Wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach pęcherza moczowego za pomocą fluorescencji 16S rRNA Hybrydyzacja in situ
18 października 2019
Ten protokół służy do bezstronnego wykrywania bakterii związanych z tkankami w biopsjach pacjentów za pomocą hybrydyzacji in situ 16S rRNA i mikroskopii konfokalnej.
W tym miejscu przedstawiamy solidny protokół wykrywania bakterii w biopsyjnej tkance pęcherza moczowego, który ma szerokie zastosowanie do wielu typów tkanek, w których podejrzewa się obecność bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bezstronna. Pozwala badaczowi wykryć bakterie w tkance bez wiedzy a priori, które gatunki bakterii są obecne.
Technika ta może pomóc w ustaleniu, czy bakterie zaatakowały ściany pęcherza moczowego u kobiet z nawracającymi infekcjami dróg moczowych i informować o wyborach terapeutycznych, takich jak wybór antybiotyków przenikających do tkanek. Chociaż technika ta została zaprojektowana dla tkanek pęcherza moczowego, może być szeroko stosowana do innych tkanek z rezydentnymi populacjami bakterii przy minimalnej optymalizacji. Osoby, które są nowicjuszami w tej technice, mogą mieć problemy z zakładaniem szkiełek nakrywkowych i obrazowaniem.
Skoncentruj się na optymalizacji umieszczania szkiełek nakrywkowych w celu zmniejszenia pęcherzyków i ćwicz obrazowanie na próbkach nieszlachetnych. W zademonstrowaniu tej procedury pomoże Jashkaran Gadhvi, doktorant w moim laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść pusty wyciąg lub odpowiednio wyposażoną komorę bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem.
Przygotuj wszystkie niezbędne i odczynniki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wyczyść pięć słoików Coplin 70% etanolem i pozostaw słoiki do wyschnięcia. Gdy słoiki wyschną, oznacz je tak, jak pokazano tutaj i napełnij je 100 mililitrami odpowiedniego roztworu.
W dygestorii umieścić dwa szkiełka na biopsję w pionowym stojaku na szkiełka. Umieść pionowy stojak na suwaki w słoiku Xylenes 1 Coplin na 10 minut. Następnie wyjmij stojak na suwaki ze słoika i osusz spód ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar ksylenów.
Umieść stojak w słoiku Xylenes 2 na 10 minut. A następnie ponownie nawodnić odparafinowane skrawki tkanek w kolejnych płukaniach etanolem przez 10 minut każde. Po zakończeniu prania osusz spód stojaka na suwaki ręcznikami papierowymi, aby usunąć nadmiar etanolu i umieść ruszt w słoiku Coplin zawierającym 100 mililitrów wysterylizowanej filtrem, podwójnie destylowanej wody na 10 minut.
Podczas tego płukania rozcieńczyć sondy do 10 nanomoli w buforze hybrydyzacyjnym, aby utworzyć roztwór barwiący, upewniając się, że przygotowałeś 150 mikrolitrów roztworu barwiącego na szkiełko. Przygotuj komorę nawilżającą dla każdej sondy, dodając namoczoną, pogniecioną delikatną chusteczkę roboczą i sterylną wodę do zbiornika pudełka na końcówki P1000. Umieść wkład z uchwytem końcówki na górze, ponieważ w tym miejscu będą znajdować się szkiełka.
Po zakończeniu końcowego prania wyjmij szkiełko z rusztu na suwaki i połóż je na świeżym ręczniku papierowym chusteczką do góry. Użyj delikatnej chusteczki do wysuszenia szkiełka, uważając, aby delikatnie przetrzeć tylko w pobliżu, ale nie w sekcję biopsji, aby odprowadzić wodę. Za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj obwódkę wokół sekcji biopsji i umieść szkiełko chusteczką do góry w komorze nawilżającej.
Następnie umieść komorę nawilżającą w inkubatorze ustawionym na 50 stopni Celsjusza. Odpipetować od 50 do 150 mikrolitrów roztworu barwiącego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby prostokąt utworzony przez hydrofobową obwódkę wokół tkanki został wypełniony i delikatnie zamknąć pudełko. Inkubować przez noc w temperaturze 50 stopni Celsjusza w ciemności.
Jeśli inkubator ma okno, przykryj je folią aluminiową, aby stworzyć ciemne otoczenie. Następnego ranka wyjmij szkiełka z komór nawilżających i szybko usuń pozostały roztwór hybrydyzacyjny za pomocą delikatnej ściereczki roboczej. Następnie umieść boki w pionowym stojaku do barwienia.
Umieść stojak do barwienia w owiniętym folią aluminiową słoiku Coplin zawierającym 100 mililitrów wstępnie podgrzanego buforu do mycia na 10 minut. Powtórz ten krok mycia jeszcze dwa razy ze świeżym buforem do mycia w nowych słoikach Coplin. Podczas tych etapów płukania należy przygotować przeciwplamę, rozcieńczając roztwór podstawowy Hoechst 33342 w buforze do płukania, w stosunku jeden do 1000.
Do tej samej probówki dodaj aglutyninę z kiełków pszenicy Alexa-555 do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr i Alexa-555 falloidynę do końcowego stężenia 33 nanomolowców. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy do użycia. Po zakończeniu końcowego prania wyjmij szkiełka ze słoika Coplin i delikatnie usuń nadmiar buforu do mycia delikatną ściereczką zadaniową.
Umieść szkiełka chusteczką do góry na ręczniku papierowym i dodaj od 50 do 150 mikrolitrów barwnika przeciwdziałającego bezpośrednio na chusteczkę, tak aby hydrofobowa granica została wypełniona, ale nie przepełniona. Przykryj do czterech szkiełek pokrywką cryobox-top i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umieść szkiełka z powrotem w stojaku do barwienia i umyj je jeszcze dwukrotnie w słoikach Coplin zawierających świeży bufor do mycia, przy czym każde mycie trwa 10 minut.
Następnie dokładnie osusz szkiełka i połóż je chusteczką do góry na ręczniku papierowym pod pokrywą krioboxa. Wyciśnij jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na chusteczkę i delikatnie umieść na niej szkiełko nakrywkowe o odpowiedniej wielkości. Delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki i pozwól szkiełkom nakrywkowym utwardzić się przez noc w ciemności.
Następnego dnia uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych do szkiełka cienką warstwą przezroczystego lakieru do paznokci i pozostaw do wyschnięcia w ciemności na 10 minut, a następnie przechowuj je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do zobrazowania barwionych biopsji, włącz mikroskop konfokalny i oprogramowanie powiązane z mikroskopem. Zacznij od pozytywowego slajdu FISH i przejdź do trybu wizualizacji komputerowej.
Wybierz kanały dla 405, 488 i 555. Ustaw otwór przy użyciu najdłuższego kanału o długości fali, którym w tym przypadku jest 555. Następnie znajdź aktualną płaszczyznę ogniskową do wizualizacji oznakowanych bakterii w kanale 488.
Nie zmieniając płaszczyzny ogniskowej, ustaw wzmocnienie, moc lasera i przesunięcie dla każdego kanału tak, aby sygnał nie był nasycony, a tło nie było nadmiernie korygowane. Uzyskaj obraz we wszystkich trzech kanałach. W tym badaniu bakterie związane z tkankami są wykrywane w biopsjach ludzkiego pęcherza moczowego przez 16S rRNA FISH.
Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem bezstronnego wykrywania bakterii związanych z błoną śluzową pęcherza moczowego w biopsjach pęcherza moczowego zatopionych w parafinie. Pokazano reprezentatywne mikrofotografie konfokalne z eksperymentu z wykorzystaniem tego protokołu na wycinkach biopsji pęcherza moczowego uzyskanych od kobiet z nawracającymi infekcjami dróg moczowych. Dwie sekcje szeregowe są hybrydyzowane z uniwersalnymi sondami 16S rRNA lub sondami szyfrującymi.
Obrazy wykonane z tego samego obszaru tkanki i bakterii są wyraźnie widoczne w tkance zhybrydyzowanej z sondami 16S rRNA, ale nie są wykonane z sondą mieszającą. Możliwe są również wyniki fałszywie dodatnie. W tym reprezentatywnym fałszywie dodatnim wyniku sygnał odpowiadający autofluorescencyjnemu kolagenowi lub elastynie jest wykrywany w kanałach 405 i 488 zarówno w sekcjach biopsji hybrydowej 16S rRNA, jak i sondy mieszającej, co podkreśla znaczenie zawsze używania kontroli sondy szyfrującej.
Aby zapobiec fotowybielaniu, zminimalizuj ekspozycję tkanek na światło po zastosowaniu sond. Chociaż technika ta pozwala na bezstronne wykrywanie bakterii w tkankach ludzkich, nie dostarcza informacji specyficznych dla gatunku. Multiplex-FISH z sondami specyficznymi dla taksonomii może być wykorzystany do identyfikacji obecnego rodzaju lub gatunku.
Zanim opracowano tę technikę, nie wykazano wcześniej, że bakterie mogą zaatakować ścianę pęcherza moczowego u pacjentów z nawracającymi ZUM. Obecnie używamy sond specyficznych dla rodzaju i gatunku, aby określić, jakie gatunki bakterii są obecne. Ksyleny powinny być stosowane w dygestoriach ze względu na ich toksyczność.
Należy uważać, aby podczas obrazowania nie patrzeć bezpośrednio w laser. Laser powinien być wyłączony podczas ustawiania szkiełka pod obiektywem.
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje bezstronną metodę wykrywania bakterii w biopsjach tkanki pęcherza moczowego, z potencjalnym zastosowaniem w różnych tkankach z podejrzeniem obecności bakterii. Technika ta wykorzystuje hybrydyzację in situ 16S rRNA oraz mikroskopię konfokalną, mając na celu lepsze zrozumienie roli bakterii w nawracających zakażeniach dróg moczowych oraz pomoc w wyborze odpowiedniej antybiotykoterapii.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Wykrywanie drobnoustrojów w tkankach ludzkich
- Zastosowania w zakażeniach układu moczowego
- Bezstronne metodologie w mikrobiologii
Wstęp
- Znaczenie zrozumienia infiltracji bakteryjnej w tkankach pęcherza moczowego
- Wyzwania związane z tradycyjnymi metodami wykrywania bakterii
- Konieczność optymalizacji technik obrazowania w badaniach tkankowych
Zastosowane metody
- hybrydyzacja in situ 16S rRNA
- tkanka pęcherza moczowego jako system modelowy
- mikroskopia konfokalna do obrazowania
Główne wyniki
- Pomyślnie przeprowadzono detekcję bakterii w biopsjach ludzkiego pęcherza moczowego
- Protokół zwalidowany pod kątem bezstronnej detekcji bakterii
- Implikacje dla zrozumienia nawracających zakażeń dróg moczowych
Wnioski
- Niniejsze badanie pogłębia wiedzę na temat bakterii związanych z tkankami w próbkach z pęcherza moczowego
- Wyniki mają znaczenie dla mikrobiologii klinicznej oraz strategii terapeutycznych
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezstronne wykrywanie bakterii rezydujących w tkankach w biopsjach ludzkich umożliwia mechanistyczną weryfikację hipotez dotyczących interakcji gospodarz-patogen w nawracających zakażeniach dróg moczowych. Podejście to wspiera walidację celów poprzez potwierdzenie lokalizacji bakterii w tkankach śluzowych bez polegania na szczepach modyfikowanych genetycznie lub odczynnikach specyficznych dla danego gatunku. Metoda ta zapewnia pewność predykcyjną dla późniejszego screeningu terapeutycznego poprzez identyfikację klinicznie istotnych interfejsów bakteria-gospodarz w próbkach pochodzących od pacjentów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących inwazji bakterii w błonę śluzową pęcherza moczowego w nawracających ZUM.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią wizualizację bakterii w skrawkach tkanek ludzkich.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez potwierdzenie biologicznie istotnych interakcji bakteria-gospodarz przed identyfikacją związku wiodącego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do przesiewowej analizy związków przeciwdrobnoustrojowych poprzez potwierdzenie obecności bakterii w tkance.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje detekcję za pomocą uniwersalnej metody FISH ukierunkowanej na 16S rRNA, co umożliwia uzyskanie powtarzalnych wyników ilościowych w różnych typach tkanek.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy do przesiewowej analizy antybiotyków przenikających do tkanek w przedklinicznych modelach infekcji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie lokalizacji bakterii w biopsjach pęcherza pobranych od pacjentów.
- Korelacja z biomarkerami: Wspiera identyfikację sygnałów bakteryjnych związanych z tkanką jako potencjalnych biomarkerów translacyjnych utrzymującej się infekcji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji dla decyzji typu go/no-go poprzez walidację założeń mechanistycznych dotyczących inwazji tkankowej bakterii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – zapewniając detekcję bakterii z rozdzielczością przestrzenną w tkankach ludzkich.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wizualizację bakterii w tkankach śluzowych bez uprzedniej wiedzy o gatunkach.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów do oceny środków przeciwdrobnoustrojowych dzięki standaryzowanej i bezstronnej detekcji bakterii w przekrojach biopsyjnych.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki przestrzenne za pomocą mikroskopii konfokalnej, co pozwala na porównanie ładunku bakteryjnego i lokalizacji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez walidację obecności bakterii w tkance ludzkiej, co pozwala ocenić trafność modelu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi powtarzalną metodę badania udziału bakterii w różnych kontekstach tkankowych poza pęcherzem moczowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad interakcjami gospodarz-patogen dzięki bezpośredniej wizualizacji tkanek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez uniwersalne FISH oparte na sondach oraz kontrolowane procesy hybrydyzacji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesną redukcję ryzyka związanego z celami terapeutycznymi dzięki potwierdzeniu infiltracji bakteryjnej tkanek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane oddziaływanie z tkankami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ oraz obrazowania mikroskopem konfokalnym.
- Zależne od dostępnego instrumentarium, w tym inkubatorów do hybrydyzacji, mikroskopów konfokalnych oraz odpowiednich zestawów filtrów.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania sond, protokołów płukania i procedur kontrastowania pomiędzy zespołami.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji do różnych typów tkanek, w tym optymalizacji czasu permeabilizacji i hybrydyzacji.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potencjalna autofluorescencja składników tkankowych, co wymaga zastosowania kontroli w postaci sond typu scramble w celu potwierdzenia swoistości.
