Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach
9 stycznia 2020
Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.
Opracowaliśmy innowacyjną metodę metabolomiki. Połączyliśmy obrazowanie spektralne żywych komórek za pomocą dzwonnicy ze spektrometrią mas pojedynczych komórek. Nasza technika może monitorować i przewidywać zmiany metaboliczne pojedynczych komórek w stosunku do leków.
A to otwiera wiele zastosowań dla podstaw, badań i przemysłu. Nasza metoda dodaje rozdzielczość pojedynczej komórki do obecnych technik oceny leków, co znacznie pomoże w przyszłych wysiłkach związanych z odkrywaniem leków. Nasza technika może również pomóc nam zrozumieć rolę, jaką odgrywa heterogeniczność komórkowa w oporności na nowotwory.
Pobieranie próbek z pojedynczych komórek i analiza danych są najtrudniejszymi aspektami w tym eksperymencie. Obecnie pracujemy nad automatyzacją tych dwóch kroków, zwłaszcza części dotyczącej próbkowania. Zalecamy przećwiczenie pobierania próbek z pojedynczych komórek na długo przed eksperymentem, ponieważ każda konfiguracja mikromanipulatora jest nieco inna i należy poświęcić trochę czasu na zapoznanie się z kontrolami.
Po inkubacji komórek w celu osiągnięcia 70% zbieżności, hoduj interesujące komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej, dodaj penicylinę-streptomycynę, aby uniknąć zanieczyszczenia. Po zmierzeniu gęstości komórek na hemocytometrze, subkulturuj komórki w 35-milimetrowym szklanym naczyniu siatkowym lub szkiełkach kwarcowych, używając tego samego podłoża o gęstości wysiewu 0,7 razy 10 do szóstej. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Następnego dnia komórki osiągają zbieg od 50 do 60%Umyj komórki dwa razy wstępnie podgrzanym buforem PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podziel komórki na podgrupy leczone i nieleczone lekami w 35-milimetrowych szalkach hodowlanych. Zmieszać tamoksyfen rozpuszczony w dimetylosulfotlenku z pożywką hodowlaną, aby uzyskać końcową objętość dwóch mililitrów i stężenie tamoksyfenu 10 mikromolowych.
Jest to grupa leczona lekiem. Wymieszaj odpowiednią objętość DMSO z pożywką jako grupa kontrolna, aby zbadać działanie DMSO. Inkubuj obie grupy w dwóch mililitrach wzbogaconego podłoża przez 24 godziny, aby osiągnąć zbieg od 70 do 80%Przed pomiarami spektralnymi sprawdź zgodność pozycji otworka i lasera za pomocą tarczy.
Aby skalibrować spektrofotometr przed każdym eksperymentem, umieść etanol w naczyniu ze szklanym dnem, zmierz widmo przy danym natężeniu lasera przez jedną sekundę i powiąż pik ze znanymi długościami fal. Następnie ustaw mikrokomorę na 5% dwutlenku węgla i 37 stopni Celsjusza. Gdy system mikroskopowy jest gotowy, wyjmij komórki z inkubatora i natychmiast dwukrotnie przepłucz komórki podgrzanym buforem PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie dodaj dwa mililitry podgrzanego PBS lub FluoroBrite DMEM. Dodaj 10 mikrolitrów wody na soczewkę obiektywu zanurzonego w wodzie. I delikatnie umieść naczynie ze szklanymi dolnymi komórkami na stoliku mikroskopu.
Zamocuj system pobierania próbek komórek na mikroskopie Ramana. Podłącz mikromanipulator 3D do szklanego uchwytu kapilary, który jest przymocowany do pustej strzykawki w celu zasysania próbki. Ustaw mikroskop na pole o dużym powiększeniu 40 razy, aby obserwować końcówkę szklanej kapilary i upewnij się, że nie jest uszkodzona.
Kontroluj położenie szklanej kapilary za pomocą mikromanipulatora. Upewnij się, że końcówka kapilary jest wyśrodkowana w polu view. Następnie przesuń kapilatę w górę na osi Z, aby później uzyskać odstęp dla naczynia hodowlanego.
Umieść miskę na próbkę na stoliku mikroskopu, wyreguluj powiększenie i ostrość, wybierz komórkę docelową na czaszy siatki i przesuń ją do środka view. Zmierz każdą komórkę, ustawiając ostrość na linii lasera. Czas ekspozycji wynoszący 15 sekund na komórkę jest wystarczający do uzyskania przekroju poprzecznego komórki z wyraźnym sygnałem Ramana.
Lustro galwano-lustrzane umożliwia zeskanowanie jednej komórki lub grupy komórek w ciągu kilkudziesięciu minut. Następnie ostrożnie opuść szklaną kapilarnę za pomocą mikromanipulatora, aż końcówka znajdzie się w ostrości. Pod obserwacją mikroskopową dotknij docelowej pojedynczej komórki końcówką kapilarną.
Następnie zacznij stosować podciśnienie za pomocą strzykawki, aby uwięzić komórkę wewnątrz końcówki kapilary. Nagraj tę procedurę, nagrywając film, aby dokładnie sprawdzić czas i zassane położenie komórki. Przesuń kapilę w górę na osi Z.
Następnie odłącz kapilę od uchwytu kapilary za pomocą kleszczy w przygotowaniu do analizy spektrometrii mas. Po ustawieniu przyrządu do spektrometrii mas i przeanalizowaniu pożywki, dodaj dwa mikrolitry rozpuszczalnika jonizacyjnego do kapilary zawierającej komórkę. Przymocuj kapilarę do adaptera nano-elektrorozpylania podłączonego do odpowiedniego spektrometru mas i uruchom metodę automatycznej akwizycji.
Przedstawiono tutaj analizę porównawczą średniego spektrum każdego schorzenia, z leczeniem farmakologicznym i bez niego. Średnie spektrum tych dwóch stanów wyraźnie różni się w różnych szczytach. W szczególności piki na poziomie 1 000 na centymetr, co jest znakiem dla związków aromatycznych, takich jak fenyloalanina i tyrozyna, wykazują silne różnice.
Na podstawie rzutu na model struktury utajonej obliczono wyniki VIP, które reprezentują znaczenie długości fal w rozróżnianiu warunków eksperymentalnych. Co ważne, najwyższe szczyty profili VIP odpowiadały pikom Ramana, dla których zaobserwowano silne różnice między tymi dwoma zabiegami. Potwierdziło to specyficzne różnice molekularne między komórkami poddanymi działaniu substancji i nieleczonych.
Po pozytywnej identyfikacji zmierzono względną obfitość leku i jego metabolitów w każdej komórce i porównano z pikami tła w komórkach nieleczonych. Zaobserwowano silne zróżnicowanie w obfitości tamoksyfenu. Zjawisko to było jeszcze bardziej wyraźne w przypadku jego metabolitu 4-hydroksy-tamoksyfenu.
Naukowcy mogą być zainteresowani badaniem związku między obrazami spektralnymi a profilami metabolicznymi komórek. Nasze badania mają również zastosowania przemysłowe, ponieważ pozwalają na lokalne badania przesiewowe komórek do produkcji farmaceutycznej. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania rozpuszczalnika jonizacyjnego do pomiarów spektrometrem mas.
Powinien być przygotowany pod wyciągiem. Należy również uważać, aby nie dotykać źródła jonów przyrządu spektrometru mas, aby uniknąć porażenia prądem. Wreszcie, kapilary do pobierania próbek używane podczas pomiaru są bardzo ostre, dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie, aby uniknąć obrażeń.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje innowacyjną metodę łączącą spektroskopię Ramanowską i spektrometrię mas w celu analizy pojedynczych komórek. Technika ta umożliwia monitorowanie odpowiedzi komórkowej na leki oraz dostarcza informacji na temat ich pobierania i metabolizmu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Metabolomika
Wstęp
- Analiza pojedynczych komórek jest kluczowa dla zrozumienia heterogeniczności komórkowej.
- Obecne techniki oceny leków nie oferują rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek.
- Spektroskopia Ramana i spektrometria mas to potężne narzędzia w badaniach metabolicznych.
- Automatyzacja pobierania próbek i analizy danych stanowi kluczowe wyzwanie w tej dziedzinie.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy zmian metabolicznych w pojedynczych komórkach.
- Wsparcie procesu odkrywania leków poprzez dostarczenie szczegółowych danych na temat odpowiedzi komórkowych.
- Zbadanie zależności między heterogenicznością komórkową a opornością na leki w nowotworach.
Zastosowane metody
- Komórki są hodowane i poddawane działaniu leków, takich jak Tamoksyfen.
- Spektroskopia Ramana jest wykorzystywana do pozyskiwania danych spektralnych z pojedynczych komórek.
- Spektrometria mas służy do analizy poboru leku oraz obecności metabolitów.
- Dane z komórek traktowanych i nietraktowanych są porównywane w celu zidentyfikowania różnic metabolicznych.
Główne wyniki
- Zaobserwowano istotne różnice w widmach Ramana między komórkami traktowanymi lekiem a nietraktowanymi.
- Poziomy metabolitów, w szczególności tamoksyfenu i jego metabolitu, wykazywały znaczne zróżnicowanie.
- Metoda ta umożliwia lokalny screening komórek w zastosowaniach farmaceutycznych.
- W celu zwiększenia wydajności opracowywane są zautomatyzowane systemy pobierania próbek i analizy.
Wnioski
- Zintegrowane podejście dostarcza cennych informacji na temat metabolizmu leków na poziomie pojedynczych komórek.
- Technika ta znajduje potencjalne zastosowania zarówno w badaniach naukowych, jak i w przemyśle.
- Zrozumienie odpowiedzi komórkowych może prowadzić do opracowania lepszych strategii terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Heterogeniczność odpowiedzi na leki na poziomie pojedynczych komórek stanowi krytyczne wyzwanie w wczesnej fazie odkrywania leków, gdzie dane uśrednione dla całej populacji mogą maskować subpopulacje odpowiedzialne za oporność lub zmienną skuteczność. Integracja spektroskopii Ramana z spektrometrią mas umożliwia bezpośrednią korelację fenotypów metabolicznych z poborem leku i tworzeniem się metabolitów w rozdzielczości pojedynczej komórki, co zwiększa pewność walidacji celu oraz redukuje ryzyko mechanistyczne. Możliwość ta wspiera tworzenie bardziej predykcyjnych modeli przedklinicznych i informuje decyzje dotyczące portfela projektów poprzez wcześniejszą identyfikację biologicznie istotnych subpopulacji w kaskadzie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie indukowanych lekami przesunięć metabolicznych z konkretnymi celami molekularnymi w poszczególnych komórkach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celów poprzez bezpośredni pomiar metabolizmu leków i wynikających z niego zaburzeń metabolicznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera screening fenotypowy poprzez identyfikację subpopulacji responderów i non-responderów na podstawie sygnatur metabolicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe, multipleksowe odczyty poziomów leków i metabolitów wraz z ogólnym stanem metabolicznym, co umożliwia standaryzowane profilowanie pojedynczych komórek.
- Powtarzalność: Ułatwia porównywanie wyników między różnymi seriami pomiarowymi dzięki wewnętrznej normalizacji do endogennych pików Ramana i sygnałów tła MS.
- Skalowalność: Wspiera przesiewy o średniej przepustowości dzięki zautomatyzowanemu pobieraniu próbek kapilarnych i sekwencyjnej analizie ułożonych w macierzy pojedynczych komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badania chorób: Modeluje heterogeniczność odpowiedzi komórek nowotworowych na leki, co jest szczególnie istotne w badaniu mechanizmów nabytej oporności.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań in vitro z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie oddziaływania z celem oraz losów metabolicznych w komórkach pierwotnych lub pochodzących od pacjentów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o spójność metabolizmu leku w heterogenicznych populacjach komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma ta wpisuje się w przebieg prac w biologii odkrywczej, następując po badaniach zaangażowania celu, a poprzedzając optymalizację związku wiodącego, gdzie zrozumienie losów metabolicznych i zmienności komórkowej dostarcza informacji dla profilowania SAR oraz ADME.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez, ujawniając, czy obserwowane fenotypy korelują ze specyficznymi zaburzeniami metabolicznymi w komórkach eksponowanych na działanie leku.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych danych z pojedynczych komórek na temat akumulacji i biotransformacji leków, co umożliwia segregację trafień (hit triage) w oparciu o stabilność metaboliczną.
- Analityka: Zapewnia wielowymiarowe wyniki (wyniki Raman VIP, pola pików MS), które ułatwiają porównywanie warunków oraz opracowywanie sygnatur typu biomarker.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez walidację wyników metabolicznych w modelach istotnych dla danej choroby, takich jak linie raka piersi oporne na tamoksyfen.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi reużywalną zdolność analityczną do fenotypowania metabolicznego w różnych obszarach terapeutycznych, co ogranicza powielanie prac nad opracowaniem metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośredniej obserwacji losów leku i odpowiedzi metabolicznej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki korelacyjnym odczytom Raman-MS oraz zdefiniowanym protokołom pobierania próbek.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania wad metabolicznych lub mechanizmów oporności, co zmniejsza odsetek niepowodzeń w późnych etapach badań.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków o spójnych profilach metabolicznych na poziomie pojedynczych komórek w heterogenicznych populacjach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikropobierania próbek, pozyskiwania widm Ramana oraz obsługi spektrometrii mas z nano-ESI.
- Zależy od zintegrowanej aparatury, w tym konfokalnych mikroskopów Ramanowskich, mikromanipulatorów oraz systemów MS o wysokiej czułości.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja technik pobierania próbek, przygotowania rozpuszczalników oraz potoków analizy danych dla zbiorów danych Raman i MS.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych typów komórek, podłoży hodowlanych oraz właściwości fizykochemicznych leków wpływających na jonizację i detekcję.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak niska przepustowość w porównaniu z metodami przepływowymi oraz wyzwania techniczne związane z utrzymaniem żywotności komórek podczas pobierania próbek.
