Name: Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj modyfikację genetyczną cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu zestawu CyanoGate. Ta metoda umożliwia wprowadzanie DNA do gatunków nienadających się do naturalnej transformacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Radzie ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC) PHYCONET Network in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) oraz Centrum Innowacji Biotechnologii Przemysłowej (IBioIC) za wsparcie finansowe. GARG, AASO i AP potwierdzają wsparcie finansowe odpowiednio z programu doktoranckiego BBSRC EASTBIO CASE (numer grantu BB/M010996/1), programu doktoranckiego Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) oraz programu doktoranckiego IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP). Dziękujemy Conradowi Mullineaux (Queen Mary University of London) oraz Poulowi Ericowi Jensenowi i Julie Annemarie Zita Zedler (University of Copenhagen) za wkład i porady dotyczące wektora plazmidowego i protokołu.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Montaż Golden Gate ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami montażu wektorowego, szczególnie pod względem skalowalności 20,21. Niemniej jednak, konfiguracja systemu Golden Gate w laboratorium wymaga czasu na zaznajomienie się z różnymi częściami i bibliotekami wektorów akceptorowych oraz ogólnymi procesami montażu. Staranne planowanie jest często potrzebne w przypadku bardziej złożonych zestawów lub podczas wykonywania dużej liczby złożonych zestawów równole...

Cyjanobakterie to bakterie autotroficzne, które mogą być wykorzystywane do biosyntezy szerokiej gamy naturalnych i heterologicznych produktów przemiany materii o wysokiej wartości1,2,3,4,5,6. Nadal trzeba pokonać kilka przeszkód, aby zwiększyć ich opłacalność komercyjną, w szczególności stosunkowo niskie plony w porównaniu z heterotroficznymi bioplatformami (np. Escherichia coli i drożdże)7. Niedawne rozszerzenie dostępnych narzędzi inżynierii genetycznej i przyjęcie paradygmatu biologii syntetycznej w badaniach nad sinicami pomaga przezwyciężyć takie wyzwania i dalej rozwijać sinice jako wydajne biofabryki8,9,10.
Główne podejścia do wprowadzania DNA do cyjanobakterii to transformacja, koniugacja i elektroporacja. Wektory przenoszone do cyjanobakterii w wyniku transformacji lub elektroporacji są wektorami "samobójczymi" (tj. wektorami integracyjnymi, które ułatwiają rekombinację homologiczną), podczas gdy wektory samoreplikujące się mogą być przenoszone do cyjanobakterii przez transformację, koniugację lub elektroporację. W pierwszym przypadku dostępny jest protokół dla gatunków modeli inżynieryjnych podatnych na naturalną transformację11. Niedawno opracowano modułowy zestaw narzędzi do klonowania (MoClo) dla cyjanobakterii o nazwie CyanoGate, który wykorzystuje ustandaryzowaną metodę składania wektorów Golden Gate do inżynierii przy użyciu naturalnej transformacji, elektroporacji lub koniugacji12.
techniki montażu typu Golden Gate stały się w ostatnich latach coraz bardziej popularne, a standardy montażu i biblioteki części są teraz dostępne dla różnych organizmów13,14,15,16,17. Golden Gate wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS (np. BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI i AarI) oraz zestaw akceptorów i unikalnych nawisów, aby ułatwić kierunkowe hierarchiczne składanie wielu sekwencji w reakcji składania "jednego garnka". Enzymy restrykcyjne typu IIS rozpoznają unikalną asymetryczną sekwencję i przecinają określoną odległość od swoich miejsc rozpoznawania, aby wygenerować naprzemienne, "lepkie zakończenie" (zwykle zwis 4 nukleotydów [NT]), które można następnie wykorzystać do napędzania uporządkowanych reakcji składania DNA15,18. Ułatwiło to opracowanie dużych bibliotek modułowych części poziomu 0 (np. promotorów, otwartych ramek odczytu i terminatorów) zdefiniowanych przez wspólną składnię, taką jak PhytoBricks standard19. Części poziomu 0 mogą być następnie łatwo składane w kasety ekspresji poziomu 1, po czym bardziej złożone zespoły wyższego rzędu (np. konstrukcje ekspresji wielogenowej) mogą być budowane w wybranym wektorze akceptorowym12,15. Kluczową zaletą technik montażu typu Golden Gate jest ich zdolność do automatyzacji w obiektach o wysokiej przepustowości, takich jak odlewnie DNA20,21, co może pozwolić na testowanie złożonych projektów eksperymentalnych, które nie mogą być łatwo osiągnięte przy użyciu pracy ręcznej.
CyanoGate opiera się na sprawdzonym systemie Plant MoClo class12,15. Aby włączyć nową część do CyanoGate, sekwencja części musi najpierw zostać udomowiona, tj. "nielegalne" strony rozpoznawania BsaI i BpiI muszą zostać usunięte. W przypadku kodowania części dla otwartej ramki odczytu (tj. sekwencji kodującej, CDS), miejsca rozpoznawania mogą zostać zakłócone przez generowanie synonimicznych mutacji w sekwencji (tj. zmiana kodonu na alternatywę, która koduje tę samą resztę aminokwasową). Można to osiągnąć za pomocą różnych podejść, począwszy od syntezy DNA, a skończywszy na strategiach opartych na amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takich jak Gibson assembly22. W zależności od używanego gospodarza wyrażenia, należy zachować ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia rzadkich kodonów, które mogłyby hamować wydajność translacji23. Usuwanie miejsc rozpoznawania w sekwencjach promotora i terminatora jest zazwyczaj bardziej ryzykownym przedsięwzięciem, ponieważ modyfikacje mogą wpłynąć na funkcję, a część może nie działać zgodnie z oczekiwaniami. Na przykład zmiany w przypuszczalnych miejscach wiązania czynnika transkrypcyjnego lub miejscu wiązania rybosomów w promotorze mogą zmienić siłę i reakcję na indukcję/represję. Podobnie, modyfikacje kluczowych cech strukturalnych terminatora (np. rdzenia bogatego w GC, pętli i ogona poli-U) mogą zmienić wydajność terminacji i wpłynąć na ekspresję genów24,25. Chociaż dostępnych jest kilka zasobów internetowych do przewidywania aktywności sekwencji promotora i terminatora oraz informowania, czy proponowana mutacja wpłynie na wydajność26,27, narzędzia te są często słabymi predyktorami wydajności w cyjanobacteria28,29,30.. W związku z tym nadal zaleca się charakterystykę in vivo zmodyfikowanych części w celu potwierdzenia aktywności. Aby pomóc w klonowaniu opornych sekwencji, CyanoGate zawiera wektor akceptora klonowania o niskiej kopii oparty na wektorze BioBrick pSB4K512,16,31. Ponadto w Edinburgh Genome Foundry dostępny jest portal "Zaprojektuj i zbuduj", który pomaga w projektowaniu wektorów (dab.genomefoundry.org). Wreszcie, co najważniejsze, CyanoGate zawiera dwa projekty wektorów akceptorowych poziomu T (odpowiednik wektorów akceptorowych poziomu 2)15 do wprowadzania DNA do cyjanobakterii za pomocą wektorów samobójczych lub wektorów o szerokim zakresie gospodarzy zdolnych do samoreplikacji w kilku gatunkach sinic32,33,34.
Tutaj skupimy się na opisaniu protokołu generowania samoreplikujących się wektorów poziomu T oraz genetycznej modyfikacji Synechocystis PCC 6803 i Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 i S. elongatus UTEX 2973 dalej) poprzez koniugację (znaną również jako kojarzenie trójrodzicielskie). Małżeński transfer DNA między komórkami bakteryjnymi jest dobrze opisanym procesem i był wcześniej stosowany do inżynierii gatunków sinic, w szczególności tych, które nie są naturalnie kompetentne, takich jak S. elongatus UTEX 297335,36,37,38,39,40,41. W skrócie, kultury cyjanobakterii są inkubowane ze szczepem E. coli, który przenosi wektor, który ma zostać przeniesiony (wektor "cargo") i wektory (albo w tym samym szczepie E. coli, albo w dodatkowych szczepach), aby umożliwić koniugację wektorów ("mobilizator" i "pomocniczy"). Aby doszło do transferu małżeńskiego, wymagane są cztery kluczowe warunki: 1) bezpośredni kontakt między komórkami biorącymi udział w transferze DNA, 2) wektor ładunkowy musi być zgodny z systemem koniugacji (tj. musi zawierać odpowiednie pochodzenie transferu (oriT), znane również jako miejsce bom (podstawa mobilności)), 3) białko nacinające DNA (np. kodowane przez gen mob), które nacina DNA w oreniT aby zainicjować jednoniciowy transfer DNA do cyjanobakterii musi być obecny i wyrażony przez wektory ładunkowe lub pomocnicze, oraz 4) przenoszone DNA nie może zostać zniszczone w biorcy cyjanobakterii (tj. musi być odporne na degradację, na przykład przez restrykcyjną aktywność endonukleazy)35,42. Aby wektor ładunku przetrwał, początek replikacji musi być zgodny z cyjanobakterią biorcy, aby umożliwić samoreplikację i proliferację do komórek potomnych po podziale. Aby pomóc w warunkach 3 i 4, kilka wektorów pomocniczych jest dostępnych za pośrednictwem Addgene i innych komercyjnych źródeł, które kodują mob, a także kilka metylaz w celu ochrony przed natywnymi endonukleazami w gospodarzu cyanobacterium43. W tym protokole koniugacja była ułatwiona przez szczep MC1061 E. coli przenoszący wektory mobilizatora i pomocnika pRK24 (www.addgeneorg/51950) i pRL528 (www.addgene.org/58495). Należy zachować ostrożność przy wyborze wektorów, które mają być używane do transferu małżeńskiego. Na przykład w zestawie CyanoGate samoreplikujący się wektor ładunku pPMQAK1-T koduje białko Mob 12. Jednak pSEVA421-T nie 44, i jako taki, mob musi być wyrażony z odpowiedniego wektora pomocniczego. Stosowane wektory powinny być również odpowiednie dla organizmu zwalczanego. Na przykład sprawny transfer małżeński w Anabaena sp. PCC 7120 wymaga wektora pomocniczego, który chroni wektor mobilizatora przed trawieniem (np. pRL623, który koduje trzy metylazy: AvaiM, Eco47iiM i Ecot22iM)45,46.
W tym protokole dodatkowo opisujemy, jak scharakteryzować działanie części (tj. promotorów) za pomocą markera fluorescencyjnego za pomocą czytnika płytek lub cytometru przepływowego. Cytometry przepływowe są w stanie mierzyć fluorescencję na podstawie pojedynczej komórki dla dużej populacji. Co więcej, cytometry przepływowe pozwalają użytkownikom "bramkować" pozyskane dane i usuwać szumy tła (np. z cząstek stałych w kulturze lub zanieczyszczeń). W przeciwieństwie do tego, czytniki płytek uzyskują zagregowany pomiar fluorescencji danej objętości hodowli, zwykle w kilku powtórzonych studzienkach. Do najważniejszych zalet czytników płytek w porównaniu z cytometrami należy niższy koszt, większa dostępność i zazwyczaj brak konieczności stosowania specjalistycznego oprogramowania do dalszych analiz danych. Głównymi wadami czytników płytek są stosunkowo niższa czułość w porównaniu z cytometrami oraz potencjalne problemy z gęstością optyczną mierzonych kultur. Do celów analiz porównawczych próbki z czytnika płytkowego muszą być znormalizowane dla każdej studzienki (np. do pomiaru gęstości hodowli, zwykle przyjmowanej jako absorbancja przy gęstości optycznej przy 750 nm [OD750]), co może prowadzić do niedokładności w przypadku próbek, które są zbyt gęste i/lub źle wymieszane (np. gdy są podatne na agregację lub flokulację).
Jako przegląd, tutaj szczegółowo pokazujemy zasady generowania części poziomu 0, a następnie hierarchicznego montażu za pomocą zestawu CyanoGate i klonowania do wektora odpowiedniego do transferu małżeńskiego. Następnie demonstrujemy proces transferu małżeńskiego, selekcję aksenowych szczepów transkoniugacyjnych wykazujących ekspresję markera fluorescencyjnego, a następnie pozyskiwanie danych fluorescencyjnych za pomocą cytometru przepływowego lub czytnika płytek.

<table><tbody><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolilo-&beta;-D-galaktopyranozyd (X-gal)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0404</td><td>Stosowany w 2.1.3.</td></tr><tr><td>Sól disodowa adenozyno-5&prime;-trifosforanu (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>Stosowana w tabeli 2.</td></tr><tr><td>Agar (testowany mikrobiologicznie)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-500g</td><td>Stosowany w 8.3.</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td>stosowany w 6.</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Attune NxT</td><td>Thermo Fisher stosowany naukowo</td><td></td> <td>w 4.3.1.</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>stosowana w Tabeli 2.</td></tr><tr><td>BpiI (BbsI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER1011</td><td>Używany w tabeli 2.</td></tr><tr><td>BsaI (Eco31I)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0291</td><td>Używany w Tabeli 2.</td></tr><tr><td>Karbenicylina disodowa</td><td>VWR International</td><td>A1491.0005</td><td>Stosowana w 2.1.3.</td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated 24-dołkowe płaskie płytki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>Stosowany w 4.1.3.</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>stosowany w 3.6.2.</td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit Zestaw</td> do ekstrakcji DNA <td>Qiagen</td><td>69104</td><td>. Używany w 5.</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td> <td>-</td> <td>używany w 4.2.2.</td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu. Użyte w kroku 2.3.2.</td></tr><tr><td>Koraliki szklane (średnica 0,5 mm)</td><td>Produkty BioSpec</td><td>11079105</td><td>stosowane w 5.2.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10021083</td><td>stosowany w 2.3.1, 3.6.2.</td></tr><tr><td>Izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10356553</td><td>stosowany w 2.1.3.</td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11815-024</td><td>Stosowany w 2.1.3.</td></tr><tr><td>Filtry membranowe (0,45 &mu; m)</td> <td>MF-Millipore</td><td>HAWP02500</td> stosowany w mikropłytkach <td>3.3.7</td></tr><tr><td>, 96-dołkowych, płaskodennych (studzienka kominowa) i mikro; CLEAR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655096</td><td>stosowany w 4.2.1.</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA Monarch</td><td>New England Biolabs</td><td>T1020S</td><td>używany w 1.1.2.2.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA Monarch PCR Zestaw</td> do oczyszczania DNA <td>New England Biolabs</td><td>T1030</td><td>. Używany w 1.1.2.3.</td></tr><tr><td>Inkubator Multitron Pro z diodami LED</td><td>Inkubator Infors</td> <td>HT-Shaking</td> <td>z białymi światłami LED. Używany w 4.1.4.</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA MyTaq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21108</td><td>stosowana w 7.1.</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>stosowany w 2.3.3.</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td>Stosowany w 2.1.1.</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy, roztwór soli fizjologicznej (PBS) (koncentrat 10X)</td><td>VWR International</td><td>K813</td><td>Stosowany w 4.3.2.</td></tr><tr><td>Q5Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td>zastosowana w 1.1.2.1.</td></tr><tr><td>Drabina DNA Quick-Load 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N0468S</td><td>użyta na rysunku 4.</td></tr><tr><td>Probówki z nakrętką (1,5 ml)</td><td>Starstedt</td><td>72.692.210</td><td>Stosowany w 3.6.3</td></tr><tr><td>Spektynomycyna dichlorowodorek pentahydratu</td><td>VWR International</td><td>J61820.06</td><td>Stosowany w 2.1.3.</td></tr><tr><td>Sterilin Clear Microtiter okrągłodenne 96-dołkowe płytki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>612U96</td><td>Stosowany w 4.3.1.</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>użyta w tabeli 2.</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Młynek do kulek. Używany w 5.2.</td></tr></tbody></table>

modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania cyanogate

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyjanobakterie to zróżnicowana grupa prokariotycznych organizmów fotosyntetyzujących, które mogą być genetycznie modyfikowane w celu odnawialnej produkcji użytecznych towarów przemysłowych. Ostatnie postępy w biologii syntetycznej doprowadziły do opracowania kilku zestawów narzędzi do klonowania, takich jak CyanoGate, ustandaryzowany modułowy system klonowania do budowy wektorów plazmidowych w celu późniejszej transformacji lub małżeńskiego transferu w sinice. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę składania wektora samoreplikującego się (np. przenoszenia kasety ekspresji markera fluorescencyjnego) i małżeńskiego transferu wektora do szczepów sinic Synechocystis sp. PCC 6803 lub Synechococcus elongatus UTEX 2973. Ponadto opisujemy, jak scharakteryzować działanie części genetycznej (np. promotora) za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Aby zademonstrować przebieg procesu składania metodą Golden Gate, w wektorze akceptującym poziomu 1 (Level 1), pozycja 1 (Forward) (pICH47732), złożono kasetę ekspresyjną zawierającą następujące części poziomu 0 (Level 0): promotor operonu C-fikocyjaniny Pcpc560 (pC0.005), sekwencję kodującą eYFP (pC0.008) oraz podwójny terminator TrrnB (pC0.082)12. Po transformacji mieszaniny reakcyjnej, pomyślnie złożone konstrukty zidentyf...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Sinice są ważną gromadą mikroorganizmów fotosyntetycznych, które są coraz częściej uznawane za użyteczne platformy dla zastosowań biologii syntetycznej i biotechnologii odnawialnej. Dlatego ważne jest opracowanie solidnych technik upraszczających projektowanie, klonowanie i wprowadzanie heterologicznego DNA do różnych gatunków sinic. Tak więc ta technika demonstruje dobrze znaną metodę zwaną koniugacją lub kojarzeniem trirodzicielskim w celu wprowadzenia DNA do gatunków sinic, które nie są naturalnie przekształcane.Koniugację z powodzeniem przeprowadzono w szerokiej gamie szczepów sinic, od jednokomórkowych do wielokomórkowych gatunków nitkowatych. Jeśli próbujesz tej techniki po raz pierwszy, pamiętaj, aby ostrożnie obchodzić się zarówno ze szczepami sinic, jak i E.coli. Na przykład nie wiruj powyżej wartości podanych w protokole i nie wiruj.Mieszanie bakterii i cyjanobakterii może wydawać się dziwne dla początkujących użytkowników. Mamy nadzieję, że pokazując proces koniugacji, pomożemy to wyjaśnić. Po zbudowaniu zespołów poziomu pierwszego należy wybrać odpowiedni wektor akceptora poziomu T.Wybierz odpowiednie ogniwo końcowe, aby podwiązać trzy główne końcówki końcowego zespołu poziomu pierwszego do szkieletu poziomu T. Aby zmontować jeden lub więcej zespołów poziomu pierwszego na poziomie T, należy przygotować mieszaninę reakcyjną z PBI1 i wymaganym wektorem łącznika końcowego. Zainstaluj program termocyklera i postępuj zgodnie z manuskryptem.Pierwszego dnia hoduj kulturę sinic, zakładając nową kulturę Synechocystis PCC 6803 lub Synechococcus elongatus UTEX 2973. Za pomocą sterylnej pętli termicznej zeskrobać komórki z płytki agarowej aksenu BG-11 i umieścić w 100-mililitrowej stożkowej kolbie wypełnionej 50 mililitrami świeżej pożywki BG-11 do zaszczepienia. Umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem z oświetleniem, aby wyhodować kultury komórkowe Synechocystis PCC 6803 w temperaturze 30 stopni Celsjusza przy 100 obr./min.W przypadku Synechococcus elongatus UTEX 2973 hodować kultury komórkowe w temperaturze 40 stopni Celsjusza przy 100 obr./min. Po jednym do dwóch dni narysuj jeden mililitr kultury komórkowej i zmierz na spektrofotometrze. Absorbancja przy OD 750 osiąga od 0,5 do 1,5.Drugiego dnia zaszczepić szczep pomocniczy MC1061 E.coli zawierający wektory PRK24 i PRL528 w pięciu mililitrach pożywki LB ampicyliną w stężeniu 100 mikrogramów na mililitr i chloramfenikolem w stężeniu 25 mikrogramów na mililitr. Rośnie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc z prędkością 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnie zaszczepić pięć mililitrów pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki kulturą E. coli przenoszącą wektor ładunku poziomu T.Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przy 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Trzeciego dnia należy odwirować przez noc kultury bakterii E. coli w roztworze pomocniczym i ładunku w temperaturze 3 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego.Umyj granulki, dodając pięć mililitrów świeżej pożywki LB bez antybiotyków. Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować w celu usunięcia supernatantu. Powtórz ten etap mycia trzy razy, aby usunąć resztki antybiotyków z nocnej hodowli.Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w połowie objętości pożywki LB w stosunku do początkowej objętości hodowli. Następnie połącz 450 mikrolitrów szczepu pomocniczego z 450 mikrolitrami szczepu ładunkowego w dwumililitrowej tubce i pozostaw w temperaturze pokojowej. Następnie należy przygotować kulturę sinic, odwirowując jeden mililitr kultury sinic w temperaturze 1 500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Umyć osad cztery razy, dodając świeże podłoże BG-11 o tej samej objętości początkowej. Dodaj 900 mikrolitrów przemytej kultury sinic do 900 mikrolitrów połączonych szczepów E. coli w dwumililitrowej probówce.Wymieszaj kultury, delikatnie pipetując w górę i w dół. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w przypadku Synechocystis PCC 6803 lub dwie godziny w przypadku Synechococcus elongatus UTEX 2973. Odwirować mieszaninę o stężeniu 1 500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Usunąć 1,6 mililitra supernatantu i ponownie zawiesić osad w pozostałym supernatantze. Umieść jeden filtr membranowy 0.45 mikrona na płytce agarowej LB BG-11 bez antybiotyków. Ostrożnie rozprowadzić 200 mikrolitrów mieszanki kultur E.coli/cyjanobakterii na membranie za pomocą sterylnego rozsiewacza lub sterylnej zagiętej końcówki.Uszczelnij płytkę folią parafinową i umieść płytkę w oświetlonym inkubatorze na 24 godziny. Po 24 godzinach ostrożnie przenieś membranę za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy na świeżą płytkę agarową BG-11 zawierającą odpowiednie antybiotyki, które należy wybrać dla wektora ładunku. Uszczelnij płytkę folią parafinową i inkubuj w tych samych warunkach, co poprzednio, aż pojawią się kolonie.Kolonie pojawiają się zwykle po 7-14 dniach w przypadku Synechocystis PCC 6803 i 3-7 dni w przypadku Synechococcus elongatus UTEX 2973. Aby wybrać koniuganty, za pomocą sterylnego termicznie pręta do zaszczepiania, wybierz co najmniej dwie pojedyncze kolonie z błony i rozprowadź smugi na nowej płytce agarowej BG-11 zawierającej odpowiednie antybiotyki. Następnie zaszczepić smugę kultury sinic w 15-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej pięć mililitrów pożywki LB i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przy 225 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.Klarowny posiew potwierdza brak zanieczyszczenia E. coli. Po wystarczającym okresie wzrostu wynoszącym siedem dni należy wybrać poszczególne kolonie akseniczne, aby utworzyć płynne kultury do długotrwałego przechowywania kriogenicznego lub późniejszych eksperymentów. W niniejszej pracy zademonstrowano przebieg montażu Golden Gate.Po przekształceniu reakcji składania zidentyfikowano udane zespoły za pomocą standardowych niebiesko-białych badań przesiewowych kolonii E. coli. Kaseta wyrażeń eYFP w wektorze pierwszego poziomu i ogniwo końcowe jednego wektora zostały następnie połączone w wektor akceptorowy poziomu T, aby uzyskać wektor cpcBA-eYFP. Złożony wektor cpcBA-eYFP został zweryfikowany przez trawienie restrykcyjne.Pomyślne małżeńskie przeniesienie cpcBA-eYFP lub wektora pPMQAK1-T spowodowało wzrost na błonie nawet kilkuset kolonii dla Synechocystis PCC 6803 i Synechococcus elongatus UTEX 2973. Zgodnie z oczekiwaniami dla silnego promotora Pcpc560, wartości znormalizowanej fluorescencji eYFP z czytnika płytek i fluorescencji eYFP na komórkę z cytometru przepływowego były wysokie w porównaniu z kontrolą ujemną. Zarówno w przypadku czytnika płytek, jak i cytometru przepływowego wartości fluorescencji były wyższe w Synechococcus elongatus UTEX 2973 niż w Synechocystis PCC 6803.Upewnij się, że inkubujesz przez minimalny czas, w zależności od szczepu, który koniugujesz.

genetic-modification-cyanobacteria-conjugation-using-cyanogate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Lea-Smith, D. J., et al. Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic. J. Vis. Exp. (2016)Film przedstawia metodę generowania mutantów znakowanych antybiotykami w sinicach. Protokół rozpoczyna się od hodowli sinic, po której następują etapy wirowania i mycia, które zachowują pilusy powierzchniowe. Następnie wprowadza się plazmid niosący gen oporności na antybiotyki otoczony sekwencjami homologicznymi. Podczas inkubacji plazmid jest internalizowany...

Wytwarzanie mutantów znakowanych antybiotykami w sinicach poprzez rekombinację homologiczną

Wprowadzanie wielu zmian genomowych do cyjanobakterii jest niezbędnym narzędziem w rozwoju szczepów do celów przemysłowych i badań podstawowych. Opisano system generowania nieoznaczonych mutantów w modelowym gatunku sinic Synechocystis sp. PCC6803 oraz znakowanych mutantów w Synechococcus sp. PCC7002.

Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Phormidium lacuna to nitkowata cyjanobakteria, która została wyizolowana z morskich basenów skalnych. W artykule opisano izolację włókien ze źródeł naturalnych, ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie genomu, naturalną transformację, ekspresję sfGFP, kriokonserwację i metody ruchliwości.

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Poznaj modyfikację genetyczną cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu zestawu CyanoGate. Ta metoda umożliwia wprowadzanie DNA do gatunków nienadających się do naturalnej transformacji.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Przeglądaj więcej filmów