Name: Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: Odkryj nieinwazyjną metodę pomiaru biomarkerów w siedliskach kriosfery za pomocą technologii L.I.F.E. To nowatorskie narzędzie umożliwia wykrywanie chlorofilu A i fikoerytryny w terenie z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują pułkownikowi (IL) J.N. Pritzkerowi, Fundacji Tawani, USA, austriackiemu Federalnemu Ministerstwu Nauki, Badań i Gospodarki (Sparkling Science SPA04_149 i SPA05_201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Austriackiemu Forum Kosmicznemu (ÖWF), Romanowi Erlerowi z Hintertuxer Natur Eis Palast, Austriackiemu Federalnemu Leśnictwu i Kierownikowi Bazy Nickowi Coxowi ze Stacji Arktycznej w Ny Alesund (Svalbard). Jesteśmy również wdzięczni Sabrinie Obwegeser, Carinie Rofner i Fabianowi Drewesowi za ich pomoc podczas kręcenia filmu. Na koniec chcemy podziękować Jamesowi Bradleyowi za udzielenie głosu w towarzyszącym mu filmie.

1. Kalibracja i walidacja
UWAGA: Do kalibracji pigmentów należy przygotować szeregi rozcieńczeń z roztworów zapasowych chla i B-PE. Roztwór zapasowy chla rozcieńcza się acetonem, a B-PE sterylną wodą destylowaną. W późniejszym etapie wymagane będą 15 mL każdego stopnia rozcieńczenia. Pigmenty należy chronić przed światłem, owijając je folią aluminiową. Do czasu użycia chla należy przechowywać w zamrażarce, a B-PE w lodówce. Szczegółowy protokół przygotowania szeregu rozcieńczeń znajduje się w sekcjach 1.1 dla chla oraz 1.2 dla B-PE. Poniżej opisano laboratoryjną kalibrację chla i B-PE do detekcji i oznaczania ilościowego pigmentów za pomocą instrumentu L.I.F.E. Wcześniejsza kalibracja24 została przeprowadzona z użyciem tych samych pigmentów, co w niniejszym badaniu.
<ol>
	<li>Szereg rozcieńczeń chlorofilua
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1 mg chla (oczyszczonego z alg A. nidulans) w acetonie w probówce o pojemności 50 mL, a następnie rozcieńczyć ten roztwór zapasowy chla acetonem do następujących stężeń końcowych: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1 oraz 0,5 ng/mL.</li>
		<li>Przenieść po 15 mL każdego rozcieńczenia do probówek 50 mL i owinąć je folią aluminiową ze względu na światłoczułość. Przechowywać probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C do czasu wykonania pomiarów kalibracyjnych. 
		UWAGA: W tym miejscu można przerwać procedurę.</li>
		<li>Zmierzyć cechy absorpcji chla dla każdego rozcieńczenia w spektrofotometrze dwuwiązkowym w trzech powtórzeniach i obliczyć zawartość chla zgodnie z metodą Lorenzen25, która zostanie szczegółowo opisana w sekcji 2.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szereg rozcieńczeń PE
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy B-PE o stężeniu 4 mg/mL sterylną filtrowaną wodą (pH = 7) do następujących stężeń końcowych: 1 000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10 oraz 5 ng/mL B-PE. Przenieść po 15 mL każdego rozcieńczenia do probówki 50 mL i owinąć ją folią aluminiową. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia. 
		UWAGA: W tym miejscu można przerwać procedurę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie do kalibracji
	<ol>
		<li>Zbudować stelaż zgodnie z Rysunkiem 5, aby utworzyć trzy platformy pomiarowe, z których każda jest o 1,5 cm wyższa od poprzedniej. 
		UWAGA: Stelaż i wysokość kolumny odgrywają istotną rolę w pomiarach, ponieważ powierzchnia cieczy powinna znajdować się w punkcie ogniskowym instrumentu L.I.F.E., jak wskazano na Rysunku 5.</li>
		<li>Wlać 5 mL rozcieńczenia o najwyższym stężeniu do plastikowej fiolki poliscyntylacyjnej i umieścić ją w najwyższym punkcie stelaża. Zmierzyć intensywność fluorescencji.</li>
		<li>Umieścić fiolkę w środkowej pozycji stelaża i dodać kolejne 5 mL (całkowita objętość 10 mL). Zmierzyć intensywność fluorescencji. Powtórzyć procedurę w najniższej pozycji stelaża, dodając kolejne 5 mL (całkowita objętość 15 mL; całkowita wysokość kolumny 45 mm). 
		UWAGA: Dostosować czas ekspozycji dla każdego etapu rozcieńczania, aby zapobiec nasyceniu detektora (wartości szarości powyżej 255 w obrazach 12-bitowych) i zapewnić odpowiedni stosunek sygnału do szumu dla słabych sygnałów fluorescencji.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.3.2 i 1.3.3 dla wszystkich rozcieńczeń (kroki 1.1.1 i 1.2.1) chla oraz B-PE.</li>
		<li>Wgrać wygenerowane pliki danych do kreatora redukcji danych, aby automatycznie zliczyć i zsumować wartości szarości z każdej linii pikseli wzdłuż osi Y (rozkład przestrzenny). 
		UWAGA: Różne czasy ekspozycji są kompensowane automatycznie poprzez normalizację intensywności fluorescencji do czasu całkowania 1 s.</li>
		<li>Obliczyć gęstość powierzchniową pigmentu za pomocą analizy regresji Poissona, wykorzystując znane stężenia z serii rozcieńczeń oraz obliczone znormalizowane intensywności fluorescencji. Następnie znormalizować wyniki zliczania fluorescencji z trzech różnych wysokości kolumn do poziomu 1,5 cm (5 mL), mnożąc wyniki z każdej wysokości kolumny przez odpowiedni czynnik (czynniki 1, 0,5 i 0,33 odpowiednio dla roztworów o objętości 5 mL, 10 mL i 15 mL).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu optycznego przedstawiający refrakcję światła i analizę punktu ogniskowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Układ do kalibracji L.I.F.E. z chla i B-PE w warunkach laboratoryjnych. 
(A) Tubus soczewkowy instrumentu. (B) Zielony laser do wzbudzenia B-PE. (C) Niebieski laser do wzbudzenia chla. (D) Fiolka scyntylacyjna. (E) Punkt ogniskowy instrumentu L.I.F.E. (F) Roztwór B-PE/woda lub chla/aceton o objętości 5 mL, 10 mL i 15 mL. (G) Dystanse utrzymujące powierzchnię każdego roztworu w płaszczyźnie ogniskowej dla trzech różnych objętości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Pobieranie i przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Zbiór śniegu i lodu
	<ol>
		<li>Zebrać śnieg i lód supraglacjalny z lodowca do sterylnych worków polietylenowych i przechowywać w zamrożeniu do czasu dalszej obróbki. 
		UWAGA: W niniejszym badaniu próbki pobrano z Midtre Lovenbreen (MLB), lodowca politermalnego w pobliżu stacji badawczej Ny-Ålesund na wyspach Svalbard w wysokiej Arktyce (78°53’ N, 12°03’ E).</li>
		<li>Pobrać próbki mat bakteryjnych z przedpola lodowca do sterylnych worków polietylenowych i przetransportować wszystkie próbki do laboratorium w celu dalszej obróbki.</li>
		<li>Powoli rozmrozić zamrożony materiał w ciemności w temperaturze 4 °C. Przesączyć próbki ciekłe przez filtry GF/F (średnica 47 mm) i zanotować objętość przefiltrowanej cieczy. Filtry przechowywać w zamrożeniu do czasu dalszej obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary chlorofilu a
	<ol>
		<li>Za pomocą instrumentu L.I.F.E. zmierzyć filtr w czterech losowych obszarach, wykonując pomiary w trzech powtórzeniach z użyciem lasera zielonego i niebieskiego. Obliczyć całkowite stężenie pigmentu, mnożąc gęstość powierzchniową przez powierzchnię filtrowania oraz objętość przefiltrowanej cieczy. Znormalizować stężenie pigmentu (µg/L) do objętości 1 L.</li>
		<li>Ocenić zawartość chla na filtrach GF/F przy użyciu standardu laboratoryjnego zgodnie z protokołem Lorenzen25. W tym celu każdy z filtrów umieścić w probówce z 13 mL acetonu i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie wyjąć probówkę, umieścić ją w lodzie i poddać sonikacji przez 2 min przy mocy 50% w trybie ciągłym. Ścisnąć i wyjąć filtr z probówki.</li>
		<li>Podłączyć wężyk tygonowy do strzykawki i pobrać z probówki mieszaninę acetonu z ekstraktem chla. Zastąpić wężyk tygonowy uchwytem do filtra GF-5. Przenieść roztwór do kuwety kwarcowej.</li>
		<li>Po skalibrowaniu spektrometru absorbancji dla acetonu, umieścić kuwetę z próbką w spektrometrze i zmierzyć charakterystyki absorbancji w zakresie 400–750 nm. Następnie wyjąć kuwetę ze spektrometru i dodać do próbki 200 µL 2 M HCl. Ponownie przeprowadzić pomiar absorbancji w celu oznaczenia zawartości feofityny w próbce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar aktywności mikrobiologicznej za pomocą markerów znakowanych izotopowo oraz wpływ intensywności laserowej i czasu ekspozycji na tempo produkcji 
	OSTROŻNIE: Należy uważać na radioaktywność markerów (promieniowanie β). Używać fartucha laboratoryjnego, rękawic i gogli oraz pracować pod wyciągiem w licencjonowanym laboratorium izotopowym.
	<ol>
		<li>W celu oznaczenia produkcji bakteryjnej przenieść pięć alikwotów mat bakteryjnych do sterylnych worków polietylenowych. Inaktywować próbki kontrolne formaldehydem do końcowego stężenia 4%. 
		UWAGA: Trzy alikwoty są wykorzystywane do pomiaru poboru leucyny znakowanej 3H, a dwa alikwoty służą jako kontrole.</li>
		<li>Naświetlać maty laserem niebieskim (405 nm, 5 mW) oraz laserem zielonym (532 nm, 5 mW) przez 10 s i 30 s każdorazowo. Powtórzyć procedurę z laserami o mocy 50 mW. Następnie inaktywować próbki, które nie były traktowane formaldehydem. 
		UWAGA: Jedna mata jest poddawana tylko jednej ekspozycji laserowej. Jako kontrole należy wykorzystać maty mikrobiologiczne niepoddane naświetlaniu.</li>
		<li>Po zabiegu laserowym oszacować produkcję bakteryjną i pierwotną poprzez włączenie odpowiednio 3H-leucyny i NaH14CO3. Do pomiarów produkcji bakteryjnej użyć pięciu alikwotów na próbkę (20 mL) i dodać formalinę (końcowe stężenie 4%) do dwóch z powtórzeń, które służą jako kontrole abiotycznego włączenia markera. Dodać 3H-leucynę (40 nM) do wszystkich próbek w różnych wariantach i inkubować przez 4 h w warunkach in situ (0,1 °C). Przerwać reakcję poprzez dodanie formaliny do pozostałych żywych próbek.</li>
		<li>W przypadku produkcji bakteryjnej mat bakteryjnych, przenieść znakowane próbki do probówek kriogenicznych. Ekstrahować komórki kwasem trójchlorooctowym 5% i wirować przy 10 000 x g przez 5 min zgodnie z protokołami Kirchman26 i Bell27. Dodać ciecz scyntylacyjną i umieścić probówkę kriogeniczną w probówce poliscyntylacyjnej. Analizować próbki za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego i obliczyć tempo poboru. 
		UWAGA: Trzy alikwoty są wykorzystywane do pomiaru poboru leucyny znakowanej 3H, dwa alikwoty służą jako kontrole.</li>
		<li>W celu oznaczenia produkcji pierwotnej przygotować pięć powtórzeń dla różnych wariantów (100 mL), dwa z nich zawinąć w folię aluminiową w celu symulacji próbek ciemnych i do wszystkich dodać NaH14CO3 (1 µCi). Inkubować przez 4 h w świetle otoczenia i temperaturze in situ (0,1 °C). Przerwać reakcję poprzez zaciemnienie pozostałych trzech powtórzeń i przefiltrować próbkę na filtry GF/F (średnica 25 mm).</li>
		<li>Dodać do filtrów 100 µL 2 N HCl, aby usunąć nadmiar węgla, i pozostawić do odparowania pod wyciągiem. Wysuszyć próbki na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C i umieścić je w probówkach poliscyntylacyjnych.</li>
		<li>Aby zmierzyć liczbę rozpadów promieniotwórczych na minutę (dpm) dla wszystkich wariantów produkcji pierwotnej i bakteryjnej, umieścić probówki kriogeniczne w probówkach poliscyntylacyjnych i dodać 5 mL koktajlu scyntylacyjnego. Zmierzyć dpm za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego i obliczyć tempo poboru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Boyd, E. S., Skidmore, M., Mitchell, A. C., Bakermans, C., Peters, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenesis+in+subglacial+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Methanogenesis in subglacial sediments.</a> Environmental Microbiology Reports. 2, 685-692 (2010).</li>
<li>Sattler, B., Puxbaum, H., Psenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+growth+in+supercooled+cloud+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Bacterial growth in supercooled cloud droplets.</a> Geophysical Research Letters. 28, 239-242 (2001).</li>
<li>Good, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+developments+in+climate+change+science.+Part+I%3A+Understanding+of+future+change+in+the+large-scale+climate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Physical+Geography%22%5BJournal%5D)">A review of recent developments in climate change science. Part I: Understanding of future change in the large-scale climate system.</a> Progress in Physical Geography. 35, 281-296 (2011).</li>
<li>Fountain, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disappearing+Cryosphere%3A+Impacts+and+Ecosystem+Responses+to+Rapid+Cryosphere+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22BioScience%22%5BJournal%5D)">The Disappearing Cryosphere: Impacts and Ecosystem Responses to Rapid Cryosphere Loss.</a> BioScience. 62, 405-415 (2012).</li>
<li>Rignot, E., Mouginot, J., Morlighem, M., Seroussi, H., Scheuchl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread%2C+rapid+grounding+line+retreat+of+Pine+Island%2C+Thwaites%2C+Smith%2C+and+Kohler+glaciers%2C+West+Antarctica%2C+from+1992+to+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Widespread, rapid grounding line retreat of Pine Island, Thwaites, Smith, and Kohler glaciers, West Antarctica, from 1992 to 2011.</a> Geophysical Research Letters. 41, 3502-3509 (2014).</li>
<li>McMillan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ice+losses+from+Antarctica+detected+by+CryoSat-2%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Increased ice losses from Antarctica detected by CryoSat-2.</a> Geophysical Research Letters. 41, 3899-3905 (2014).</li>
<li>Barletta, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glacier+shrinkage+and+modeled+uplift+of+the+Alps%5BTitle%5D)+AND+%22Geophysical+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Glacier shrinkage and modeled uplift of the Alps.</a> Geophysical Research Letters. 33, 14307(2006).</li>
<li>Nuth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decadal+changes+from+a+multi-temporal+glacier+inventory+of+Svalbard%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cryosphere%22%5BJournal%5D)">Decadal changes from a multi-temporal glacier inventory of Svalbard.</a> The Cryosphere. 7, 1603-1621 (2013).</li>
<li>Takeuchi, N., Kohshima, S., Seko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+formation%2C+and+darkening+process+of+albedo-reducing+material+%28cryoconite%29+on+a+Himalayan+glacier%3A+A+granular+algal+mat+growing+on+the+glacier%5BTitle%5D)+AND+%22Arctic+Antarctic+and+Alpine+Research%22%5BJournal%5D)">Structure, formation, and darkening process of albedo-reducing material (cryoconite) on a Himalayan glacier: A granular algal mat growing on the glacier.</a> Arctic Antarctic and Alpine Research. 33, 115-122 (2001).</li>
<li>Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+characteristics+of+cryoconite+%28surface+dust%29+on+glaciers%3A+the+relationship+between+light+absorbency+and+the+property+of+organic+matter+contained+in+the+cryoconite%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">Optical characteristics of cryoconite (surface dust) on glaciers: the relationship between light absorbency and the property of organic matter contained in the cryoconite.</a> Annals of Glaciology. 34, 409-414 (2002).</li>
<li>Anesio, A. M., Hodson, A. J., Fritz, A., Psenner, R., Sattler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+microbial+activity+on+glaciers%3A+importance+to+the+global+carbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">High microbial activity on glaciers: importance to the global carbon cycle.</a> Global Change Biology. 15, 955-960 (2009).</li>
<li>Anesio, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+fluxes+through+bacterial+communities+on+glacier+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">Carbon fluxes through bacterial communities on glacier surfaces.</a> Annals of Glaciology. 51, 32-40 (2010).</li>
<li>Storrie-Lombardi, M. C., Sattler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-Induced+Fluorescence+Emission+%28L.I.F.E%29%3A+In+Situ+Nondestructive+Detection+of+Microbial+Life+in+the+Ice+Covers+of+Antarctic+Lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E): In Situ Nondestructive Detection of Microbial Life in the Ice Covers of Antarctic Lakes.</a> Astrobiology. 9, 659-672 (2009).</li>
<li>Murray, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+life+at+-13+%C2%B0C+in+the+brine+of+an+ice-sealed+Antarctic+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microbial life at -13 °C in the brine of an ice-sealed Antarctic lake.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20626-20631 (2012).</li>
<li>Edwards, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+fungal+community+inhabiting+cryoconite+holes+on+glaciers+in+Svalbard%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Ecology%22%5BJournal%5D)">A distinctive fungal community inhabiting cryoconite holes on glaciers in Svalbard.</a> Fungal Ecology. 6, 168-176 (2013).</li>
<li>Miteva, V. Bacteria in Snow and Glacier Ice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiteva%2C+V+%22Psychrophiles%3A+from+Biodiversity+to+Biotechnology%22">Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology</a>. Margesin, R., Schinner, F., Marx, J. C., Gerday, C. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin/Heidelberg, Germany. 31-50 (2008).</li>
<li>Yallop, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysiology+and+albedo-changing+potential+of+the+ice+algal+community+on+the+surface+of+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Photophysiology and albedo-changing potential of the ice algal community on the surface of the Greenland ice sheet.</a> The ISME Journal. 6, 2302-2313 (2012).</li>
<li>Edwards, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metagenomic+snapshot+of+taxonomic+and+functional+diversity+in+an+alpine+glacier+cryoconite+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">A metagenomic snapshot of taxonomic and functional diversity in an alpine glacier cryoconite ecosystem.</a> Environmental Research Letters. 8, 035003(2013).</li>
<li>Remias, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+UV-and+VIS-absorbing%2C+purpurogallin-derived+secondary+pigment+new+to+algae+and+highly+abundant+in+Mesotaenium+berggrenii+%28Zygnematophyceae%2C+Chlorophyta%29%2C+an+extremophyte+living+on+glaciers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Characterization of an UV-and VIS-absorbing, purpurogallin-derived secondary pigment new to algae and highly abundant in Mesotaenium berggrenii (Zygnematophyceae, Chlorophyta), an extremophyte living on glaciers.</a> FEMS Microbiology Ecology. 79, 638-648 (2012).</li>
<li>Cook, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+estimate+of+microbially+mediated+carbon+fluxes+from+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">An improved estimate of microbially mediated carbon fluxes from the Greenland ice sheet.</a> Journal of Glaciology. 58, 1098-1108 (2012).</li>
<li>Mueller, D. R., Vincent, W. F., Pollard, W. H., Fritsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glacial+cryoconite+ecosystems%3A+a+bipolar+comparison+of+algal+communities+and+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Nova+Hedwigia+Beiheft%22%5BJournal%5D)">Glacial cryoconite ecosystems: a bipolar comparison of algal communities and habitats.</a> Nova Hedwigia Beiheft. 123, 173-198 (2001).</li>
<li>Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. C., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Huner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Acclimation+of+Photosynthetic+Microorganisms+to+Permanently+Cold+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Acclimation of Photosynthetic Microorganisms to Permanently Cold Environments.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70, 222-252 (2006).</li>
<li>Hodson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryoconite+ecosystem+on+the+Greenland+ice+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Glaciology%22%5BJournal%5D)">The cryoconite ecosystem on the Greenland ice sheet.</a> Annals of Glaciology. 51, 123-129 (2010).</li>
<li>Tilg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.I.F.E.%3A+laser+induced+fluorescence+emission%2C+a+non-invasive+tool+to+detect+photosynthetic+pigments+in+glacial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+SPIE.+8152%2C+Instruments%2C+Methods%2C+and+Missions+for+Astrobiology+XIV%2C+81520I%22%5BJournal%5D)">L.I.F.E.: laser induced fluorescence emission, a non-invasive tool to detect photosynthetic pigments in glacial ecosystems.</a> Proceedings SPIE. 8152, Instruments, Methods, and Missions for Astrobiology XIV, 81520I. , (2011).</li>
<li>Lorenzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+chlorophyll+and+pheo-pigments%3A+spectrophotometric+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+%26+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Determination of chlorophyll and pheo-pigments: spectrophotometric equations.</a> Limnology & Oceanography. 12, 343-346 (1967).</li>
<li>Kirchman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bacterial+biomass+production+and+growth+rates+from+leucine+incorporation+in+natural+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring bacterial biomass production and growth rates from leucine incorporation in natural aquatic environments.</a> Methods in Microbiology. , 227-238 (2001).</li>
<li>Bell, R. T. Estimating production of heterotrophic bacterioplankton via incorporation of tritiated thymidine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+RT+%22Handbook+of+methods+in+aquatic+microbial+ecology.+Edited+by%22">Handbook of methods in aquatic microbial ecology. Edited by</a>. Kemp, P. F., Cole, J. J., Sherr, B. F., Sherr, E. B. , CRC press. Boca Raton, FL. 495-503 (1993).</li>
<li>Groemer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+trial+of+a+dual-wavelength+fluorescent+emission+%28L.I.F.E.%29+instrument+and+the+Magma+White+rover+during+the+MARS2013+Mars+analog+mission%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Field trial of a dual-wavelength fluorescent emission (L.I.F.E.) instrument and the Magma White rover during the MARS2013 Mars analog mission.</a> Astrobiology. 14, 391-405 (2014).</li>
<li>Beutler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Spectral+fluorescence+of+chlorophyll+and+phycobilins+as+an+in+situ+tool+of+phytoplankton+analysis-models%2C+algorithms+and+instruments%22">Spectral fluorescence of chlorophyll and phycobilins as an in situ tool of phytoplankton analysis-models, algorithms and instruments</a>. , Christian-Albrechts Universität Kiel. Doctoral dissertation (2003).</li>
<li>Krogmann, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoveries+in+Oxygenic+Photosynthesis+%281727-2003%29%3A+A+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Discoveries in Oxygenic Photosynthesis (1727-2003): A Perspective.</a> Photosynthesis Research. 80, 15-57 (2004).</li>
<li>Corrêa, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+saturable+absorption+in+chlorophyll+A+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics+B%22%5BJournal%5D)">Reverse saturable absorption in chlorophyll A solutions.</a> Journal of Applied Physics B. 74, 559-561 (2002).</li>
<li>Kaňa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slow+S+to+M+fluorescence+rise+in+cyanobacteria+is+due+to+a+state+2+to+state+1+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The slow S to M fluorescence rise in cyanobacteria is due to a state 2 to state 1 transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1817, 1237-1247 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kalibracja 
Po normalizacji liczby fotonów do czasu ekspozycji 1 s stwierdzono liniową korelację między stężeniem pigmentu a intensywnością fluorescencji. Próbki o niskiej wysokości kolumny i niskim stężeniu pigmentów prowadziły do przeszacowania zawartości docelowych pigmentów w porównaniu do większych wysokości kolumn przy tym samym stężeniu pigmentu. Ponadto słabe sygnały fluorescencji wymagały długich czasów ekspozycji, aby uzyskać wystarczającą liczbę fotonów na detektorze. Jednak długie czasy integracji zwiększały również ilość światła rozproszonego na detektorze, co skutkowało spadkiem stosunku sygnału do szumu. W obecnej wersji oprogramowanie nie potrafi odróżnić szumu od sygnału podczas procesu redukcji danych. W związku z tym pomiary o niskiej intensywności fluorescencji prowadziły do przeszacowania zawartości pigmentu, ponieważ szum był liczony jako sygnał pochodzący od docelowych pigmentów. Co więcej, intensywności fluorescencji w bardziej stężonych roztworach pigmentów wykazywały większą zmienność niż w roztworach o niskim stężeniu. Efekt ten można wyjaśnić procesami absorpcji w roztworach pigmentów wykorzystanych do sporządzenia krzywej kalibracyjnej.
Walidacja danych dla oznaczania ilości chlorofilu a 
Po przefiltrowaniu próbek lodu i śniegu, trójwymiarowe próbki wyglądały na filtr niemal jak preparaty dwuwymiarowe. Uzasadniało to bezpośrednie porównanie danych z L.I.F.E (gęstość powierzchniowa) oraz danych spektrofotometrycznych (pomiar objętościowy).
Zbiór danych (Rysunek 8) wskazał, że wysokie stężenie pigmentu prowadzi do niedoszacowania, podczas gdy niskie stężenie pigmentu prowadzi do przeszacowania wartości rzeczywistej. Efekt ten można wyjaśnić grubością placka filtracyjnego, a tym samym objętościowym charakterem próbki. Głębokość penetracji lasera zależała od gęstości optycznej i grubości preparatu. Wysokie zawartości pigmentu były niedoszacowane, ponieważ laser nie mógł wywołać fluorescencji pigmentu w głębszych warstwach. Jednak w cienkich plackach filtracyjnych rejestrowano niskie sygnały fluorescencji ze względu na niską gęstość powierzchniową pigmentów. Wyraźnie widać, że sam filtr wykazywał sygnały indukowane laserem po przejściu przez filtr długoprzepustowy 450 nm (Rysunek 12). Sygnał ten był błędnie liczony jako sygnał fluorescencji pochodzący od chla. Zatem cienkie i zbyt grube placki filtracyjne są trudne do pomiaru za pomocą instrumentu L.I.F.E.
<img alt="Schemat wzbudzenia laserowego i emisji fluorescencji z układem odbicia filtra; badanie optyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig12.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 12"> 
Rycina 12: Sygnały fluorescencji z grubego (A) i cienkiego (B) placka filtracyjnego na filtrze GF/F. (A) Samozasłanianie zapobiega fluorescencji indukowanej laserem z głębszych warstw, co prowadzi do niedoszacowania rzeczywistego stężenia pigmentu. (B) Emisja fluorescencji z placka filtracyjnego z nałożonymi odbiciami filtra. (C) Surowe dane wykazują odbicie filtra (kolor szary). Właściwość widmowa wzorca fluorescencji chla otrzymanego w laboratorium jest przedstawiona na czerwono. Pasek skali = 45 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig12large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ograniczenia prototypu L.I.F.E. 
Podczas redukcji danych oprogramowanie zakodowane w MATLAB interpretowało surowe obrazy poprzez sumowanie linii pikseli w określonym zakresie długości fali. Obecna wersja oprogramowania nie odróżnia sygnałów pochodzenia organicznego od nieorganicznych. Obecność wielu sygnałów może prowadzić do przeszacowania rzeczywistej zawartości pigmentów. Długie czasy ekspozycji wynikające z niskiej intensywności fluorescencji prowadziły do obniżenia stosunku sygnału do szumu, co potęgowało opisany powyżej efekt (patrz Rysunek 8 i Rysunek 12).
Geoda przedstawiona na Ryc. 13 wykazuje czerwoną fluorescencję po naświetleniu światłem zielonym i niebieskim. Obecnie nie jest jasne, czy fluorescencja ta wynika z obecności minerałów, czy z cząsteczek opartych na porfirynach. W związku z tym nałożenie się sygnałów biologicznych i niebiologicznych może ograniczać zastosowanie tej metody i wymagać stworzenia bazy danych fluorescencji opracowanej specjalnie dla prototypu L.I.F.E.
<img alt="Eksperyment emisji fluorescencji, obrazy mikroskopowe próbek A, B, C wykazujące różną jasność." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig13.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 13"> 
Rycina 13: Fluorescencja minerałów z geody skalnej znalezionej w Ny-Ålesund. Skała została wzbudzona laserem 532 nm 50 mW (A) oraz laserem 405 nm 50 mW (B). Oba zdjęcia wykonano z zastosowaniem filtra polaryzacyjnego na obiektywie, co doprowadziło do zafałszowania rzeczywistych kolorów fluorescencji. (C) Obraz w prawdziwych kolorach wykonany bez użycia filtra polaryzacyjnego w warunkach światła dziennego. Pasek skali = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig13large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Beutler i inni29 wyciągnęli wniosek, że charakterystyczne widma emisji cyjanobakterii w ekosystemach morskich zależą od warunków środowiskowych. Ponadto stan metaboliczny wpływa na właściwości fluorescencji u organizmów fototroficznych30. Instrument L.I.F.E może rozróżniać wzorce fluorescencji alg i cyjanobakterii, wykorzystując biblioteki bio-odcisków zawierające informacje spektralne próbki skorelowane z warunkami środowiskowymi.
W cząsteczkach chla zaadaptowanych do ciemności wszystkie centra reakcyjne są w pełni utlenione i dostępne dla fotochemii, a wydajność fluorescencji nie jest tłumiona31. W procedurze L.I.F.E. próbka jest najpierw wzbudzana laserem 532 nm (zielonym), a następnie laserem 405 nm (niebieskim). Podczas drugiego wzbudzenia laserem niebieskim chla może wykazywać zmniejszoną odpowiedź fluorescencyjną z powodu wcześniejszego wzbudzenia laserem zielonym. Chla pochłania energię przy długości fali 532 nm, pomimo oddalenia od maksimum swojej długości fali absorpcji32. Przed właściwym pomiarem chla przy 405 nm laser zielony może wywołać reakcje fotochemiczne, aktywując mechanizmy tłumienia w pigmentach docelowych. Ponadto wstępne naświetlanie morskich organizmów fototroficznych nie doprowadziło do zmiany krzywych normy widmowej w zakresie 450 nm–600 nm, podczas gdy odchylenie standardowe intensywności fluorescencji wzrosło o 25%29. W zależności od gatunku intensywności fluorescencji wzrosły nawet w odpowiedzi na wcześniejsze wzbudzenie. Zagadnienie to wymaga dalszych badań.
Zastosowanie 
Przyrząd L.I.F.E. przetestowano w różnych siedliskach, ze szczególnym uwzględnieniem otworów krio konitowych. Laser został z powodzeniem zastosowany w siedliskach glebowych i biofilmach ze względu na brak światła otoczenia podczas pomiaru. Granule krio konitowe można było zmierzyć, gdy warstwy osadów blokowały światło z dołu otworu (Rysunek 14A,C). Cienkie osadowe otwory krio konitowe były przepuszczalne dla rozproszonego światła z dołu (Rysunek 14B). Światło rozproszone zakłóca pomiar. W związku z tym stężenie pigmentów na powierzchniach czystego lodu nie jest jeszcze mierzalne w warunkach światła dziennego. Obecnie trwają prace nad przetwarzaniem sygnałów, aby umożliwić działanie systemu w warunkach silnego światła otoczenia.
<img alt="Topnienie krio Konitu na powierzchni lodu; schemat ilustrujący wpływ promieniowania słonecznego na lód i cząstki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig14.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 14"> 
Rycina 14: Otwór kriokonitowy z wodą w stanie ciekłym na powierzchni. (A) Kriokonit na lodowcu z tubą soczewkową L.I.F.E. Pasek skali = 70 mm. (B) Warstwa osadu (czerwona) jest bardzo cienka. Światło rozproszone przenika przez warstwę kriokonitu. (C) Warstwa osadu jest wystarczająco gruba, aby zablokować światło rozproszone z dołu. Ten typ otworu kriokonitowego jest mierzalny za pomocą instrumentu L.I.F.E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig14large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Podsumowując, nasz instrument L.I.F.E. wykrył organizmy fotoautotroficzne w siedliskach lądowych, takich jak gleby, maty bakteryjne, biofilmy oraz w dziurach krio konitowych na powierzchniach lodowców. Cząsteczkami docelowymi były chla oraz B-PE. Rozdzielczość przestrzenna wynosiła 30 µm/px. Granica wykrywalności dla chla wynosiła 250 pg/mL, a dla B-PE 2 ng/mL. Po kalibracji laboratoryjnej byliśmy w stanie określić ilość pigmentów w próbkach pobranych z miejsca naszych badań w Arktyce. Do zautomatyzowanego procesu redukcji danych zastosowaliśmy autorskie oprogramowanie. Wpływ obecności minerałów oraz zmieniających się warunków oświetleniowych podczas pomiarów wymaga dalszych badań.
Wraz z ociepleniem klimatu wzrost temperatur prowadzi do zwiększonej dostępności wody w stanie ciekłym, co skutkuje wyższą aktywnością biologiczną na lodowych powierzchniach o charakterze autotroficznym i heterotroficznym. Należy podjąć intensywne wysiłki w celu wykrycia organizmów heterotroficznych in situ, aby uzyskać pełny obraz aktywnego życia w kriosferze. Można by to przetestować przy użyciu innych pigmentów docelowych i odpowiednich długości fal wzbudzenia laserowego. Zatem L.I.F.E. stanowi odpowiedni system monitoringu, zapewniający wysoką rozdzielczość czasową i przestrzenną dla warunków supraglacjalnych w kontekście globalnych zmian, a także potencjalnych zastosowań astrobiologicznych.

Kriosfera obejmuje lód morski, lodowce, wysokogórskie jeziora, obszary pokryte śniegiem, lód jeziorny, strumienie wód roztopowych oraz wieloletnią zmarzlinę. Obszary te pokrywają około 11% lądów Ziemi1,2 i są otoczone atmosferą, tworząc rozpoznawalne środowisko kriosferyczne. Niedawne badania wskazują, że rozległe obszary kriosfery szybko się cofają3,4. Antarktyka5,6, Alpy7, Arktyka8 oraz inne regiony wykazują ujemny bilans masy lodu. Cofanie się czapek lodowych i lodowców prowadzi do wyczerpywania największego rezerwuaru słodkiej wody na Ziemi. W niektórych obszarach regresja lodowców jest nieodwracalna5.
Przez długi czas ekosystemy lodowe były uważane za środowiska sterylne. Jednak pomimo surowych warunków, obecność aktywnego życia w kriosferze ziemskiej jest oczywista9,10,11,12,13,14,15. Ze względu na trend masowych strat lodu w wyniku topnienia, kriosfera przechodzi zmiany w aktywności biologicznej, co wpływa na siedliska sąsiadujące. Aby zrozumieć te częściowo nieodwracalne zmiany, potrzebujemy metod badania aktywności biologicznej w lodzie w warunkach in situ z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
W środowiskach supraglacjalnych życie można znaleźć w dziurach krio konitowych, pokrywach śnieżnych, wodach roztopowych, strumieniach oraz na odsłoniętych powierzchniach lodu. Jednak najbardziej oczywistymi siedliskami supraglacjalnymi są dziury krio konitowe. Występują one globalnie w środowiskach zlodowaciałych i zostały po raz pierwszy opisane przez szwedzkiego odkrywcę Adolfa Erika Nordenskjolda podczas wyprawy na Grenlandię w latach 70. XIX wieku16,17. Nazwa pochodzi z greckich słów „kryos” (zimno) i „konia” (pył). Ciemne szczątki organiczne i nieorganiczne pochodzenia eolicznego osadzają się na powierzchni lodu i lokalnie obniżają albedo. Promieniowanie słoneczne sprzyja wtopieniu się tych szczątków w głębsze warstwy lodu, tworząc cylindryczne niecki z osadem (krio konitem) na dnie9. Dziury krio konitowe zajmują od 0,1 do 10% stref ablacji lodowcowej11.
Społeczności krio konitów składają się z wirusów, grzybów, bakterii, sinic, mikroalg i pierwotniaków. W zależności od regionu można w nich również znaleźć organizmy z grupy Metazoa, takie jak rotifery, nicienie, widłonogi, niesiory i larwy owadów. Edwards i inni18 opisują otwory krio konitowe jako „lodowate punkty zapalne” (ice-cold hotspots). Wykazali oni również obecność w otworach krio konitowych genów funkcjonalnych odpowiedzialnych za cykle N, Fe, S i P. Te ekosystemy miniaturowych jezior oddychają i prowadzą fotosyntezę z szybkością charakterystyczną dla znacznie cieplejszych i bogatszych w składniki odżywcze siedlisk11. Wyniki te podkreślają istotną rolę sekwestracji mikrobiologicznej w środowiskach supraglacjalnych. Oprócz żyjących społeczności w otworach krio konitowych, gołe powierzchnie lodu są zasiedlone przez algi lodowe. Ich fizjologia jest dobrze przebadana19, jednak ich rozkład przestrzenny nie został jeszcze oceniony20. Ich obecność w środowiskach supraglacjalnych zmniejsza albedo, a tym samym przyspiesza topnienie, co prowadzi do wymywania substancji odżywczych i ich dopływu do siedlisk położonych niżej9. Wzrost temperatury, a w konsekwencji większa dostępność wody w stanie ciekłym, wpływa na netto produktywność ekosystemu w tych lodowych środowiskach.
W środowiskach supraglacjalnych organizmy aktywności fotosyntetycznej przekształcają nieorganiczny węgiel i azot w organiczne źródła dostępne dla mikrobiologicznej sieci troficznej21,22. Do tej pory przeprowadzono niewiele badań szacujących strumienie węgla supraglacjalnego11,20,23. Rozbieżności w proponowanych wartościach strumieni węgla wynikają z niskiej rozdzielczości danych przestrzennych i czasowych. Ponadto dystrybucja przestrzenna społeczności supraglacjalnych poza otworami kriokonitowymi jest słabo oceniona. Cook i inni20 przewidzieli w swoich modelach, że ze względu na ogromną powierzchnię pokrycia, glony supraglacjalne wiążą do 11 razy więcej węgla niż współczesne otwory kriokonitowe. Wykrywanie społeczności glonów supraglacjalnych przy jednoczesnym zapewnieniu integralności próbek jest nadal utrudnione z powodu braku narzędzi do detekcji i kwantyfikacji in situ.
Ze względu na trudności logistyczne ekosystemy lodowe są badane rzadziej niż siedliska w obszarach umiarkowanych. Rozdzielczość danych zależy od liczby ocenionych próbek oraz od dostępności miejsc badań. Standardowe metody pobierania próbek, takie jak piłowanie, wiercenie rdzeni i późniejsze topnienie, wiążą się z manipulacją społecznością mikrobów. Na przykład ocena poziomu chlorofilua (chla) w stałych próbkach lodu jest niemożliwa przy użyciu standardowych metod bez znacznych zakłóceń. W związku z tym nieuniknione są zmiany temperatury wywołane topnieniem w badanych społecznościach mikrobów. Ze względu na termolabilność fotosystemu II oraz innych struktur komórkowych u psychrofili22, analizy laboratoryjne stopionych próbek lodu zawsze prowadzą do zafałszowania warunków in situ.
Nieniszczące pomiary in situ są jedynym racjonalnym sposobem na uzyskanie wiarygodnych danych. Cel ten można osiągnąć, stosując metody oparte na fluorescencji. Ze względu na ich funkcję zbierania światła, chla oraz B-fikocyjanina (B-PE) występują w organizmach przyczyniających się do cyklu węglowego w środowiskach supraglacjalnych, co udowodnili Anesio i inni11. Zatem cząsteczki fluorescencyjne te stanowią odpowiednie biomarkery do ilościowego określania przepływów węgla pośredniczonych przez mikroorganizmy w ekosystemach lodowych.
W niniejszym badaniu przedstawiamy opracowanie, kalibrację i zastosowanie nowatorskiego, nieinwazyjnego narzędzia do ilościowego oznaczania in situ cząsteczek chla oraz B-PE w ekosystemach lądowych i lodowych. Prototyp urządzenia opiera się na laserowo indukowanej emisji fluorescencyjnej, znanej również jako L.I.F.E. Instrument optyczny (Rycina 1) rejestruje sygnatury fluorescencyjnych biomarkerów po laserowym wzbudzeniu fluorescencji. Procedura ta jest nieniszcząca i może być przeprowadzana bezpośrednio w miejscu badań lub w laboratorium.
<img alt="Układ wzbudzenia optycznego; schemat; system spektroskopii laserowej; badanie fotoniczne, lasery 532nm, 405nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Prototyp L.I.F.E. Lewo: Zdjęcie urządzenia bez pokrywy ochronnej. Prawo: Schematyczny rysunek urządzenia. Masa całkowita = 5.4 kg (laser i optyka = 4.025 kg, laptop = 1.37 kg). Aluminiowa rama = 32.5 cm x 20.3 cm x 6.5 cm. Rura optyczna: 18.4 cm x 4 cm (średnica). CCD: sensor bluefox mv220g; F: filtry długoprzepustowe sterowane serwomechanizmem (450 nm i 550 nm); L: soczewki optyczne; M1: lustra; M2: lustro dichroiczne; MC: mikrokontroler; P: pryzmat; PBS: polaryzacyjny dzielnik wiązki; S: szczelina wykonana z regulowanych żylet. Pasek skali = 70 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Przenośny zestaw dwudługościowy waży 4,5 kg i jest używany na statywie w połączeniu z zewnętrznym komputerem. Konfiguracja w terenie jest szybka i łatwa. Instrument jest mocowany do statywu, a do urządzenia przytwierdzona zostaje tuba obiektywu wraz z kablem USB i kablem kamery. Zewnętrzny komputer jest podłączony do instrumentu za pomocą kabla USB. Nogi statywu są regulowane w taki sposób, aby tuba obiektywu była skierowana w stronę próbki i ją obejmowała. Następnie zielony laser o mocy 5 mW pada na próbkę po przejściu przez polaryzacyjny rozdzielacz wiązki, który kieruje światło spolaryzowane w stronę osi optycznej spektrometru. Próbka emituje światło fluorescencyjne, przedstawione na czerwono na Rysunku 1. Połowa skolimowanego światła przechodzi przez polaryzacyjny rozdzielacz wiązki i jest ogniskowana przez sterowany serwomechanizmem filtr długoprzepustowy, który usuwa sygnały laserowe. Następnie sygnał pada na szczelinę przysłony składającą się z dwóch regulowanych żyletek. Pryzmat rozdziela spektralnie cienką linię światła prostopadle do szczeliny przysłony, zanim sygnał zostanie zarejestrowany przez detektor. Procedura jest powtarzana z użyciem niebieskiego lasera. Surowe dane są automatycznie przesyłane do przenośnego komputera, który służy również do obsługi oprogramowania.
Instrument jest sterowany przez zewnętrzny komputer z wykorzystaniem środowiska LabVIEW, które synchronizuje wykonywanie zdjęć przez kamerę CCD, włączanie i wyłączanie laserów oraz obracanie koła filtrów długoprzepustowych. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) jest podzielony na trzy główne sekcje. Regulacja czasu ekspozycji odbywa się ręcznie. Chociaż korelacja między czasem ekspozycji a intensywnością sygnału jest liniowa (Rysunek 2B), maksymalny czas ekspozycji jest ograniczony do 10 s, ponieważ dłuższe czasy całkowania prowadzą do znacznego spadku stosunku sygnału do szumu. Pole komentarzy służy do opisu próbki (Rysunek 2A). W prawej sekcji obrazy surowe są wyświetlane natychmiast po zakończeniu pomiarów. Funkcja ta jest kluczowa dla bieżącej oceny danych w terenie (Rysunek 2C–E). Czerwone obszary wskazują prześwietlone piksele, czego można uniknąć poprzez skrócenie czasu ekspozycji.
Kolejny proces redukcji surowych danych jest oddzielony od procedury akwizycji obrazu i może zostać przeprowadzony w dowolnym momencie po jej zakończeniu.
<img alt="Interfejs konfiguracji spektroskopowej; pomiar wzbudzenia optycznego; ustawienia filtrów; analiza widmowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Graficzny interfejs użytkownika L.I.F.E. służący do akwizycji danych i ewaluacji danych surowych. (A) Oprogramowanie umożliwia ręczne wprowadzanie tekstu w opisach próbek. (B) Czas ekspozycji można dostosować przed wykonaniem pomiaru. (C−E) Obrazy surowe są wyświetlane po prawej stronie interfejsu. (E) Kolor czerwony wskazuje na nasycenie sensora. (F) Aktywacja przycisku RUN MEASUREMENT uruchamia proces akwizycji danych. W tablicy (G) wyświetlane są wszystkie polecenia wykonywane automatycznie podczas akwizycji danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat spektroskopii przejściowej absorpcji pokazujący separację przestrzenną i widmową na detektorze CCD." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykład surowego obrazu. Lewo: Surowe dane wzorca chla w roztworze acetonu, zarejestrowane za pomocą instrumentu L.I.F.E. Ze względu na właściwości optyczne urządzenia sygnał jest wyświetlany jako zakrzywiona linia. Prawo: Interpretacja surowego obrazu na piksel (px). Oś widmowa (rozdzielczość 5 nm/px) jest naniesiona względem osi przestrzennej (rozdzielczość 30 µm/px). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Surowe obrazy w 12-bitowej skali szarości wykazują komponent przestrzenny wynikający z jednowymiarowej szczeliny apertury oraz komponent spektralny wynikający z obecności pryzmatu przed detektorem CCD (Rycina 3). Ze względu na ograniczenia optyczne obrazy surowe są zniekształcone. W związku z tym muszą zostać przycięte i poddane korekcji geometrycznej (dewarpingowi) poprzez zastosowanie kodu rozpoznającego stopień zniekształcenia. Operację tę wykonuje się za pomocą kreatora oprogramowania (Rycina 4). Następnie przeprowadzana jest kalibracja długości fali za pomocą lasera 532 nm. Zielone światło jest generowane poprzez podwojenie częstotliwości podczerwonego lasera 1,064 nm. Obie długości fal mogą być wykrywane przez CCD, dzięki czemu pozycja spektralna każdego piksela w obrazach po korekcji geometrycznej może być obliczona automatycznie (Rycina 4).
Następnie obraz jest przycinany do określonego zakresu długości fal (550–1,000 nm dla pomiarów laserem zielonym oraz 400–1,000 nm dla pomiarów laserem niebieskim). Wartości szarości z każdego piksela w wybranej linii pikseli są zliczane i sumowane. Wartość szarości może mieścić się w zakresie 0–255. W efekcie każda linia pikseli odpowiada jednej liczbie. Dalsze instrukcje wyświetlane przez oprogramowanie prowadzą do wygenerowania wykresu, na którym liczby wartości szarości z każdej linii pikseli są naniesione względem współrzędnych przestrzennych. Pozwala to na jednoczesne ilościowe rozróżnienie przestrzenne chla oraz B-PE w próbce. Dodatkowo z wybranych linii pikseli można automatycznie wykreślić właściwości widmowe próbki.
<img alt="Analiza emisji optycznej; konfiguracja spektroskopowa; schemat z wynikami dopasowania widmowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Korekcja zniekształceń (dewarping) obrazów surowych. Lewo: Obraz surowy zarejestrowany za pomocą zielonego lasera. Nie zastosowano filtrów. Sygnały są wyświetlone dla 532 nm i 1 064 nm. Czas ekspozycji = 0,015 s. Środek: Przycięty sygnał 532 nm służy jako linia odniesienia do korekcji zniekształceń zestawu obrazów. Prawo: Obraz po korekcji zniekształceń pochodzący z surowego źródła obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>aceton</td><td>Merck</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>B-Fikoerytryna</td><td>Invirtrogen</td><td>P6305</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofil standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6144-1MG</td><td></td></tr><tr><td>formalina</td><td>Filtry Merck</td><td>HT501128</td><td>36%</td></tr><tr><td>GF/C</td><td>Whatman</td><td>WHA1822025</td><td>Średnica 25mm</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td>36,5-38% </td></tr><tr><td>L.I.F.E.</td><td>Prototyp Uniwersytetu w Innsbrucku</td><td></td><td>zbudowany na żądanie</td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Software, Laboratorium Virtual Instrumentation Engineering Workbench</td></tr><tr><td>Leucyna, L-[4,5-3H], 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET1166001MC</td><td>radioaktywny</td></tr><tr><td>Płynny koktajl scyntylacyjny Beckman Ready Use</td><td>Beckman</td><td>nie jest bardziej dostępny, można go skompensować przez Ultra Gold, licznik scyntylacyjny cieczy Packard</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>brak w magazynie</td><td>LSC 6000 IC</td></tr><tr><td>NaH14CO3 (4 &mikro; Ci/ml)</td><td>DHI Dania</td><td>4 &mu; Ci/ml, 1 ml</td><td>radioaktywne</td></tr><tr><td>filtry poliwęglanowe Osmonics</td><td>DHI Dania</td><td>PCTE</td><td>o średnicy 25mm, 0,2&micro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Fiolki poliscyntylacyjne</td><td>Perkin Elmer</td><td>WHA1825047</td><td>20 ml</td></tr><tr><td>probówki na próbki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2318-500EA</td><td>Probówki wirówkowe Greiner, 50 ml</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td>Model U2001, dowolny fotometr do spektroskopii absorpcyjnej mierzący przy 664 nm i 750 nm byłby odpowiedni</td></tr><tr><td>kwas trójchlorowy octowy (TCA)</td> <td>Merck</td><td>T6399</td><td>100%</td></tr> <tr><td>sonda ultradźwiękowa</td><td>nano lab</td><td>QS1T-2</td><td></td></tr></tbody></table>

emisja fluorescencji indukowanej laserem (l.i.f.e.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery

Laser-Induced Fluorescence Emission (L.I.F.E.) as Novel Non-Invasive Tool for In-Situ Measurements of Biomarkers in Cryospheric Habitats

Globalne ocieplenie wpływa na społeczności mikrobiologiczne w różnych ekosystemach, zwłaszcza w siedliskach kriosferycznych. Jednak niewiele wiadomo na temat strumieni węgla za pośrednictwem mikroorganizmów w ekstremalnych warunkach. W związku z tym metodologia pobierania próbek opisana w bardzo niewielu dostępnych badaniach implikuje dwa główne problemy: A) dane o wysokiej rozdzielczości wymagają dużej liczby próbek, co jest trudne do uzyskania w odległych obszarach; B) nieuniknione manipulacje próbkami, takie jak cięcie, piłowanie i topienie rdzeni lodowych, które prowadzą do niezrozumienia warunków in situ. W niniejszej pracy przedstawiono prototypowe urządzenie, które nie wymaga ani przygotowania próbki, ani jej zniszczenia. Urządzenie może być wykorzystywane do pomiarów in situ o wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej w ekosystemach lądowych i lodowych i opiera się na technice misji L.I.F.E. (Laser-I nduced Fluorescence E). Fotoautotroficzne zbiorowiska nadraglacjalne można zidentyfikować poprzez wykrycie sygnatur L.I.F.E. w fotopigmentach. Wykazano kalibrację przyrządu L.I.F.E. dla pochodnych porfiryny:chlorofilu a (chl a) (wzbudzenielaserowe 405 nm) i B-fikoerytryny (B-PE) (wzbudzenie laserowe 532 nm). W celu walidacji tej metodologii, dane L.I.F.E. zostały ratyfikowane za pomocą konwencjonalnej metody oznaczaniailościowego chl a, która obejmowała ekstrakcję pigmentu, a następnie spektroskopię absorpcyjną. Przydatność prototypu w terenie została sprawdzona w ekstremalnych środowiskach polarnych. Dalsze badania na siedliskach ziemskich odbywały się podczas symulacji analogowych Marsa na marokańskim pustyni oraz na austriackim lodowcu skalnym. Instrument L.I.F.E. umożliwia skanowanie dużych obszarów o wysokiej rozdzielczości przy akceptowalnej logistyce operacyjnej i przyczynia się do lepszego zrozumienia potencjału ekologicznego zbiorowisk supraglacjalnych w kontekście globalnych zmian.

Kalibracja laboratoryjna dla B-PE 
Sygnały odpowiedzi dla serii rozcieńczeń B-PE zmierzono za pomocą instrumentu L.I.F.E. w ciemni w temperaturze 20 °C (Rycina 6). Szybkość zliczania zależała zarówno od stężenia, jak i od wysokości słupa mierzonej próbki. Próbki B-PE o niskim stężeniu i niskiej wysokości słupa wykazywały silniejszą fluorescencję w porównaniu do próbek o tym samym stężeniu i większej wysokości słupa.
<img alt="Wykres stężenia w funkcji liczby zliczeń; dane z kolumny chromatograficznej, znormalizowana ekspozycja, pokazane czynniki skalujące." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Kalibracja laboratoryjna B-PE. Przedstawiono kalibrację zawartości B-PE i gęstości kolumny. Znormalizowane szybkości zliczeń obliczono dla wysokości kolumny 1,5 cm. Przedruk za zgodą28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Do dopasowania końcowej linii kalibracyjnej wykorzystano regresję Poissona. Stwierdzono liniową korelację pomiędzy gęstością powierzchniową a wartościami odcieni szarości pikseli. Funkcja krzywej wynosiła y = 81,04x (Rysunek 7), co oznacza, że wartość odcienia szarości wynosząca 8 104 w próbce naświetlanej przez 1 s odpowiadała gęstości powierzchniowej 100 ng/cm2 B-PE. Kalibracja chla została przeprowadzona w analogiczny sposób. Funkcja wynosiła y = 8,94x.
<img alt="Wykres kalibracyjny pokazujący dopasowanie danych, gęstość powierzchni względem zliczeń, dla walidacji analizy spektroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Końcowa krzywa kalibracyjna dla B-PE. Zliczenia wartości szarości zostały znormalizowane do czasu ekspozycji 1 s i naniesione na wykres w funkcji gęstości powierzchni. Przedruk za zgodą28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zastosowanie w próbkach krio konitu ze Svalbardu oraz laboratoryjna walidacja danych 
Średnie wartości pomiarów L.I.F.E. oraz pojedyncze pomiary tych samych próbek uzyskane poprzez konwencjonalną ekstrakcję za pomocą acetonu i następującą po niej analizę spektrofotometryczną przedstawiono na Rysunku 8.
<img alt="Analiza chlorofilu; wykres słupkowy; fotometria vs. metoda optyczna; porównanie danych próbek; wynik eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Walidacja danych z wykorzystaniem próbek naturalnych. Próbki (MLB) zostały uszeregowane według zawartości chla na podstawie wyników z laboratoryjnego spektrofotometru (wartości pojedyncze) i porównane z danymi fluorescencji chla zmierzonymi w czterech losowych obszarach na filtr. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe pomiarów L.I.F.E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zawartość chla w zakresie od 48 µg/L do 67 µg/L została niedoszacowana, natomiast niższa zawartość chla w zakresie od 0,7 µg/L do 7 µg/L została przeszacowana przez prototyp L.I.F.E. Odchylenia standardowe pomiarów L.I.F.E. były niskie.
Porównanie danych widmowych z pomiarów in situ ze standardami laboratoryjnymi 
Widma Chla były porównywalne pomiędzy próbkami krikonitu a tymi oczyszczonymi z alg A. nidulans. Piki fluorescencji we wszystkich próbkach znajdowały się w zakresie 700 nm–710 nm. Jednakże widma pochodzące z próbek krikonitu wykazywały wyższe sygnały szumów w zakresach 400 nm–650 nm oraz 800 nm–1,000 nm w porównaniu z widmami standardu pigmentu chla (Rysunek 9).
<img alt="Wykres widma fluorescencji, wzbudzenie 405 nm, intensywność względna w funkcji długości fali, szczyt przy 700 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Interpretacja danych spektralnych. Pomiary czterech granulek krioKonitu (kolor niebieski) i standardowego roztworu pigmentu chla (kolor czerwony) po wzbudzeniu laserami 405 nm. Widma zarejestrowano 1 rok po pobraniu próbek. Próbki były przechowywane w zamrożeniu i nie były wystawione na działanie światła przed pomiarem. W wyniku problemów z kalibracją długości fali szczyt fluorescencji znajduje się w zakresie 700 nm–710 nm zamiast 680 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Zautomatyzowana analiza ziaren kriokonitu 
W przykładzie zautomatyzowanej analizy otworu kriokonitowego (Rysunek 10) najwyższe gęstości powierzchniowe pigmentów zaobserwowano w linii pikseli 50. Widmo próbki po wzbudzeniu laserem 532 nm wykazało szczyt z odcięciem przy wartości szarości 255 w wyniku przesycenia sensora. Szczyt ten pochodził z zielonego lasera, a nie z sygnału fluorescencyjnego.
<img alt="Analiza spektroskopowa z surowymi obrazami przy wzbudzeniu 532nm/405nm, wykresami gęstości i wykresami spektralnymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig10.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Zautomatyzowana analiza danych pojedynczego ziarna krikonitu o średnicy 1 mm. Próbkę pobrano z lodowca Vestre Brøggerbreen (VBB) i zmierzono w ciągu 4 h od pobrania w ciemnym pomieszczeniu laboratoryjnym w obiekcie Stacji Arktycznej (GB) w Ny-Ålesund. Lewa kolumna przedstawia pomiary B-PE, a prawa kolumna reprezentuje dane dla chla. Surowe obrazy wyświetlane są na górze. Odpowiedzi fluorescencji indukowanej laserowo przedstawiono w kolorze szarym. Obszary czerwone wskazują odpowiedź pigmentów standardowych. Środkowa sekcja ilustruje rozmieszczenie przestrzenne docelowych pigmentów. Właściwości spektralne sygnału fluorescencji przedstawiono na dolnych obrazach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wpływ wzbudzenia laserowego na produktywność mat bakteryjnych 
Ani produktywność pierwotna, ani bakteryjna nie uległy zmianie po zwiększeniu mocy lasera i/lub czasu ekspozycji (Rycina 11). Nie stwierdzono istotnych różnic podczas zabiegów laserowych z zwiększoną mocą.
<img alt="Wykres słupkowy produkcji węgla bakteryjnego; długości fal wzbudzenia 532 nm i 405 nm, zmienna moc." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60447/60447fig11.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11: Pomiary produktywności próbek ze Svalbardu. Maty bakteryjne poddano działaniu laserów zielonych i niebieskich o różnych intensywnościach i czasach ekspozycji. Dane są pokolorowane zgodnie z długością fali źródła laserowego (zielony i niebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60447/60447fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Strumienie węgla w kriosferze są jeszcze prawie nie oszacowane, ale są kluczowe dla zmian klimatycznych. Prezentujemy nowatorskie prototypowe urządzenie, które rejestruje potencjał fototroficzny w środowiskach nadraglacyjnych w oparciu o technologię emisji fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.), oferując dane o wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej w warunkach in situ.

Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery

Global warming affects microbial communities in a variety of ecosystems, especially cryospheric habitats. However, little is known about ...

Ogólnym celem tego badania jest kalibracja i przetestowanie nowatorskiego urządzenia, które może być używane do pomiarów biomarkerów in situ w siedliskach kriosferycznych. Urządzenie oparte jest na technologii Laser-Induced Fluorescence Emission (Laserowej Emisji Fluorescencji), określanej jako LIFE. Obecne standardowe metody pobierania próbek prowadzą do fizycznych oddziaływań na próbkę w wyniku wydobycia, rozpadu próbek przez rozdrabnianie i piłowanie oraz zmiany temperatury w wyniku topienia.Metody te często prowadzą do fałszowania warunków in situ. W związku z tym kluczowe znaczenie ma nowa metodologia wykrywania i charakteryzowania życia mikroorganizmów in situ. Opracowaliśmy nowatorską, nieinwazyjną, nieniszczącą metodę o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.Zastosowanie techniki emisji fluorescencji indukowanej laserem opiera się na fakcie, że środowiska supraglacjalne zamieszkują m.in. organizmy fototropowe. Organizmy te można śledzić, wykrywając fluorescencyjne wzory dodatkowych pigmentów na bazie porfiryny, chlorofilu A i fikoerytryny, które są wzbudzane odpowiednio przez niebieski i zielony laser. Przenośny zestaw o podwójnej długości fali waży 4,5 kilograma i jest używany na statywie w połączeniu z zewnętrznym komputerem.Tubus obiektywu jest skierowany w stronę preparatu. Następnie zielony laser o mocy pięciu miliwatów uderza w próbkę po przejściu przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej, który przekierowuje spolaryzowane światło w kierunku osi optycznej spektrometru. Okaz przedstawia światło fluorescencyjne zilustrowane na czerwono.Połowa skolimowanego światła przechodzi przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej i jest skupiana przez filtr długoprzepustowy, który usuwa sygnały laserowe. Następnie sygnał trafia w szczelinę przysłony, która składa się z dwóch regulowanych żyletek. Pryzmat spektralnie oddziela cienką linię światła prostopadłą do otworu szczelinowego, zanim sygnał zostanie przechwycony przez czujnik.Zabieg powtarza się za pomocą niebieskiego lasera. Surowe dane są automatycznie przesyłane do komputera przenośnego, który jest również używany do obsługi oprogramowania. Jest podzielony na trzy główne sekcje.Regulacja ekspozycji odbywa się ręcznie. W tym przypadku korekcja między czasem ekspozycji a intensywnością sygnału jest liniowa. Pole komentarza służy do opisu próbki.W prawej sekcji surowe obrazy są wyświetlane zaraz po zakończeniu pomiaru. Ta funkcja ma kluczowe znaczenie dla natychmiastowej oceny danych w terenie. Czerwone obszary oznaczają prześwietlone piksele, których można uniknąć, skracając czas naświetlania.Surowe obrazy w 12-bitowej skali szarości pokazują składową przestrzenną wynikającą z jednowymiarowej szczeliny apertury oraz składową spektralną wynikającą z pryzmatu znajdującego się przed matrycą CCD. W odpowiedzi na ograniczenia optyczne surowe obrazy są zniekształcone. Dlatego należy je przyciąć i usunąć zniekształcenia, stosując kod, który rozpoznaje stopień zniekształcenia.Następnie kalibracja długości fali odbywa się za pomocą lasera o długości fali 532 nanometrów. Zielone światło jest wytwarzane przez podwojenie częstotliwości lasera podczerwonego o długości 1 064 nanometra. Obie długości fal mogą być wykrywane przez matrycę CCD, dzięki czemu można obliczyć pozycję widmową każdego piksela na obrazach z korekcją zniekształceń.Następnie obraz jest przycinany do określonego zakresu długości fali. Wartości szarości z każdego piksela w wybranej linii piksela są zliczane i sumowane. Wartość szarości może należeć do zakresu od zera do 255.Następnie każda linia pikseli odpowiada za jedną liczbę. Na tym wykresie wartości szarości z każdej linii piksela są wykreślane względem współrzędnych przestrzennych. Pozwala to na ilościową dyskryminację przestrzenną chlorofilu i fikoerytryny jednocześnie w próbce.Dodatkowo, właściwości spektralne próbki mogą być wykreślane z wybranych linii pikseli. Konfiguracja w terenie jest szybka i łatwa. Zamocuj instrument na statywie.Podłącz tubus obiektywu do urządzenia. Podłącz USB Arduino i kamery. Podłącz komputer zewnętrzny do instrumentu za pomocą USB.Wyreguluj nogi statywu w taki sposób, aby tubus obiektywu zakrywał preparat. Uruchom oprogramowanie, opisz próbkę i rozpocznij pomiar. Do kalibracji pigmentu należy przygotować serię rzędów rozcieńczeń z roztworu podstawowego, jak pokazano.Roztwór podstawowy chlorofilu A należy rozcieńczyć acetonem, a rozcieńczenie fikoerytryny przeprowadza się destylowaną sterylną wodą. Piętnaście mililitrów każdego etapu rozcieńczania będzie potrzebne później. Chroń pigmenty przed światłem, owijając je folią aluminiową.Przechowuj chlorofil w zamrażarce, a fikoerytrynę w lodówce do dalszego użycia. Następnie zbuduj stojak, jak pokazano, z różnicą wysokości 1,5 centymetra. Dodać pięć mililitrów najwyżej skoncentrowanego rozcieńczenia do plastikowej fiolki z tworzywa sztucznego do poliscyntylacji.Objętość ta odpowiada 15-milimetrowemu słupowi wody w fiolce i mierzy intensywność fluorescencji. Następnie umieść fiolkę w środkowej pozycji stojaka i dodaj kolejne pięć mililitrów tego samego roztworu. Powtórz procedurę z kolejnymi pięcioma mililitrami, co odpowiada 45 milimetrom wysokości kolumny.Powtórz procedurę ze wszystkimi etapami rozcieńczania chlorofilu i fikoerytryny. Wysokość stojaka i kolumny odgrywa ważną rolę w pomiarze, ponieważ powierzchnia cieczy znajduje się w centralnym punkcie urządzenia LIFE. Zbierz próbki śniegu i lodu z lodowca.Dodatkowo należy pobrać próbki mat mikrobiologicznych z przedpola lodowca. W tym badaniu wybrano Midtre Lovenbreen, lodowiec znajdujący się w pobliżu ośrodków badawczych Ny-Alesund w wysoko-arktycznym archipelagu Svalbard. Rozpuść próbki śniegu i lodu i przefiltruj je próżniowo pod filtrami GF/F.Zwróć uwagę na filtrowany wolumin. Następnie zmierz filtry za pomocą urządzenia LIFE na czterech losowych obszarach, każdy w trzech częściach, używając zielonego i niebieskiego lasera. Oblicz całkowite stężenie pigmentu, mnożąc gęstość obszaru przez przefiltrowany obszar i przefiltrowaną objętość.Normalizuj stężenie pigmentu do objętości jednego litra. Umieść filtry w fiolce z 30 mililitrami acetonu i przechowuj je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie weź fiolkę i umieść ją na lodzie przed sonikacją na dwie minuty z mocą 50% w trybie ciągłym.Ścisnąć i wyjąć filtr z fiolki. Filtr nie jest już potrzebny. Podłączyć rurkę Tygon do strzykawki i usunąć z fiolki mieszaninę acetonu do ekstrakcji chlorofilu.Wymień rurkę Tygon na uchwyt filtra GF5. Przenieś roztwór do kuwety kwarcowej. Po skalibrowaniu spektrometru absorbancji dla acetonu, umieścić próbkę zawierającą kuwetę w spektrometrze i zmierzyć cechy absorbancji w zakresie od 400 do 750 nanometrów.Następnie wyjmij kuwetę ze spektrometru i dodaj do próbki 200 mikrolitrów dwóch molowych kwasów solnych. Następnie powtórzyć pomiar absorbancji w celu zmierzenia zawartości feofityny w próbce. Wpływ pomiaru laserowego na aktywność zbiorowisk bakteryjnych nie jest jeszcze szczegółowo opisany.W związku z tym efekt ten został zbadany poprzez produkcję pierwotną i wtórną. Do produkcji bakterii weź pięć porcji naszej maty bakteryjnej. Trzy podwielokrotności stosuje się do wychwytu leucyny znakowanej trytem, a dwie podwielokrotności stosuje się jako kontrole.Dezaktywuj kontrolki formaldehydem. Dodać leucynę znakowaną trytem do wszystkich podwielokrotności. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich próbek.W tym miejscu pokazano wymaganą ilość próbki dla naszego projektu eksperymentalnego. Następnie naświetl matę bakteryjną zielonym i niebieskim laserem, jak wskazano w konfiguracji eksperymentalnej. Następnie dezaktywuj wszystkie próbki, które nie zostały jeszcze potraktowane formaldehydem.Przenieść próbkę do kriowialu i dodać kwas trójchlorooctowy lub TCA. Odwirować fiolkę o stężeniu 10 000 g przez pięć minut. Dodać płyn scyntylacyjny i umieścić kriowial w fiolce wieloscyntylacyjnej.Przeanalizować próbki za pomocą licznika scyntylacji cieczy i obliczyć szybkość wychwytu. Do fotosyntezy przygotuj pięć podwielokrotności jak poprzednio, z których dwie są przyciemnione. Dodać radioaktywny znacznik NaH14 CO3 i inkubować przez cztery godziny.Po inkubacji należy przerwać reakcję, owijając próbki folią aluminiową. Zmierz rozpady na minutę za pomocą scyntylacji cieczy, jak opisano wcześniej. Po znormalizowaniu danych dla czasu ekspozycji wynoszącego jedną sekundę i wysokości kolumny próbki wynoszącej 15 milimetrów, końcowa linia kalibracji została obliczona przy użyciu regresji Poissona.Korelacja między gęstością obszaru a liczbą fotonów ma charakter liniowy. Nachylenie krzywej wynosi 81,04. Oznacza to, że szybkość zliczania fotonów wynosząca 8, 104 w próbce wystawionej na działanie promieni przez jedną sekundę równa się gęstości powierzchni 100 nanogramów na centymetr kwadratowy fikoerytryny.Odchylenie standardowe w próbkach o wyższym stężeniu można wytłumaczyć procesem samoabsorpcji w próbce. Krzywa kalibracyjna chlorofilu A wykazuje podobne charakterystyki i ma charakter liniowy o nachyleniu 8,94. Sześć przefiltrowanych próbek lodu i śniegu zmierzono za pomocą instrumentu LIFE przed ekstrakcją chlorofilu, a następnie pomiarami widma absorbancji w celu analizy zawartości chlorofilu.Próbki są uporządkowane według zawartości chlorofilu uzyskanej za pomocą spektrometrii absorbancji. Dane LIFE pokazują niewielkie odchylenia standardowe, co sugeruje, że materiał na filtrze był rozłożony stosunkowo równomiernie. Instrument LIFE zaniża zawartość chlorofilu w pierwszych trzech filtrach.Trzy ostatnie filtry, które wykazują niższą zawartość chlorofilu, są zawyżone przez instrument LIFE. Przyczynę rozbieżności danych można wyjaśnić grubością placka filtracyjnego. W cienkich plackach filtracyjnych, zilustrowanych kolorem pomarańczowym, sygnały o niskiej fluorescencji są wychwytywane ze względu na niską gęstość obszarową pigmentów.Sygnały chlorofilu A są zilustrowane na czerwono na tym surowym obrazie. Wszystkie szare obszary na tym surowym obrazie wskazują, że sam filtr wykazuje sygnały indukowane laserem po przejściu przez filtr długoprzepustowy o długości 450 nanometrów. Oprogramowanie błędnie policzyło ten sygnał jako fluorescencję chlorofilu A.Wysoka zawartość pigmentu była niedoszacowana, ponieważ laser nie był w stanie wywołać odpowiedzi fluorescencyjnej w cząsteczkach chlorofilu A w głębszych warstwach placka filtracyjnego. Eksperyment z ekspozycją laserową nie wykazuje znaczącego wpływu na pierwotną i wtórną produktywność mat bakteryjnych. Ani czas naświetlania od 5 do 60 sekund, ani intensywność lasera w zakresie od 5 do 50 miliwatów nie wykazały żadnego wpływu na wyniki wydajności.Oznacza to, że wyższe intensywności i czasy ekspozycji wymagane do wytworzenia lepszych sygnałów nie zaszkodzą komórkom. Cztery kriokonity zostały zmierzone in situ i porównane z roztworem wzorcowym chlorofilu, który został zmierzony w warunkach laboratoryjnych pokazanych na czerwono. Piki fluorescencji spektralnej w kolorze niebieskim są dopasowane do standardowego widma chlorofilu, zapewniając w ten sposób koncepcję pomiarów in-situ.Pomiary LIFE zostały przeprowadzone na glebach, matach bakteryjnych, biofilmach i kriokonitach. Pomiary LIFE kriokonitów z grubą warstwą osadu są możliwe, jeśli powierzchnia pokryta kriokonitem przekracza 12,5 centymetra kwadratowego. Ten rodzaj kriokonitu blokuje światło rozproszone spod lodu.W cienkich warstwach kriokonitu sygnały fluorescencyjne są osłonięte światłem otoczenia. W związku z tym pomiary LIFE powierzchni gołego lodu nie są możliwe, podczas gdy wszystkie inne typy próbek mogą być analizowane przez instrument LIFE. Zmiany temperatury prowadzą do zwiększonej dostępności wody w stanie ciekłym, co skutkuje większą aktywnością biologiczną na powierzchni lodowców.W konsekwencji stężenie pigmentu może wzrosnąć. Kluczowe jest monitorowanie tych zmian i przewidywanie możliwych i prawdopodobnych przyszłych scenariuszy.

laser-induced-fluorescence-emission-life-as-novel-non-invasive-tool

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Laserowa ablacja z jonizacją elektrosprayową (LAESI) jest źródłem jonów dla spektrometrii mas pracującym pod ciśnieniem atmosferycznym. W trybie obrazowania laser średniofalowy w podczerwieni bada rozkład cząsteczek w przekroju tkanki lub biofilmie. Technika ta stanowi nowe podejście do różnorodnych badań bioanalitycznych prowadzonych w natywnych warunkach doświadczalnych.

Obrazowanie molekularne tkanek biologicznych i biofilmów w ciśnieniu atmosferycznym przy użyciu spektrometrii mas LAESI

Laserowa spektroskopia rozpadu przeprowadzona na cienkich narządach i tkankach nowotworowych skutecznie wykryła naturalne pierwiastki i sztucznie wstrzyknięty gadolin (Gd), emitowany z nanocząstek opartych na Gd. Obrazy pierwiastków chemicznych osiągnęły rozdzielczość 100 μm i czułość ilościową poniżej mM. Kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej.

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

Mikroskopia koherentnego rozpraszania Ramanowskiego (CARS) oparta na naturalnej wibracji wiązań molekułowych pozwala na chemicznie selektywne obrazowanie żywych komórek bez znaczników. W pracy przedstawiono implementację komplementarnej techniki mikroskopowej na standardowym wielofotonowym laserowym mikroskopie skaningowym opartym na laserze femtosekundowym Ti:sapphire i laserze OPO.

Implementacja koherentnego systemu rozpraszania Ramana (CARS) na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym Ti:Sapphire i OPO

Metoda została opracowana w celu określenia właściwej pojemności cieplnej i przewodności cieplnej tkanki liścia za pomocą nieinwazyjnego, bezdotykowego sondowania laserowego w bliskiej podczerwieni, które wymaga mniej niż 1 minuty na próbkę.

Szybka metoda sondowania laserowego umożliwia nieinwazyjne i bezdotykowe określanie właściwości termicznych liści

W sercu, zdarzenia molekularne koordynują funkcję elektryczną i kurczliwą narządu. Zaprezentowany tu zestaw technik mikroskopii fluorescencyjnej pola lokalnego umożliwia rejestrację zmiennych komórkowych w nienaruszonych sercach. Identyfikacja mechanizmów definiujących czynność serca ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak serce działa w sytuacjach patologicznych.

Mikroskopia fluorescencyjna w polu lokalnym: obrazowanie sygnałów komórkowych w nienaruszonych sercach

Niskointensywna pulsacyjna stymulacja ultradźwiękowa (LIPUS) to metoda nieinwazyjnej mechanicznej stymulacji komórek endogennych lub inżynieryjnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym artykule opisano, jak wdrożyć LIPUS do mikroskopu epifluorescencyjnego i jak zminimalizować niedopasowanie impedancji akustycznej wzdłuż ścieżki ultradźwięków, aby zapobiec niepożądanym artefaktom mechanicznym.

Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

Ten protokół opisuje oryginalną konfigurację łączącą pomiary czasu życia widma i fluorescencji w celu oceny transferu energii rezonansu Förstera (FRET) między sondami fluorescencyjnymi na bazie rodaminy a polimerem ligniny bezpośrednio w grubych sekcjach rośliny.

Pomiar interakcji między sondami fluorescencyjnymi a ligniną w skrawkach roślin za pomocą sFLIM w oparciu o natywną autofluorescencję

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru promieniowania in situ w żywej tkance. Praca ta zawiera szczegółowe informacje na temat budowy sond w skali mikro do różnych pomiarów promieniowania i natężenia promieniowania, zawiera wskazówki dotyczące montażu tkanki w celu charakterystyki promieniowania oraz przedstawia metody obliczeniowe do analizy uzyskanych danych.

Mikrosonda radiometryczna wewnątrztkankowa do pomiaru promieniowania in situ w żywej tkance

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Odkryj nieinwazyjną metodę pomiaru biomarkerów w siedliskach kriosfery za pomocą technologii L.I.F.E. To nowatorskie narzędzie umożliwia wykrywanie chlorofilu A i fikoerytryny w terenie z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery (Wideo) | JoVE Journal

Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery

Przeglądaj więcej filmów