Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate
31 października 2019
Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.
Sinice są ważną gromadą mikroorganizmów fotosyntetycznych, które są coraz częściej uznawane za użyteczne platformy dla zastosowań biologii syntetycznej i biotechnologii odnawialnej. Dlatego ważne jest opracowanie solidnych technik upraszczających projektowanie, klonowanie i wprowadzanie heterologicznego DNA do różnych gatunków sinic. Tak więc ta technika demonstruje dobrze znaną metodę zwaną koniugacją lub kojarzeniem trirodzicielskim w celu wprowadzenia DNA do gatunków sinic, które nie są naturalnie przekształcane.
Koniugację z powodzeniem przeprowadzono w szerokiej gamie szczepów sinic, od jednokomórkowych do wielokomórkowych gatunków nitkowatych. Jeśli próbujesz tej techniki po raz pierwszy, pamiętaj, aby ostrożnie obchodzić się zarówno ze szczepami sinic, jak i E.coli. Na przykład nie wiruj powyżej wartości podanych w protokole i nie wiruj.
Mieszanie bakterii i cyjanobakterii może wydawać się dziwne dla początkujących użytkowników. Mamy nadzieję, że pokazując proces koniugacji, pomożemy to wyjaśnić. Po zbudowaniu zespołów poziomu pierwszego należy wybrać odpowiedni wektor akceptora poziomu T.
Wybierz odpowiednie ogniwo końcowe, aby podwiązać trzy główne końcówki końcowego zespołu poziomu pierwszego do szkieletu poziomu T. Aby zmontować jeden lub więcej zespołów poziomu pierwszego na poziomie T, należy przygotować mieszaninę reakcyjną z PBI1 i wymaganym wektorem łącznika końcowego. Zainstaluj program termocyklera i postępuj zgodnie z manuskryptem.
Pierwszego dnia hoduj kulturę sinic, zakładając nową kulturę Synechocystis PCC 6803 lub Synechococcus elongatus UTEX 2973. Za pomocą sterylnej pętli termicznej zeskrobać komórki z płytki agarowej aksenu BG-11 i umieścić w 100-mililitrowej stożkowej kolbie wypełnionej 50 mililitrami świeżej pożywki BG-11 do zaszczepienia. Umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem z oświetleniem, aby wyhodować kultury komórkowe Synechocystis PCC 6803 w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 100 obr./min.
W przypadku Synechococcus elongatus UTEX 2973 hodować kultury komórkowe w temperaturze 40 stopni Celsjusza przy 100 obr./min. Po jednym do dwóch dni narysuj jeden mililitr kultury komórkowej i zmierz na spektrofotometrze. Absorbancja przy OD 750 osiąga od 0,5 do 1,5.
Drugiego dnia zaszczepić szczep pomocniczy MC1061 E.coli zawierający wektory PRK24 i PRL528 w pięciu mililitrach pożywki LB ampicyliną w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr i chloramfenikolem w stężeniu 25 mikrogramów na mililitr. Rośnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc z prędkością 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnie zaszczepić pięć mililitrów pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki kulturą E. coli przenoszącą wektor ładunku poziomu T.
Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przy 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Trzeciego dnia należy odwirować przez noc kultury bakterii E. coli w roztworze pomocniczym i ładunku w temperaturze 3 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego.
Umyj granulki, dodając pięć mililitrów świeżej pożywki LB bez antybiotyków. Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować w celu usunięcia supernatantu. Powtórz ten etap mycia trzy razy, aby usunąć resztki antybiotyków z nocnej hodowli.
Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w połowie objętości pożywki LB w stosunku do początkowej objętości hodowli. Następnie połącz 450 mikrolitrów szczepu pomocniczego z 450 mikrolitrami szczepu ładunkowego w dwumililitrowej tubce i pozostaw w temperaturze pokojowej. Następnie należy przygotować kulturę sinic, odwirowując jeden mililitr kultury sinic w temperaturze 1 500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Umyć osad cztery razy, dodając świeże podłoże BG-11 o tej samej objętości początkowej. Dodaj 900 mikrolitrów przemytej kultury sinic do 900 mikrolitrów połączonych szczepów E. coli w dwumililitrowej probówce.
Wymieszaj kultury, delikatnie pipetując w górę i w dół. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w przypadku Synechocystis PCC 6803 lub dwie godziny w przypadku Synechococcus elongatus UTEX 2973. Odwirować mieszaninę o stężeniu 1 500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Usunąć 1,6 mililitra supernatantu i ponownie zawiesić osad w pozostałym supernatantze. Umieść jeden filtr membranowy 0.45 mikrona na płytce agarowej LB BG-11 bez antybiotyków. Ostrożnie rozprowadzić 200 mikrolitrów mieszanki kultur E.coli/cyjanobakterii na membranie za pomocą sterylnego rozsiewacza lub sterylnej zagiętej końcówki.
Uszczelnij płytkę folią parafinową i umieść płytkę w oświetlonym inkubatorze na 24 godziny. Po 24 godzinach ostrożnie przenieś membranę za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy na świeżą płytkę agarową BG-11 zawierającą odpowiednie antybiotyki, które należy wybrać dla wektora ładunku. Uszczelnij płytkę folią parafinową i inkubuj w tych samych warunkach, co poprzednio, aż pojawią się kolonie.
Kolonie pojawiają się zwykle po 7-14 dniach w przypadku Synechocystis PCC 6803 i 3-7 dni w przypadku Synechococcus elongatus UTEX 2973. Aby wybrać koniuganty, za pomocą sterylnego termicznie pręta do zaszczepiania, wybierz co najmniej dwie pojedyncze kolonie z błony i rozprowadź smugi na nowej płytce agarowej BG-11 zawierającej odpowiednie antybiotyki. Następnie zaszczepić smugę kultury sinic w 15-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej pięć mililitrów pożywki LB i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przy 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
Klarowny posiew potwierdza brak zanieczyszczenia E. coli. Po wystarczającym okresie wzrostu wynoszącym siedem dni należy wybrać poszczególne kolonie akseniczne, aby utworzyć płynne kultury do długotrwałego przechowywania kriogenicznego lub późniejszych eksperymentów. W niniejszej pracy zademonstrowano przebieg montażu Golden Gate.
Po przekształceniu reakcji składania zidentyfikowano udane zespoły za pomocą standardowych niebiesko-białych badań przesiewowych kolonii E. coli. Kaseta wyrażeń eYFP w wektorze pierwszego poziomu i ogniwo końcowe jednego wektora zostały następnie połączone w wektor akceptorowy poziomu T, aby uzyskać wektor cpcBA-eYFP. Złożony wektor cpcBA-eYFP został zweryfikowany przez trawienie restrykcyjne.
Pomyślne małżeńskie przeniesienie cpcBA-eYFP lub wektora pPMQAK1-T spowodowało wzrost na błonie nawet kilkuset kolonii dla Synechocystis PCC 6803 i Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zgodnie z oczekiwaniami dla silnego promotora Pcpc560, wartości znormalizowanej fluorescencji eYFP z czytnika płytek i fluorescencji eYFP na komórkę z cytometru przepływowego były wysokie w porównaniu z kontrolą ujemną. Zarówno w przypadku czytnika płytek, jak i cytometru przepływowego wartości fluorescencji były wyższe w Synechococcus elongatus UTEX 2973 niż w Synechocystis PCC 6803.
Upewnij się, że inkubujesz przez minimalny czas, w zależności od szczepu, który koniugujesz.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół budowy wektora samoreplikującego się z wykorzystaniem zestawu do klonowania modułowego CyanoGate oraz wprowadzania go do gospodarzy sinicowych poprzez koniugację. Podkreślono znaczenie tych technik w celu uproszczenia projektowania i klonowania heterologicznego DNA w sinicach, które są cenne w zastosowaniach biologii syntetycznej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia syntetyczna
- Biotechnologia
- Inżynieria genetyczna sinic
Wstęp
- Sinice są istotnymi mikroorganizmami fotosyntetyzującymi wykorzystywanymi w biotechnologii odnawialnej.
- Koniugacja jest metodą wprowadzania DNA do sinic, które nie wykazują naturalnej transformowalności.
- Niezbędne są niezawodne techniki klonowania DNA dla różnych gatunków sinic.
Zastosowane metody
- Montaż wektorów samopowielających się z wykorzystaniem zestawu narzędzi CyanoGate.
- Koniugacja w celu wprowadzenia DNA do cyjanobakterii.
- Charakterystyka z użyciem czytników płytek i cytometrii przepływowej.
Główne wyniki
- Pomyślna konstrukcja i weryfikacja wektora cpcBA-eYFP.
- Wykazanie skutecznej konjugacji w szczepach Synechocystis PCC 6803 oraz Synechococcus elongatus UTEX 2973.
- Ustanowienie technik selekcji transgenicznych cyjanobakterii.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę manipulacji genetycznej sinic.
- Wskazuje ono na postępy w zakresie narzędzi dla biologii syntetycznej oraz zastosowań w odnawialnych źródłach energii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustandaryzowane modułowe przepływy pracy dotyczące klonowania i konjugacji, takie jak te umożliwione przez zestaw narzędzi CyanoGate, są kluczowe dla przyspieszenia inżynierii genetycznej w sinicach. Możliwości te usprawniają konstrukcję i transfer wektorów ekspresyjnych, wspierając szybką weryfikację hipotez i walidację funkcjonalną w procesach biotechnologii odnawialnej. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną i skalowalność w fazie wczesnego odkrywania oraz rozwoju szczepów platformowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Ułatwia szybki montaż i testowanie konstruktów genetycznych do badania szlaków metabolicznych.
- Umożliwia funkcjonalną walidację promotorów i elementów genetycznych w odpowiednich gospodarzach z rodzaju cyjanobakterii.
- Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie bezpośredniego pomiaru produktów ekspresji.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze celów w fotosyntetycznych platformach mikrobiologicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje genetycznie zdefiniowane szczepy cyjanobakterii do dalszych procesów przesiewowych.
- Standaryzuje montaż i transfer wektorów, zapewniając powtarzalność eksperymentów.
- Umożliwia ilościowe odczyty za pomocą markerów fluorescencyjnych przy użyciu czytników płytek i cytometrii przepływowej.
- Wspiera skalowalne i wielokrotnego użytku platformy testowe dla zastosowań w biologii syntetycznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia dostosowanie zmodyfikowanych systemów cyjanobakteryjnych do procesów rozwoju szczepów przemysłowych.
- Zapewnia ciągłość działań, od walidacji elementów genetycznych po przedkliniczną optymalizację szczepów.
- Zmniejsza ryzyko związane z wdrażaniem zmodyfikowanych szczepów do zastosowań w bioprodukcji.
- Umożliwia porównywanie konstruktów genetycznych w wielu gatunkach cyjanobakterii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Modułowy system klonowania i konjugacji CyanoGate integruje etap wczesnych odkryć z inżynierią szczepów, umożliwiając płynne przejście od projektowania konstruktu do walidacji funkcjonalnej w sinicach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie elementów genetycznych i sekwencji regulacyjnych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki fluorescencji do analizy porównawczej.
- Analityka: Wykorzystuje dane z czytnika płytek oraz cytometrii przepływowej do oceny wydajności konstruktów.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z przedklinicznym opracowaniem szczepów do odnawialnej bioprodukcji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany, modułowy schemat pracy, który można dostosować do różnych gospodarzy z rodzaju sinic.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność w zakresie funkcji części genetycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność procesów inżynieryjnych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) oraz efektywną alokację zasobów w rozwoju platformy.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację zmodyfikowanych szczepów z uwzględnieniem ryzyka w celu ich dalszego rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu klonowania molekularnego, hodowli cyjanobakterii oraz technik konjugacji.
- Niezbędny jest dostęp do termocyklerów, spektrofotometrów, czytników płytek oraz cytometrów przepływowych.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności składania i transferu wektorów.
- Możliwe może być konieczność adaptacji metody dla różnych gatunków cyjanobakterii lub tła genetycznego.
- Kluczowe jest zachowanie szczególnej ostrożności w celu zapobiegania kontaminacji i zapewnienia skutecznej konjugacji.
