek prowadzą do fizycznych oddziaływań na próbkę w wyniku wydobycia, rozpadu próbek przez rozdrabnianie i piłowanie oraz zmiany temperatury w wyniku topienia.

Metody te często prowadzą do fałszowania warunków in situ. W związku z tym kluczowe znaczenie ma nowa metodologia wykrywania i charakteryzowania życia mikroorganizmów in situ. Opracowaliśmy nowatorską, nieinwazyjną, nieniszczącą metodę o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Zastosowanie techniki emisji fluorescencji indukowanej laserem opiera się na fakcie, że środowiska supraglacjalne zamieszkują m.in. organizmy fototropowe. Organizmy te można śledzić, wykrywając fluorescencyjne wzory dodatkowych pigmentów na bazie porfiryny, chlorofilu A i fikoerytryny, które są wzbudzane odpowiednio przez niebieski i zielony laser. Przenośny zestaw o podwójnej długości fali waży 4,5 kilograma i jest używany na statywie w połączeniu z zewnętrznym komputerem.

Tubus obiektywu jest skierowany w stronę preparatu. Następnie zielony laser o mocy pięciu miliwatów uderza w próbkę po przejściu przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej, który przekierowuje spolaryzowane światło w kierunku osi optycznej spektrometru. Okaz przedstawia światło fluorescencyjne zilustrowane na czerwono.

Połowa skolimowanego światła przechodzi przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej i jest skupiana przez filtr długoprzepustowy, który usuwa sygnały laserowe. Następnie sygnał trafia w szczelinę przysłony, która składa się z dwóch regulowanych żyletek. Pryzmat spektralnie oddziela cienką linię światła prostopadłą do otworu szczelinowego, zanim sygnał zostanie przechwycony przez czujnik.

Zabieg powtarza się za pomocą niebieskiego lasera. Surowe dane są automatycznie przesyłane do komputera przenośnego, który jest również używany do obsługi oprogramowania. Jest podzielony na trzy główne sekcje.

Regulacja ekspozycji odbywa się ręcznie. W tym przypadku korekcja między czasem ekspozycji a intensywnością sygnału jest liniowa. Pole komentarza służy do opisu próbki.

W prawej sekcji surowe obrazy są wyświetlane zaraz po zakończeniu pomiaru. Ta funkcja ma kluczowe znaczenie dla natychmiastowej oceny danych w terenie. Czerwone obszary oznaczają prześwietlone piksele, których można uniknąć, skracając czas naświetlania.

Surowe obrazy w 12-bitowej skali szarości pokazują składową przestrzenną wynikającą z jednowymiarowej szczeliny apertury oraz składową spektralną wynikającą z pryzmatu znajdującego się przed matrycą CCD. W odpowiedzi na ograniczenia optyczne surowe obrazy są zniekształcone. Dlatego należy je przyciąć i usunąć zniekształcenia, stosując kod, który rozpoznaje stopień zniekształcenia.

Następnie kalibracja długości fali odbywa się za pomocą lasera o długości fali 532 nanometrów. Zielone światło jest wytwarzane przez podwojenie częstotliwości lasera podczerwonego o długości 1 064 nanometra. Obie długości fal mogą być wykrywane przez matrycę CCD, dzięki czemu można obliczyć pozycję widmową każdego piksela na obrazach z korekcją zniekształceń.

Następnie obraz jest przycinany do określonego zakresu długości fali. Wartości szarości z każdego piksela w wybranej linii piksela są zliczane i sumowane. Wartość szarości może należeć do zakresu od zera do 255.

Następnie każda linia pikseli odpowiada za jedną liczbę. Na tym wykresie wartości szarości z każdej linii piksela są wykreślane względem współrzędnych przestrzennych. Pozwala to na ilościową dyskryminację przestrzenną chlorofilu i fikoerytryny jednocześnie w próbce.

Dodatkowo, właściwości spektralne próbki mogą być wykreślane z wybranych linii pikseli. Konfiguracja w terenie jest szybka i łatwa. Zamocuj instrument na statywie.

Podłącz tubus obiektywu do urządzenia. Podłącz USB Arduino i kamery. Podłącz komputer zewnętrzny do instrumentu za pomocą USB.

Wyreguluj nogi statywu w taki sposób, aby tubus obiektywu zakrywał preparat. Uruchom oprogramowanie, opisz próbkę i rozpocznij pomiar. Do kalibracji pigmentu należy przygotować serię rzędów rozcieńczeń z roztworu podstawowego, jak pokazano.

Roztwór podstawowy chlorofilu A należy rozcieńczyć acetonem, a rozcieńczenie fikoerytryny przeprowadza się destylowaną sterylną wodą. Piętnaście mililitrów każdego etapu rozcieńczania będzie potrzebne później. Chroń pigmenty przed światłem, owijając je folią aluminiową.

Przechowuj chlorofil w zamrażarce, a fikoerytrynę w lodówce do dalszego użycia. Następnie zbuduj stojak, jak pokazano, z różnicą wysokości 1,5 centymetra. Dodać pięć mililitrów najwyżej skoncentrowanego rozcieńczenia do plastikowej fiolki z tworzywa sztucznego do poliscyntylacji.

Objętość ta odpowiada 15-milimetrowemu słupowi wody w fiolce i mierzy intensywność fluorescencji. Następnie umieść fiolkę w środkowej pozycji stojaka i dodaj kolejne pięć mililitrów tego samego roztworu. Powtórz procedurę z kolejnymi pięcioma mililitrami, co odpowiada 45 milimetrom wysokości kolumny.

Powtórz procedurę ze wszystkimi etapami rozcieńczania chlorofilu i fikoerytryny. Wysokość stojaka i kolumny odgrywa ważną rolę w pomiarze, ponieważ powierzchnia cieczy znajduje się w centralnym punkcie urządzenia LIFE. Zbierz próbki śniegu i lodu z lodowca.

Dodatkowo należy pobrać próbki mat mikrobiologicznych z przedpola lodowca. W tym badaniu wybrano Midtre Lovenbreen, lodowiec znajdujący się w pobliżu ośrodków badawczych Ny-Alesund w wysoko-arktycznym archipelagu Svalbard. Rozpuść próbki śniegu i lodu i przefiltruj je próżniowo pod filtrami GF/F.

Zwróć uwagę na filtrowany wolumin. Następnie zmierz filtry za pomocą urządzenia LIFE na czterech losowych obszarach, każdy w trzech częściach, używając zielonego i niebieskiego lasera. Oblicz całkowite stężenie pigmentu, mnożąc gęstość obszaru przez przefiltrowany obszar i przefiltrowaną objętość.

Normalizuj stężenie pigmentu do objętości jednego litra. Umieść filtry w fiolce z 30 mililitrami acetonu i przechowuj je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie weź fiolkę i umieść ją na lodzie przed sonikacją na dwie minuty z mocą 50% w trybie ciągłym.

Ścisnąć i wyjąć filtr z fiolki. Filtr nie jest już potrzebny. Podłączyć rurkę Tygon do strzykawki i usunąć z fiolki mieszaninę acetonu do ekstrakcji chlorofilu.

Wymień rurkę Tygon na uchwyt filtra GF5. Przenieś roztwór do kuwety kwarcowej. Po skalibrowaniu spektrometru absorbancji dla acetonu, umieścić próbkę zawierającą kuwetę w spektrometrze i zmierzyć cechy absorbancji w zakresie od 400 do 750 nanometrów.

Następnie wyjmij kuwetę ze spektrometru i dodaj do próbki 200 mikrolitrów dwóch molowych kwasów solnych. Następnie powtórzyć pomiar absorbancji w celu zmierzenia zawartości feofityny w próbce. Wpływ pomiaru laserowego na aktywność zbiorowisk bakteryjnych nie jest jeszcze szczegółowo opisany.

W związku z tym efekt ten został zbadany poprzez produkcję pierwotną i wtórną. Do produkcji bakterii weź pięć porcji naszej maty bakteryjnej. Trzy podwielokrotności stosuje się do wychwytu leucyny znakowanej trytem, a dwie podwielokrotności stosuje się jako kontrole.

Dezaktywuj kontrolki formaldehydem. Dodać leucynę znakowaną trytem do wszystkich podwielokrotności. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich próbek.

W tym miejscu pokazano wymaganą ilość próbki dla naszego projektu eksperymentalnego. Następnie naświetl matę bakteryjną zielonym i niebieskim laserem, jak wskazano w konfiguracji eksperymentalnej. Następnie dezaktywuj wszystkie próbki, które nie zostały jeszcze potraktowane formaldehydem.

Przenieść próbkę do kriowialu i dodać kwas trójchlorooctowy lub TCA. Odwirować fiolkę o stężeniu 10 000 g przez pięć minut. Dodać płyn scyntylacyjny i umieścić kriowial w fiolce wieloscyntylacyjnej.

Przeanalizować próbki za pomocą licznika scyntylacji cieczy i obliczyć szybkość wychwytu. Do fotosyntezy przygotuj pięć podwielokrotności jak poprzednio, z których dwie są przyciemnione. Dodać radioaktywny znacznik NaH14 CO3 i inkubować przez cztery godziny.

Po inkubacji należy przerwać reakcję, owijając próbki folią aluminiową. Zmierz rozpady na minutę za pomocą scyntylacji cieczy, jak opisano wcześniej. Po znormalizowaniu danych dla czasu ekspozycji wynoszącego jedną sekundę i wysokości kolumny próbki wynoszącej 15 milimetrów, końcowa linia kalibracji została obliczona przy użyciu regresji Poissona.

Korelacja między gęstością obszaru a liczbą fotonów ma charakter liniowy. Nachylenie krzywej wynosi 81,04. Oznacza to, że szybkość zliczania fotonów wynosząca 8, 104 w próbce wystawionej na działanie promieni przez jedną sekundę równa się gęstości powierzchni 100 nanogramów na centymetr kwadratowy fikoerytryny.

Odchylenie standardowe w próbkach o wyższym stężeniu można wytłumaczyć procesem samoabsorpcji w próbce. Krzywa kalibracyjna chlorofilu A wykazuje podobne charakterystyki i ma charakter liniowy o nachyleniu 8,94. Sześć przefiltrowanych próbek lodu i śniegu zmierzono za pomocą instrumentu LIFE przed ekstrakcją chlorofilu, a następnie pomiarami widma absorbancji w celu analizy zawartości chlorofilu.

Próbki są uporządkowane według zawartości chlorofilu uzyskanej za pomocą spektrometrii absorbancji. Dane LIFE pokazują niewielkie odchylenia standardowe, co sugeruje, że materiał na filtrze był rozłożony stosunkowo równomiernie. Instrument LIFE zaniża zawartość chlorofilu w pierwszych trzech filtrach.

Trzy ostatnie filtry, które wykazują niższą zawartość chlorofilu, są zawyżone przez instrument LIFE. Przyczynę rozbieżności danych można wyjaśnić grubością placka filtracyjnego. W cienkich plackach filtracyjnych, zilustrowanych kolorem pomarańczowym, sygnały o niskiej fluorescencji są wychwytywane ze względu na niską gęstość obszarową pigmentów.

Sygnały chlorofilu A są zilustrowane na czerwono na tym surowym obrazie. Wszystkie szare obszary na tym surowym obrazie wskazują, że sam filtr wykazuje sygnały indukowane laserem po przejściu przez filtr długoprzepustowy o długości 450 nanometrów. Oprogramowanie błędnie policzyło ten sygnał jako fluorescencję chlorofilu A.

Wysoka zawartość pigmentu była niedoszacowana, ponieważ laser nie był w stanie wywołać odpowiedzi fluorescencyjnej w cząsteczkach chlorofilu A w głębszych warstwach placka filtracyjnego. Eksperyment z ekspozycją laserową nie wykazuje znaczącego wpływu na pierwotną i wtórną produktywność mat bakteryjnych. Ani czas naświetlania od 5 do 60 sekund, ani intensywność lasera w zakresie od 5 do 50 miliwatów nie wykazały żadnego wpływu na wyniki wydajności.

Oznacza to, że wyższe intensywności i czasy ekspozycji wymagane do wytworzenia lepszych sygnałów nie zaszkodzą komórkom. Cztery kriokonity zostały zmierzone in situ i porównane z roztworem wzorcowym chlorofilu, który został zmierzony w warunkach laboratoryjnych pokazanych na czerwono. Piki fluorescencji spektralnej w kolorze niebieskim są dopasowane do standardowego widma chlorofilu, zapewniając w ten sposób koncepcję pomiarów in-situ.

Pomiary LIFE zostały przeprowadzone na glebach, matach bakteryjnych, biofilmach i kriokonitach. Pomiary LIFE kriokonitów z grubą warstwą osadu są możliwe, jeśli powierzchnia pokryta kriokonitem przekracza 12,5 centymetra kwadratowego. Ten rodzaj kriokonitu blokuje światło rozproszone spod lodu.

W cienkich warstwach kriokonitu sygnały fluorescencyjne są osłonięte światłem otoczenia. W związku z tym pomiary LIFE powierzchni gołego lodu nie są możliwe, podczas gdy wszystkie inne typy próbek mogą być analizowane przez instrument LIFE. Zmiany temperatury prowadzą do zwiększonej dostępności wody w stanie ciekłym, co skutkuje większą aktywnością biologiczną na powierzchni lodowców.

W konsekwencji stężenie pigmentu może wzrosnąć. Kluczowe jest monitorowanie tych zmian i przewidywanie możliwych i prawdopodobnych przyszłych scenariuszy.