Name: Wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16S rRNA Hybrydyzacja in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę wykrywania bakterii w tkankach pęcherza moczowego za pomocą hybrydyzacji in situ 16S rRNA i mikroskopii konfokalnej. Ta technika pozwala na bezstronne identyfikowanie bakterii bez wcześniejszej znajomości gatunku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Kim Orth i Marceli de Souza Santos za porady dotyczące protokołu oraz Amandzie Arute za wsparcie techniczne. Praca ta była częściowo wspierana przez Katedrę Biologii Systemowej Cecila H. i Idy Green prowadzoną przez K.P.

Protokół badania został zatwierdzony i przestrzegał wytycznych Instytucjonalnych Komitetów Bezpieczeństwa Biologicznego i Bezpieczeństwa Chemicznego UT Dallas i UT Southwestern Medical Center. Zastosowanie biopsji od ludzi w tym protokole zostało zatwierdzone i było zgodne z wytycznymi Instytucjonalnych Komisji Rewizyjnych UT Dallas i UT Southwestern Medical Center. Wszystkie osoby zaangażowane w pobieranie i przetwarzanie biopsji przechodzą aktualne szkolenie w zakresie ochrony osób (HSP) i HIPPA.
1. Przygotowanie tkanek do utrwalania i zatapiania parafiny
UWAGA: Biopsje zostały pobrane od kobiet, które wyraziły na to zgodę, przechodząc cystoskopię z elektro-fulguracją zapalenia włośnicy w celu zaawansowanego leczenia nawracających infekcji dróg moczowych (rUTI). rUTI definiuje się jako 3 ZUM w okresie 12 miesięcy. Pobranie biopsji przeprowadzono na sali operacyjnej, gdy pacjent był pod narkozą po uzyskaniu świadomej zgody pacjenta zgodnie z protokołem UTSW IRB STU 082010-016. Wszystkie próbki zostały zakodowane i pozbawione elementów pozwalających na identyfikację przed eksperymentami.
<ol>
	<li>Pobrać biopsję z zimnego kubka (~1 mm3) z pęcherza moczowego za pomocą kleszczy urologicznych za pomocą elastycznego cystoskopu i natychmiast umieścić w sterylnym kriowisie o pojemności 2 ml zawierającym 1,5 ml paraformaldehydu (PFA) o stężeniu 4% v/v (PFA) przygotowanym w 1x sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). 
	UWAGA: 4% PFA w 1x PBS można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebne.</li>
	<li>Utrwalić biopsję przez 6 godzin w temperaturze pokojowej lub przez 16-24 godziny w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Czas utrwalenia należy obliczyć na podstawie wielkości próbki tkanki i należy unikać nadmiernego utrwalenia. Nie zaleca się stosowania aldehydu glutarowego jako utrwalacza, ponieważ wprowadza on autofluorescencję.</li>
	<li>W wysterylizowanym kapturze lub komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń utrwalacz przez pipetowanie i zastąp 1,5 ml sterylnego 1x PBS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc lub natychmiast przeprowadzić obróbkę tkanek i zatapianie parafiny19.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanego mikrotomu należy pokroić bloki tkanek o grubości 5 μm i przykleić skrawki tkanki parafinowej do naładowanych szkiełek mikroskopowych. W przypadku protokołu 16S rRNA FISH wymagane będą co najmniej dwa preparaty na biopsję. 
	nuta: Tkanka biopsyjna powinna być ułożona w przekroju poprzecznym względem płaszczyzny cięcia, aby zapewnić wizualizację warstw urotelialnych we wszystkich sekcjach. Należy również zauważyć, że grubość przekroju powinna być zoptymalizowana pod kątem wykrywania społeczności bakteryjnych. W przypadku zakażeń, w których bakterie rezydujące w tkankach są bardzo rzadkie (np. <1 bakterii rezydujących w tkance na 1000 komórek ssaków, może być wymagane wykonanie cieńszych skrawków lub pobranie próbek z wielu odcinków seryjnych).</li>
</ol>
2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ za pomocą uniwersalnych sond 16S rRNA
UWAGA: Wymagane są dwa preparaty na biopsję. Jedna szkiełko jest potrzebne do uniwersalnej sondy 16S rRNA i jedno szkiełko do sondy kontrolnej z sekwencją zaszyfrowaną. Jest to ważne dla odróżnienia sygnału rzeczywistego od sygnału tła podczas mikroskopii, ponieważ nabłonek pęcherza moczowego jest autofluorescencyjny w wielu kanałach. Oprócz sondy szyfrującej, zablokowanie 0,1% Sudan Black B przed zamontowaniem może zmniejszyć autofluorescencję tła nieodłącznie związaną z klasą tissue<sup="xref">20.
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników i dygestorium
	<ol>
		<li>Wyczyść pusty wyciąg (lub odpowiednio zamontowaną komorę bezpieczeństwa biologicznego) 70% etanolem.</li>
		<li>Przygotować bufor hybrydyzacyjny składający się z 0,9 M chlorku sodu (NaCl), 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w 10 ml sterylnie przefiltrowanej wody. 
		nuta: Sterylnie przefiltrowaną wodę można przygotować, przepuszczając autoklawowaną wodę destylowaną przez filtr 0,22 μM. Bufor hybrydyzacyjny może być przechowywany w temperaturze pokojowej, ale SDS może wytrącać się z roztworu. Jeśli SDS wytrąci się, przed użyciem podgrzej roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.</li>
		<li>Przygotuj co najmniej 100 ml 95% i 90% etanolu w sterylnie przefiltrowanej wodzie w umytych, autoklawowanych butelkach.</li>
		<li>Rozpuścić znakowane fluorescencyjnie liofilizowane sondy w 10 mM buforze (pH 8,0) Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przygotowanym w sterylizowanej przez filtr wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 100 μM. Przygotować rozcieńczenie 1 μM w buforze TE do użycia w tym protokole. Przechowuj zarówno skoncentrowane sondy 100 μM, jak i 1 μM przygotowane sondy w temperaturze -20 °C, chronione przed światłem. 
		nuta: Nie rozpuszczaj sond znakowanych fluorescencyjnie w wodzie. Buforowanie jest wymagane, aby zapobiec hydrolizie wiązania estrowego NHS sprzężonego fluoroforu z sondą nukleotydową.</li>
		<li>Umyj pięć słoików Coplin 70% etanolem, pozostaw do wyschnięcia, oznacz w następujący sposób: ksyleny I, ksyleny II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O i napełnij 100 ml odpowiedniego roztworu. Pomoże to uniknąć nieporozumień w późniejszych krokach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Depatynizacja i rehydratacja tkanek
	<ol>
		<li>W kapturze umieść dwa szkiełka na biopsję w pionowym stojaku na szkiełka.</li>
		<li>Umieść pionowy stojak na suwaki w słoiku z ksylenami I Coplin (zawierającym 100 ml ksylenów) na 10 minut.</li>
		<li>Wyjmij stojak na suwaki z ksylenów I i osusz spód na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar ksylenów. Włożyć do słoika xylenes II Coplin na 10 min. 
		nuta: Nigdy nie pracuj z ksylenami poza certyfikowanym wyciągiem.</li>
		<li>Ponownie uwodnić odparafinowane skrawki tkanek w kolejnych płukaniach etanolem (95% i 90%) przez 10 minut każde w odpowiednio oznaczonych słoikach z kopliny. 
		nuta: Na tym etapie ogrzej bufor hybrydyzacyjny do temperatury 50-56 °C w łaźni wodnej</li>
		<li>Wyjmij ruszt szkiełkowy z mycia 90% etanolem, osusz spód na ręcznikach papierowych, aby usunąć nadmiar etanolu i umieść w słoiku ddH2O Coplin zawierającym 100 ml wysterylizowanego przez filtr ddH2O na 10 minut.</li>
		<li>Czekając na przemycie ddH2O, rozcieńczyć sondy do 10 nM w buforze hybrydyzacyjnym, aby utworzyć roztwór barwiący. Przygotować 150 μl roztworu barwiącego na szkiełko. 
		nuta: Chroń roztwór barwiący przed światłem, owijając probówki folią aluminiową i przechowując w szufladzie. Podczas pracy z sondami oznaczonymi fluorescencyjnie na blacie stołu, rozważ wyłączenie świateł górnych, jeśli to możliwe. Sondy rozcieńczone w buforze hybrydyzacyjnym nie powinny być ponownie używane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja i barwienie przeciwstawne
	<ol>
		<li>Przygotuj komorę nawilżającą dla każdej sondy, umieszczając namoczoną, pogniecioną Kimwipe i sterylną wodę w zbiorniku pudełka na końcówki P1000. Umieść wkład z uchwytem końcówki na górze - w tym miejscu będą znajdować się szkiełka. 
		nuta: Ważne jest, aby użyć komory nawilżającej, aby zapobiec wysychaniu skrawków biopsji podczas hybrydyzacji. Należy zauważyć, że dostępne na rynku komory nawilżacza są zaprojektowane tak, aby utrzymywać stabilną, wilgotną atmosferę. Jednak opisana tutaj technika w wystarczającym stopniu kontroluje wilgotność przy znacznie niższych kosztach.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka ze stojaka na slajdy i połóż na świeżym ręczniku papierowym (chusteczką do góry). Użyj Kimwiste, aby wysuszyć szkiełko. Uważaj, aby delikatnie przetrzeć w pobliżu (nie na) sekcji biopsji, aby odprowadzić wodę. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obwódkę wokół sekcji biopsji i umieść szkiełko stroną z tkanką do góry w komorze nawilżającej. 
		nuta: Pracuj szybko, aby tkanki nie wyschły przed hybrydyzacją.</li>
		<li>Umieścić komorę nawilżania w inkubatorze ustawionym na 50 °C. Odpipetować 50-150 μl roztworu barwiącego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby prostokąt utworzony przez hydrofobową obwódkę wokół tkanki został wypełniony. Uważaj, aby nie dodać zbyt dużo roztworu, aby nie przelać hydrofobowej granicy. Delikatnie zamknij pudełko.</li>
		<li>Inkubować przez noc (~16 h) w temperaturze 50 °C w ciemności. Jeśli inkubator ma okno, przykryj je folią aluminiową, aby stworzyć ciemne otoczenie. 
		nuta: Temperatura hybrydyzacji niższa od temperatury topnienia sondy FISH jest wymagana dla niezawodnego sygnału. 50 °C to optymalna temperatura dla uniwersalnej sondy 16S rRNA, ale może nie być optymalna dla innych sond.</li>
		<li>Następnego ranka przygotuj co najmniej 500 ml buforu do płukania składającego się z 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) w ddH2O i przefiltruj do sterylnej butelki z próżniowym filtrem górnym. Podgrzać do 50-56 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka z komór nawilżających i ostrożnie usuń pozostały roztwór hybrydyzacyjny za pomocą Kimwipe. Umieść szkiełka w pionowym stojaku do barwienia.</li>
		<li>Umieść ruszt do barwienia w nieprzezroczystym słoiku Coplin zawierającym 100 ml wstępnie podgrzanego buforu do mycia na 10 minut. Jeśli słoiki Coplin nie są nieprzezroczyste (np. szkło), umieść je w ciemności podczas etapów inkubacji - być może pod pudełkiem lub w szufladzie.</li>
		<li>Powtórz krok mycia dwukrotnie ze świeżym buforem do mycia w nowych słoikach Coplin.</li>
		<li>Na etapach płukania należy przygotować barwnik przeciwbarwny, rozcieńczając roztwór podstawowy Hoechst 33342 1:1 000 w roztworze do płukania. Do tej samej probówki dodaj aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa-555 (WGA) do końcowego stężenia 5 μg/ml i Alexa-555 falloidynę do końcowego stężenia 33 nM. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy do użycia. 
		nuta: Hoechst, Alexa-555 WGA i Alexa-555 Phalloidin oznaczają odpowiednio DNA, mucynę/uroplakiny i aktynę i mogą być przechowywane przez długi czas w ciemności zgodnie z instrukcjami producenta. Etykiety fluorescencyjne stosowane do sond i przeciwbarwień można dostosować do zestawów filtrów dostępnych dla mikroskopu, który ma być używany.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka z ostatniego prania i delikatnie odchodź nadmiar bufora do mycia za pomocą Kimwipe. Umieść szkiełka chusteczką do góry na ręczniku papierowym i dodaj 50-150 μl barwnika przeciwdziałającego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby hydrofobowa granica była wypełniona, ale nie przelewała się. Przykryj do czterech szkiełek pokrywką cryoboxu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść boki z powrotem w stojaku do barwienia i umyj jeszcze dwukrotnie w słoikach Coplin ze świeżym buforem do mycia, przez 10 minut każdy.</li>
		<li>Po ostatnim praniu dokładnie osusz szkiełka i połóż chusteczkę do góry na ręczniku papierowym pod pokrywą krioboxu. Wyciśnij jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na chusteczkę. Delikatnie umieść na wierzchu szkiełko nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze (zależy to od wielkości biopsji). Delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki, ponieważ będą one zakłócać obrazowanie, i pozwól szkiełkom z okładką utwardzić się przez noc w ciemności.</li>
		<li>Następnego dnia uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego do szkiełka cienką warstwą bezbarwnego lakieru do paznokci. Pozostawić do wyschnięcia na 10 minut w ciemności, a następnie przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do mikroskopii konfokalnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wizualizacja 16S rRNA FISH za pomocą mikroskopii konfokalnej
UWAGA: Dla tego protokołu, najlepsze wyniki osiąga się za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywami 63x i 100x. Wymagane są odpowiednie zestawy filtrów do wizualizacji fluorescencji Hoechst, Alexa-488 i Alexa-555. Jednak standardowa mikroskopia fluorescencyjna może być użyta, jeśli mikroskop konfokalny jest niedostępny. Ten protokół dotyczy laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny i oprogramowanie komputerowe powiązane z mikroskopem zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Załaduj szkiełko i wizualizuj za pomocą obiektywu 10x w kanale niebieskim (DAPI/Hoechst). Ustaw ostrość ostrożnie, aż jądra będą widoczne.</li>
	<li>Po ustawieniu ostrości zmień obiektyw na duże powiększenie (63x lub 100x). Dodać olej na wierzch szkiełka nakrywkowego. Ponownie ustaw ostrość za pomocą nowego obiektywu, upewniając się, że soczewka obiektywu ma kontakt z olejem podczas ustawiania ostrości. 
	nuta: Używaj tylko precyzyjnego ustawiania ostrości przy dużym powiększeniu (63x lub 100x). Olej powinien być używany tylko do obiektywu olejowego.</li>
	<li>Szybko oceń każdy slajd przez okular w zielonym kanale (eGFP/Alexa-488), aby określić, które slajdy są FISH dodatnie, a które FISH ujemne. 
	nuta: Najlepiej jest, jeśli ta wstępna ocena/punktacja jest wykonywana w ciemno przez oddzielną osobę, aby zmniejszyć błąd systematyczny.</li>
	<li>Aby zobrazować barwione biopsje, zacznij od dodatniego slajdu FISH i przejdź do trybu wizualizacji komputerowej. Wybierz kanały 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Ustaw otwór otworkowy przy użyciu kanału o najdłuższej długości fali, w tym przypadku 555. Znajdź właściwą płaszczyznę ogniskową do wizualizacji oznakowanych bakterii w kanale 488. Nie zmieniając płaszczyzny ogniskowej, ustaw wzmocnienie, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału tak, aby sygnał nie był nasycony, a tło nie było nadmiernie korygowane. Uzyskaj obraz we wszystkich trzech kanałach. 
	nuta: Użyj tych samych ustawień dla kanału 488, aby wyświetlić obraz każdego slajdu w eksperymencie. Moc lasera może wymagać regulacji w kanałach 405 i 555, jeśli optymalna płaszczyzna ogniskowej do wizualizacji bakterii zmienia się między polami.</li>
	<li>Powtarzaj na dodatkowych polach, aż uzyskasz obrazy całej powierzchni nabłonka. 
	nuta: Być może będziesz musiał nieznacznie zmienić płaszczyznę ogniskowej, aby uwidocznić znakowane bakterie w różnych polach, ale nigdy nie zmieniaj wzmocnienia, mocy lasera ani przesunięcia dla kanału 488 między polami. W przypadku pracy na mikroskopie konfokalnym przydatne może być uchwycenie stosu Z, aby można było przeanalizować trójwymiarową lokalizację bakterii w tkance.</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy i określaj ilościowo znakowane bakterie w tkance lub z nią związane za pomocą ImageJ lub podobnego oprogramowania. Zalecane jest minimalne przetwarzanie obrazów (np. dzielenie/łączenie kanałów i konwertowanie na pliki obrazów), chociaż w razie potrzeby można wykonać korekcję tła. Wszystkie poprawki lub inne zmiany powinny pozostać spójne między obrazami.</li>
</ol>

<ol><li>Abraham, S. N., Miao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+immune+responses+to+urinary+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The nature of immune responses to urinary tract infections.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).</li>
<li>Wolfe, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+uncultivated+bacteria+in+the+adult+female+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).</li>
<li>Grist, M., Chakraborty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mucin+layer+in+the+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Identification of a mucin layer in the urinary bladder.</a> Urology. 44 (1), 26-33 (1994).</li>
<li>Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uroplakins+in+urothelial+biology%2C+function%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Uroplakins in urothelial biology, function, and disease.</a> Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).</li>
<li>Ingersoll, M. A., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+infection+to+immunotherapy%3A+host+immune+responses+to+bacteria+at+the+bladder+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa.</a> Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).</li>
<li>Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infections%3A+epidemiology%2C+mechanisms+of+infection+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).</li>
<li>Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+Host+Cells+and+Tissues+by+Uropathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria.</a> Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).</li>
<li>Horsley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+faecalis+subverts+and+invades+the+host+urothelium+in+patients+with+chronic+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection.</a> PLoS One. 8 (12), (2013).</li>
<li>Rosen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+an+intracellular+bacterial+community+pathway+in+Klebsiella+pneumoniae+urinary+tract+infection+and+the+effects+of+FimK+on+type+1+pilus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression.</a> Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).</li>
<li>Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+human+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection.</a> PLoS Med. 4 (12), e329(2007).</li>
<li>Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+efficacy+of+fulguration+of+trigonitis+for+recurrent+urinary+tract+infections+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Urological+Science%22%5BJournal%5D)">Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women.</a> Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).</li>
<li>De Nisco, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Detection+of+Tissue-Resident+Bacteria+and+Chronic+Inflammation+in+the+Bladder+Wall+of+Postmenopausal+Women+with+Recurrent+Urinary+Tract+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection.</a> Journal of Molecular Biology. , (2019).</li>
<li>Amann, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+16S+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+with+flow+cytometry+for+analyzing+mixed+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).</li>
<li>Vaishnava, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+lectin+RegIIIgamma+promotes+the+spatial+segregation+of+microbiota+and+host+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine.</a> Science. 334 (6053), 255-258 (2011).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+uropathogenic+Escherichia+coli+persistence+and+eradication+from+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).</li>
<li>Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+yeast+by+fluorescence+in+situ+hybridisation+from+broth+and+blood+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures.</a> Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li>
<li>Ludwig, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARB%3A+a+software+environment+for+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ARB: a software environment for sequence data.</a> Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).</li>
<li>Jaziri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhylOPDb%3A+a+16S+rRNA+oligonucleotide+probe+database+for+prokaryotic+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Database+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification.</a> Database (Oxford). , (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach ludzkiego pęcherza moczowego za pomocą 16S rRNA FlSH. Protokół ten można łatwo dostosować do biopsji pobranych z innych tkanek, takich jak przewód pokarmowy lub skóra, i można go rozszerzyć na tkanki pobrane z różnych organizmów modelowych ssaków. Opisany tutaj protokół może być również dostosowany do stosowania technik wielokrotnego utrwalania (np. formalina, etanol, metakarna) i przygotowania tkanek (np. zatopionych w parafinie lub żywicy oraz tkanek kriokonserwowanych). Podwójnie znakowana uniwersalna sonda 16S rRNA pozwala na bezstronne wykrywanie wszystkich gatunków bakterii obecnych w tkance i może dostarczyć cennych informacji na temat tego, w jaki sposób patogeny i mikrobiota oddziałują przestrzennie z powierzchniami błony śluzowej w stanie choroby i zdrowia. Korzystając z zasobów takich jak probeBase, PhylOPDb lub narzędzie PROBE_DESIGN pakietu oprogramowania ARB do wyboru lub projektowania sond 16S lub 23S rRNA specyficznych dla gatunków lub rodzajów, protokół ten można dostosować do wykrywania określonych gatunków lub rodzajów bakterii w tkance 15,21,22. Ważnym kierunkiem rozwoju tej metody jest multipleksowanie przy użyciu sond specyficznych dla gatunku lub rodzaju, znakowanych różnymi, dyskretnymi fluoroforami w celu oceny różnorodności mikrobiologicznej w błonie śluzowej pęcherza moczowego.
Podstawowym ograniczeniem tej metody do stosowania na próbkach ludzkich jest dostępność tkanki poddanej biopsji. Do uzyskania biopsji wymagana jest zgoda Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej i świadoma zgoda pacjenta, a bezpośrednia współpraca z klinicystą wykonującym zabieg jest niezbędna do optymalnego pobrania próbki i dostępu do metadanych pacjenta. Sam zabieg CEFT niszczy nabłonek pęcherza moczowego, więc byliśmy w stanie uzasadnić biopsję tych obszarów przed zabiegiem. Do tego protokołu wymagany jest wyciąg wyciągowy lub odpowiednio wyposażona komora bezpieczeństwa biologicznego ze względu na zastosowanie toksycznych ksylenów na etapie deparafinowania i konieczność utrzymania sterylnego środowiska przez cały czas trwania procedury. Do tego protokołu wymagany jest mikroskop fluorescencyjny, najlepiej konfokalny, z obiektywem 63x lub 100x i odpowiednimi zestawami filtrów do wizualizacji Hoechst, Alexa-555 i Alexa-488. Reprezentatywne wyniki przedstawione na rysunku 1 zostały zobrazowane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Podobne laserowe mikroskopy skaningowe powinny dawać porównywalne obrazy. Protokół ten jest ograniczony ze względu na jego zdolność do wykrywania tylko bakterii związanych z tkankami, a nie na przykład grzybów. Do identyfikacji patogenów grzybiczych w tkance 18 należy użyć sond specyficznych dla rRNA grzyba18S lub 28S.
Kluczowe kroki tego protokołu obejmują utrzymanie sterylnego środowiska przez cały czas trwania procedury i zapewnienie, że tkanka nie wysycha między etapami hybrydyzacji i barwienia. Jeśli tkanka wyschnie podczas zabiegu, sygnał może zostać stłumiony lub tkanka może spaść z szkiełka podczas etapu mycia. Bardzo ważne jest również, aby zawsze używać dwóch sekcji szeregowych dla tego protokołu - jednej dla sondy 16S rRNA i jednej dla sondy szyfrującej. Bez tej kontroli odróżnienie wyników fałszywie dodatnich może być bardzo trudne, a uzyskane dane mogą nie być przydatne lub pouczające. Jeżeli protokół ten jest dostosowywany do użytku z sondą inną niż uniwersalna sonda 16S rRNA, należy zwrócić uwagę na wybór odpowiedniej temperatury hybrydyzacji, o około 5 °C niższej niż przewidywana temperatura topnienia sondy. Aby utrzymać intensywność sygnału, tkanka nie może być wystawiona na działanie światła przez długi czas po dodaniu sondy i nie może być prześwietlona podczas mikroskopii. Wreszcie, podczas mikroskopii te same ustawienia dla kanału odpowiadającego fluoroforowi sprzężonemu z sondą FISH muszą być spójne między szkiełkami eksperymentalnymi (sonda 16S rRNA) i kontrolnymi (sonda mieszająca). Wizualizacja relacji przestrzennych bakterii na powierzchniach błony śluzowej tkanek pobranych od pacjenta ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia i zbudowania klinicznie istotnych hipotez na temat interakcji gospodarz-patogen leżących u podstaw choroby zakaźnej.

Drogi moczowe, składające się z cewki moczowej, pęcherza moczowego, moczowodów i nerek, są stale narażone na działanie bakterii tworzących mikrobiom układu moczowego, jak również atakujących uropatogenów, takich jak uropatogenny E. coli (UPEC), z przewodu pokarmowego1,2. Warstwa uwodnionego śluzu składająca się z glikozaminoglikanów i nieprzepuszczalna blaszka glikozylowanych białek uroplakiny wyrażonych na powierzchni komórek powierzchownych tworzy barierę, która rutynowo chroni nabłonek pęcherza moczowego przed inwazją przylegających bakterii3,4. Podczas infekcji dróg moczowych (ZUM) bariery te są naruszane lub niszczone, co ułatwia przyczepianie się do nabłonka pęcherza moczowego i inwazję na niego przez bakterie uropatogenne5,6. Prace na modelach mysich ujawniły, że wiele bakterii uropatogennych, w tym UPEC, Klebsiella pneumoniae i Enterococcus faecalis, może tworzyć replikacyjne społeczności wewnątrzkomórkowe (IBC) w cytoplazmie komórek powierzchownych i spoczynkowych rezerwuarach wewnątrzkomórkowych (QIR) w przejściowych komórkach nabłonkowych7,8,9. Chociaż UPEC został zidentyfikowany w zrzuconych komórkach nabłonka od pacjentów z ZUM, interakcja uropatogenów z błoną śluzową pęcherza moczowego u ludzi nie była wcześniej wizualizowana10.
Dostosowaliśmy powszechną technikę, fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), do wykrywania bakterii w błonie śluzowej biopsji pęcherza moczowego uzyskanych od pacjentek po menopauzie poddawanych cystoskopii z elektrofulguracją zapalenia włośnicy (CEFT) do zaawansowanego leczenia nawracających infekcji moczowych opornych na antybiotyki11. Używając uniwersalnej sondy do 16S rRNA, byliśmy w stanie obiektywnie wykryć gatunki bakterii związane z błoną śluzową pęcherza moczowego u pacjentów z nawracającymi ZUM i określić ich położenie w ścianie pęcherza moczowego12. Uniwersalna sonda nukleotydowa 16S rRNA została wcześniej zaprojektowana do celowania w konserwatywny region bakteryjnego 16S rRNA13, który odpowiada pozycjom 388-355 rRNA E. coli 16s. Sekwencje 16S rRNA i sondy mieszającej zostały wcześniej zatwierdzone i opublikowane do użytku w przewodzie pokarmowym myszy 14,15. Sekwencje i właściwości sond opisano w tabeli 1. Niezbędne jest użycie dwóch sekwencyjnych sekcji w tym protokole, jednej dla sondy 16S rRNA i jednej dla sondy mieszającej, aby móc odróżnić sygnał prawdziwy od tła, ponieważ nabłonek pęcherza moczowego, kolagen i elastyna wykazują autofluorescencję16. W tym protokole 16S rRNA i sondy szyfrujące zostały zaprojektowane z fluorescencyjnymi znacznikami Alexa Fluor 488 zarówno na końcach 3', jak i 5' za pośrednictwem wiązań estrowych N-hydroksysukcynimidu (NHS) w celu zwiększenia sygnału fluorescencyjnego.
Chociaż ten protokół został opracowany do stosowania na biopsjach ludzkiego pęcherza moczowego, może być łatwo zaadaptowany do użycia na skrawkach zatopionych w parafinie z dowolnej tkanki, w której przypuszcza się, że znajdują się bakterie. W przeciwieństwie do eksperymentów immunohistochemicznych, które są ukierunkowane na określone antygeny (np. lipopolisacharyd) na powierzchni bakterii, ta metoda nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat antygenów wyrażanych przez bakterie związane z tkanką10,17. Zastosowanie uniwersalnej sondy 16S rRNA pozwala na bezstronne wykrycie wszystkich gatunków bakterii w próbce, ale nie pozwala na określenie ich tożsamości. Aby określić identyfikację wykrytych bakterii, należy użyć sond 16S lub 23S rRNA specyficznych dla gatunku lub rodzaju. Protokół ten nie wykryje również patogenów grzybiczych, takich jak Candida albicans, związanych z tkanką gospodarza. Do wykrywania patogenów grzybiczych należy użyć sond 28S lub 18S rRNA18.

<table><tbody><tr><td>Alexa-555 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A34055</td><td>Aktyna barwiąca</td></tr><tr><td>Alexa-555 Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA)</td><td>Invitrogen</td><td>W32464</td><td>Barwienie Mucyny</td></tr><tr><td>Filtry górne do butelek</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07</td><td>Sterylizacja</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Simport</td><td>M900-12W</td><td>Deparafinizacja/mycie</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-224</td><td>Rehydratacja</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodzian</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>TE</td></tr><tr><td>Matowe szkiełka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodny</td><td>Invitrogen</td><td>H21492</td><td>Barwienie Nucleus</td></tr><tr><td>Marker hydrofobowy</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Bariera hydrofobowa</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>Olejek Immersol 518 F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr> Mikroskop <tr><td>Paraformaldehyd (16%)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>TJ274997 Fixation</td></tr><tr><td>ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td>Pożywka montażowa</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td>Bufor hybrydyzacyjny/PBS</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>Bufor hybrydyzacyjny</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy Hepahydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu Monobasic Monohydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>VWR</td><td>75486-756</td><td>Sterylizacja</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>TE/Bufor hybrydyzacyjny</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td>Deparafinizacja</td></tr><tr><td>0,22 i mu; m filtr strzykawkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-29</td><td>Sterylizacja</td></tr></tbody></table>

wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16s rrna hybrydyzacja in situ

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Wizualizacja interakcji bakterii z powierzchniami i tkankami błony śluzowej gospodarza może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów patogenezy. Podczas gdy wizualizacja patogenów bakteryjnych w zwierzęcych modelach infekcji może opierać się na szczepach bakteryjnych zaprojektowanych do ekspresji białek fluorescencyjnych, takich jak GFP, wizualizacja bakterii w błonie śluzowej biopsji lub tkanki uzyskanej od pacjentów wymaga bezstronnej metody. W tym miejscu opisujemy skuteczną metodę wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach u ludzi. Metoda ta wykorzystuje fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) z fluorescencyjnie znakowaną uniwersalną sondą oligonukleotydową dla 16S rRNA do znakowania bakterii związanych z tkankami w skrawkach biopsji pęcherza moczowego pobranych od pacjentów cierpiących na nawracające infekcje dróg moczowych. Dzięki zastosowaniu uniwersalnej sondy 16S rRNA bakterie mogą być wykrywane bez wcześniejszej wiedzy na temat gatunków, rodzajów lub cech biochemicznych, takich jak lipopolisacharyd (LPS), które byłyby wymagane do wykrycia przez eksperymenty immunofluorescencyjne. Opisujemy kompletny protokół dla 16S rRNA FISH od fiksacji biopsji do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być dostosowany do stosowania w prawie każdym typie tkanki i stanowi potężne narzędzie do bezstronnej wizualizacji klinicznie istotnych interakcji bakteria-gospodarz w tkance pacjenta. Ponadto, korzystając z sond specyficznych dla gatunku lub rodzaju, protokół ten można dostosować do wykrywania określonych patogenów bakteryjnych w tkance pacjenta.

Protokół został zoptymalizowany pod kątem bezstronnej detekcji bakterii związanych z błoną śluzową pęcherza w sekcjach biopsji pęcherza zatopionych w parafinie. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne mikrografie konfokalne z eksperymentu z wykorzystaniem tego protokołu na sekcjach biopsji pęcherza pobranych od kobiet z nawracającymi infekcjami dróg moczowych. Dwa następujące po sobie przekroje zhybrydyzowano z uniwersalnymi sondami 16S rRNA (panele górne) lub sondami kontrolnymi scramble (panele dolne). Wykonano obrazy z tego samego regionu tkanki; bakterie (kolor zielony) są wyraźnie widoczne w tkance zhybrydyzowanej z sondami 16S rRNA, a nie z sondą scramble. Rysunek 2 przedstawia wynik fałszywie dodatni. Sygnał odpowiadający autofluorescencji kolagenu lub elastyny jest wykrywany w kanałach 405 i 488 zarówno w sekcjach biopsji zhybrydyzowanych z sondą 16S rRNA, jak i z sondą scramble, co podkreśla znaczenie zawsze stosowania kontroli za pomocą sondy scramble.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sonda</td>
			<td>Sekwencja</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Sąsiedztwo genowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uniwersalne 16S rRNA </td>
			<td>5'-GCTGCCTCCC 
			GTAGGAGT-3'</td>
			<td>54.9</td>
			<td>Alexa-488 (5' i 3')</td>
			<td>Ester NHS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanie</td>
			<td>5'-ACTCCTACGG 
			GAGGCAGC-3'</td>
			<td>NA</td>
			<td>Alexa-488 (5' i 3')</td>
			<td>ester NHS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje i charakterystyka sond FISH. Tm oznacza temperaturę topnienia, a NHS jest skrótem od N-hydroksysuccinimidu.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna ukazująca barwienie aktyny, mucyny i Hoechsta oraz analizę 16S rRNA, wyniki nałożone." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne mikrofotografie konfokalne FISH uniwersalnego 16S rRNA i sondy kontrolnej (scramble) w biopsji pęcherza moczowego człowieka. Aktyna i mucyna są znakowane kolorem czerwonym, jądra komórkowe kolorem niebieskim, a bakterie kolorem zielonym. Bakterie związane z tkanką są wykrywane wyłącznie za pomocą sondy 16S rRNA, a nie sondy kontrolnej. Obrazy wykonano przy powiększeniu 63x. Pasek skali = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna aktyny, mucyn i 16S rRNA z barwieniem Hoeschtem, pokazująca lokalizację bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60458/60458fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne mikrografie konfokalne wykazujące fałszywie dodatnią zieloną autofluorescencję w biopsji pęcherza moczowego człowieka. Aktyna i mucyny są znakowane kolorem czerwonym, jądra komórkowe kolorem niebieskim, natomiast bakterie oraz autofluorescencyjne komponenty macierzy pozakomórkowej (np. kolagen i elastyna) kolorem zielonym. Zielona fluorescencja jest obserwowana zarówno przy użyciu sond 16S rRNA, jak i sond kontrolnych (scramble), co wskazuje na wynik fałszywie dodatni. Obrazy wykonano przy powiększeniu 63x. Pasek skali = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60458/60458fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół służy do bezstronnego wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach pacjentów za pomocą hybrydyzacji in situ 16S rRNA i mikroskopii konfokalnej.

Wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16S rRNA Hybrydyzacja in situ

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

W tym miejscu przedstawiamy solidny protokół wykrywania bakterii w biopsyjnej tkance pęcherza moczowego, który ma szerokie zastosowanie do wielu typów tkanek, w których podejrzewa się obecność bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bezstronna. Pozwala badaczowi wykryć bakterie w tkance bez wiedzy a priori, które gatunki bakterii są obecne.Technika ta może pomóc w ustaleniu, czy bakterie zaatakowały ściany pęcherza moczowego u kobiet z nawracającymi infekcjami dróg moczowych i informować o wyborach terapeutycznych, takich jak wybór antybiotyków przenikających do tkanek. Chociaż technika ta została zaprojektowana dla tkanek pęcherza moczowego, może być szeroko stosowana do innych tkanek z rezydentnymi populacjami bakterii przy minimalnej optymalizacji. Osoby, które są nowicjuszami w tej technice, mogą mieć problemy z zakładaniem szkiełek nakrywkowych i obrazowaniem.Skoncentruj się na optymalizacji umieszczania szkiełek nakrywkowych w celu zmniejszenia pęcherzyków i ćwicz obrazowanie na próbkach nieszlachetnych. W zademonstrowaniu tej procedury pomoże Jashkaran Gadhvi, doktorant w moim laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść pusty wyciąg lub odpowiednio wyposażoną komorę bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem.Przygotuj wszystkie niezbędne i odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wyczyść pięć słoików Coplin 70% etanolem i pozostaw słoiki do wyschnięcia. Gdy słoiki wyschną, oznacz je tak, jak pokazano tutaj i napełnij je 100 mililitrami odpowiedniego roztworu.W dygestorii umieścić dwa szkiełka na biopsję w pionowym stojaku na szkiełka. Umieść pionowy stojak na suwaki w słoiku Xylenes 1 Coplin na 10 minut. Następnie wyjmij stojak na suwaki ze słoika i osusz spód ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar ksylenów.Umieść stojak w słoiku Xylenes 2 na 10 minut. A następnie ponownie nawodnić odparafinowane skrawki tkanek w kolejnych płukaniach etanolem przez 10 minut każde. Po zakończeniu prania osusz spód stojaka na suwaki ręcznikami papierowymi, aby usunąć nadmiar etanolu i umieść ruszt w słoiku Coplin zawierającym 100 mililitrów wysterylizowanej filtrem, podwójnie destylowanej wody na 10 minut.Podczas tego płukania rozcieńczyć sondy do 10 nanomoli w buforze hybrydyzacyjnym, aby utworzyć roztwór barwiący, upewniając się, że przygotowałeś 150 mikrolitrów roztworu barwiącego na szkiełko. Przygotuj komorę nawilżającą dla każdej sondy, dodając namoczoną, pogniecioną delikatną chusteczkę roboczą i sterylną wodę do zbiornika pudełka na końcówki P1000. Umieść wkład z uchwytem końcówki na górze, ponieważ w tym miejscu będą znajdować się szkiełka.Po zakończeniu końcowego prania wyjmij szkiełko z rusztu na suwaki i połóż je na świeżym ręczniku papierowym chusteczką do góry. Użyj delikatnej chusteczki do wysuszenia szkiełka, uważając, aby delikatnie przetrzeć tylko w pobliżu, ale nie w sekcję biopsji, aby odprowadzić wodę. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obwódkę wokół sekcji biopsji i umieść szkiełko chusteczką do góry w komorze nawilżającej.Następnie umieść komorę nawilżającą w inkubatorze ustawionym na 50 stopni Celsjusza. Odpipetować od 50 do 150 mikrolitrów roztworu barwiącego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby prostokąt utworzony przez hydrofobową obwódkę wokół tkanki został wypełniony i delikatnie zamknąć pudełko. Inkubować przez noc w temperaturze 50 stopni Celsjusza w ciemności.Jeśli inkubator ma okno, przykryj je folią aluminiową, aby stworzyć ciemne otoczenie. Następnego ranka wyjmij szkiełka z komór nawilżających i szybko usuń pozostały roztwór hybrydyzacyjny za pomocą delikatnej ściereczki roboczej. Następnie umieść boki w pionowym stojaku do barwienia.Umieść stojak do barwienia w owiniętym folią aluminiową słoiku Coplin zawierającym 100 mililitrów wstępnie podgrzanego buforu do mycia na 10 minut. Powtórz ten krok mycia jeszcze dwa razy ze świeżym buforem do mycia w nowych słoikach Coplin. Podczas tych etapów płukania należy przygotować przeciwplamę, rozcieńczając roztwór podstawowy Hoechst 33342 w buforze do płukania, w stosunku jeden do 1000.Do tej samej probówki dodaj aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa-555 do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr i Alexa-555 falloidynę do końcowego stężenia 33 nanomolowców. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy do użycia. Po zakończeniu końcowego prania wyjmij szkiełka ze słoika Coplin i delikatnie usuń nadmiar buforu do mycia delikatną ściereczką zadaniową.Umieść szkiełka chusteczką do góry na ręczniku papierowym i dodaj od 50 do 150 mikrolitrów barwnika przeciwdziałającego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby hydrofobowa granica została wypełniona, ale nie przepełniona. Przykryj do czterech szkiełek pokrywką cryobox-top i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umieść szkiełka z powrotem w stojaku do barwienia i umyj je jeszcze dwukrotnie w słoikach Coplin zawierających świeży bufor do mycia, przy czym każde mycie trwa 10 minut.Następnie dokładnie osusz szkiełka i połóż je chusteczką do góry na ręczniku papierowym pod pokrywą krioboxa. Wyciśnij jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na chusteczkę i delikatnie umieść na niej szkiełko nakrywkowe o odpowiedniej wielkości. Delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki i pozwól szkiełkom nakrywkowym utwardzić się przez noc w ciemności.Następnego dnia uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych do szkiełka cienką warstwą przezroczystego lakieru do paznokci i pozostaw do wyschnięcia w ciemności na 10 minut, a następnie przechowuj je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do zobrazowania barwionych biopsji, włącz mikroskop konfokalny i oprogramowanie powiązane z mikroskopem. Zacznij od pozytywowego slajdu FISH i przejdź do trybu wizualizacji komputerowej.Wybierz kanały dla 405, 488 i 555. Ustaw otwór przy użyciu najdłuższego kanału o długości fali, którym w tym przypadku jest 555. Następnie znajdź aktualną płaszczyznę ogniskową do wizualizacji oznakowanych bakterii w kanale 488.Nie zmieniając płaszczyzny ogniskowej, ustaw wzmocnienie, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału tak, aby sygnał nie był nasycony, a tło nie było nadmiernie korygowane. Uzyskaj obraz we wszystkich trzech kanałach. W tym badaniu bakterie związane z tkankami są wykrywane w biopsjach ludzkiego pęcherza moczowego przez 16S rRNA FISH.Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem bezstronnego wykrywania bakterii związanych z błoną śluzową pęcherza moczowego w biopsjach pęcherza moczowego zatopionych w parafinie. Pokazano reprezentatywne mikrofotografie konfokalne z eksperymentu z wykorzystaniem tego protokołu na wycinkach biopsji pęcherza moczowego uzyskanych od kobiet z nawracającymi infekcjami dróg moczowych. Dwie sekcje szeregowe są hybrydyzowane z uniwersalnymi sondami 16S rRNA lub sondami szyfrującymi.Obrazy wykonane z tego samego obszaru tkanki i bakterii są wyraźnie widoczne w tkance zhybrydyzowanej z sondami 16S rRNA, ale nie są wykonane z sondą mieszającą. Możliwe są również wyniki fałszywie dodatnie. W tym reprezentatywnym fałszywie dodatnim wyniku sygnał odpowiadający autofluorescencyjnemu kolagenowi lub elastynie jest wykrywany w kanałach 405 i 488 zarówno w sekcjach biopsji hybrydowej 16S rRNA, jak i sondy mieszającej, co podkreśla znaczenie zawsze używania kontroli sondy szyfrującej.Aby zapobiec fotowybielaniu, zminimalizuj ekspozycję tkanek na światło po zastosowaniu sond. Chociaż technika ta pozwala na bezstronne wykrywanie bakterii w tkankach ludzkich, nie dostarcza informacji specyficznych dla gatunku. Multiplex-FISH z sondami specyficznymi dla taksonomii może być wykorzystany do identyfikacji obecnego rodzaju lub gatunku.Zanim opracowano tę technikę, nie wykazano wcześniej, że bakterie mogą zaatakować ścianę pęcherza moczowego u pacjentów z nawracającymi ZUM. Obecnie używamy sond specyficznych dla rodzaju i gatunku, aby określić, jakie gatunki bakterii są obecne. Ksyleny powinny być stosowane w dygestoriach ze względu na ich toksyczność.Należy uważać, aby podczas obrazowania nie patrzeć bezpośrednio w laser. Laser powinien być wyłączony podczas ustawiania szkiełka pod obiektywem.

detection-tissue-resident-bacteria-bladder-biopsies-16s-rrna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Źródło: Ng, K. M., Tropini, C. Wizualizacja interakcji mikrobioty jelitowej z gospodarzem za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ , barwienia lektynowego oraz obrazowania. J. Vis. Exp. (2021).Ten film demonstruje procedurę hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH) w celu barwienia mikrobioty jelitowej w tkance jelitowej myszy poprzez hybrydyzację fluorescencyjnych sond do bakteryjnego rRNA (rybosomalnego kwasu rybonukleinowego) oraz przeciwbarwienie struktur gospodarza do analizy...

Fluorescencja in situ Hybrydyzacja bakterii jelitowych w przekrojach jelit myszy

Źródło: Conover, M. S. i in., Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje wykrywanie wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBC) w tkance pęcherza myszy zakażonej Escherichia coli ekspresującą β-galaktozydazę. Po utrwaleniu tkanek, permeabilizacji i barwieniu X-gal, IBC pojawiają się jako niebieskie punkty pod mikroskopem rozcinającym, co potwierdza inwazję bakterii podczas infekcji dróg moczowych.

Wizualizacja społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych w zakażonym pęcherzu myszy

Ten film pokazuje wizualizację bakterii w odparafinowanej tkance pęcherza moczowego od pacjenta zakażonego drogami moczowymi. Znakowana fluorescencyjnie sonda zhybrydyzowana z bakteryjnymi 16-sowymi rybosomalnymi RNA ujawnia bakterie związane z tkankami i ich rozmieszczenie, dostarczając cennych informacji przestrzennych na temat ich gęstości w próbce.

Wizualizacja bakterii w skrawkach biopsji pęcherza moczowego za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Tutaj opisano metodę lokalizacji bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą znakowanych DIG sond DNA 16S ukierunkowanych na rRNA. Protokół ten można zastosować do badania roli bakterii w różnych chorobach, takich jak zapalenie przyzębia, nowotwory i zapalne choroby immunologiczne.

In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Ten manuskrypt opisuje dopęcherzowe podawanie bakterii uropatogennych za pomocą operonu luksa w celu wywołania infekcji dróg moczowych u myszy i późniejszą podłużną analizę in vivo obciążenia bakteryjnego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

Ten uproszczony protokół szczegółowo opisuje proces wykrywania i obrazowania bakterii w złożonych próbkach tkanek, od utrwalania tkanki po barwienie mikrobów za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja interakcji mikrobiota jelitowa z gospodarzem poprzez fluorescencyjną hybrydyzację in situ, barwienie lektyną i obrazowanie

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę wykrywania bakterii w tkankach pęcherza moczowego za pomocą hybrydyzacji in situ 16S rRNA i mikroskopii konfokalnej. Ta technika pozwala na bezstronne identyfikowanie bakterii bez wcześniejszej znajomości gatunku.

Wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16S rRNA Hybrydyzacja in situ (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16S rRNA Hybrydyzacja in situ

Przeglądaj więcej filmów