Name: Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Poznaj test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy z nieaktywowanym uprzednio plwocinowym materiałem biologicznym. Ta metoda umożliwia bezpieczne i skuteczne monitorowanie odpowiedzi na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było możliwe dzięki finansowaniu z grantu Europejskiego i Krajów Rozwijających się na rzecz Partnerstwa na rzecz Badań Klinicznych (EDCTP) – Panafrykańskiego Programu Ekspansji Biomarkerów (PanBIOME) SP.2011.41304.008. Wsparcie uzyskano również w postaci grantu badawczego University of St Andrews School of Medicine. Publikacja tego manuskryptu i protokołu TB-MBLA jako zasobu wizualnego była możliwa dzięki dofinansowaniu ze Szkockiej Rady Finansowania i Funduszu Badań nad Globalnymi Wyzwaniami dla Uniwersytetu St Andrews. Podziękowania dla Szpitala Położniczego w Maputo i Centrum Zdrowia Mavalane, które dostarczyły kliniczne próbki plwociny, oraz zespołu Oddziału Leczenia Gruźlicy w Maputo, który pomógł w eksperymentach inaktywacji termicznej klinicznych próbek plwociny.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>kultura
	<ol>
		<li>Pracując na czystym stole lub kabinie klasy 1, zbierz 1 ml porcji kultury Bacillus Calmette-Guérin (BCG) fazy wykładniczej do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Szczelnie zamknij rurki. 
		nuta: Do przetworzenia całej próbki o pojemności 5 ml potrzebnych jest pięć probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Szafa bezpieczeństwa biologicznego jest wymagana podczas pracy z każdą kulturą gruźlicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbka plwociny pacjenta
	<ol>
		<li>Pracując w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i nosząc maskę nosową, ostrożnie otwórz kubek na próbkę, odpipetuj 1 ml porcji do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i szczelnie zamknij probówki. 
		nuta: Do pipetowania plwociny zalecana jest końcówka z szerokimi ustami. Za pomocą nożyczek odetnij cienką część ust końcówki o pojemności 1 ml, aby uzyskać szersze usta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inaktywacja ciepła
<ol>
	<li>Przed przygotowaniem próbki należy ustawić łaźnię wodną na temperaturę 95 °C. 
	nuta: Temperatura 95 °C zwiększa szansę na zmniejszenie aktywności RNazy, a tym samym zachowanie większej ilości RNA dla dalszej TB-MBLA.</li>
	<li>Przenieść probówki z próbkami do stojaka zanurzonego w łaźni wodnej. Upewnij się, że trzy czwarte każdej probówki z próbką jest zanurzone w wodzie.</li>
	<li>Gotować w temperaturze 95 °C przez 20 minut, a następnie przenieść probówki na stół do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed rozpoczęciem ekstrakcji RNA. 
	nuta: Całkowitą inaktywację termiczną prątków M. tuberculosis i BCG zweryfikowano poprzez inkubację próbek inaktywowanych termicznie i próbek kontrolnych w temperaturze 37 °C przez 42 dni w celu sprawdzenia wzrostu. Pomiar gęstości optycznej przy długości fali 600 nm (OD600) wykonywano na początku badania, a następnie co tydzień przez 42-dniowy okres inkubacji.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja RNA
UWAGA: Opisany tutaj proces ekstrakcji RNA dotyczy zestawu RNA wymienionego w Tabeli Materiałów. Można stosować inne odpowiednie zestawy do ekstrakcji RNA różnych producentów.
<ol>
	<li>Dodawanie do kontroli ekstrakcji (EC)
	<ol>
		<li>Przenieść 1 ml podwielokrotności próbek inaktywowanych termicznie do probówek o pojemności 1,5 ml. Wlej 100 μl EC do każdej próbki, zamknij probówkę i wymieszaj, odwracając probówkę do góry nogami 3x, 
		nuta: EC jest dostarczany z zestawem TB-MBLA vital bacteria kit (tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sedymentacja komórek
	<ol>
		<li>Za pomocą mikrowirówki stołowej odwirować probówki o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować supernatant, pozostawiając 50 μl osadu.</li>
		<li>Zawiesić osad w 950 μl buforu do lizy, pipetując w górę iw dół, a następnie przenieść całą zawiesinę do probówki z matrycą lizującą dostarczonej z zestawem do ekstrakcji RNA (tabela materiałów). Upewnij się, że probówki są szczelnie zamknięte i oznacz zarówno pokrywkę, jak i bok tuby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu lizy komórek przenieść probówki z kroku 3.2.2 do homogenizatora. Homogenizować próbki przez 40 s przy 6 000 obr./min.</li>
	<li>Oczyszczanie kwasów nukleinowych
	<ol>
		<li>Odwirować lizat z kroku 3.3 przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj świeże probówki o pojemności 1 ml i dodaj 300 μl chloroformu do każdej probówki.</li>
		<li>Za pomocą końcówki o pojemności 1 ml ostrożnie odpipetować supernatant bez dotykania matrycy lizy.</li>
		<li>Przenieść supernatant do probówek zawierających chloroform i wirować przez 5 s. Pozostaw probówkę do osiadania na 5 minut lub dłużej, aż trzy fazy (górna, środkowa i dolna) będą wyraźnie widoczne.</li>
		<li>Wirować przy 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować górną fazę i przenieść do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Do probówek w kroku 3.4.5 dodać 500 μl lodowatego 100% etanolu, zamknąć probówki i wymieszać, delikatnie odwracając do góry nogami 3x. Inkubować probówki w temperaturze -80 °C przez 15 minut lub -20 °C przez 30 minut i kontynuować ekstrakcję lub pozostawić w temperaturze -20 °C na noc, aby zakończyć ekstrakcję następnego dnia.</li>
		<li>Ustawić mikrowirówkę na 4 °C i pozostawić do schłodzenia do co najmniej 12 °C przed rozpoczęciem wirowania. Załaduj probówki do mikrowirówki i wiruj przez 20 minut przy 13 000 x g. Odrzuć supernatant, zastąp 70% lodowatym etanolem i odwiruj przez kolejne 10 minut przy 13 000 x g. 
		nuta: 70% etanol powinien być wytwarzany z wody wolnej od nukleaz molekularnych.</li>
		<li>Odrzucić cały supernatant z kroku 3.4.7 i przenieść probówki do inkubatora ustawionego na 50 °C. Inkubować przez 20 minut w celu wysuszenia osadu RNA/DNA. Utrzymuj rurki częściowo otwarte, aby umożliwić odparowanie całego etanolu.</li>
		<li>Do suchego osadu dodać 100 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wiruj przez 3 sekundy, aby wymieszać zawartość. 
		nuta: Na tym etapie ekstrakt może być przechowywany 2-3 dni w lodówce lub dłużej w temperaturze -80 °C, aż do wykonania sekcji 3.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie DNA 
	UWAGA: Ten krok jest kluczowy, ponieważ obecność DNA w ekstrakcie unieważnia wynik MBLA. Ta sekcja jest oparta na zestawie do usuwania DNA (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę enzymu buforu DNazy I 10x i enzymu DNazy I dla liczby próbek (10 μl buforu i 1 μl DNazy na próbkę) plus 10% ekstra w celu pokrycia wszelkich strat spowodowanych pipetowaniem. Wymieszać przez wirowanie, a następnie pipetować 11 μl do każdej probówki zawierającej ekstrakt RNA.</li>
		<li>Mieszaj przez wirowanie przez 3 s, a następnie krótko wiruj (10 s przy 13 000 x g), aby usunąć wszelkie kropelki ze ścianek. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w gorącym bloku lub inkubatorze. Dodać dodatkowy 1 μl enzymu DNazy I bezpośrednio do każdej probówki, dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozmrozić odczynnik do inaktywacji DNazy 10 minut przed zakończeniem inkubacji DNazy. Wirować 20 s, aby zapewnić jednorodną, mleczną zawiesinę, a następnie dodać 10 μl odczynnika inaktywacji DNazy do każdego ekstraktu RNA z kroku 3.5.2.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować 3x podczas 5-minutowego etapu inkubacji.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 13 000 x g przez 2 minuty. Ostrożnie przenieść supernatant do 1,5 ml probówki wolnej od RNazy, nie dotykając żadnej z matryc inaktywacyjnej.</li>
		<li>Przechowuj ekstrakt RNA w lodówce, jeśli uruchamiany jest RT-qPCR tego samego dnia lub w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Odwrotna transkryptaza qPCR
<ol>
	<li>W przypadku nieznanych próbek należy rozcieńczyć wszystkie ekstrakty RNA, które mają być użyte, w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od RNazy. Dobrze wymieszaj, wirując przez 5 s i krótko odwiruj, aby usunąć wszelkie kropelki lub pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>W przypadku próbek wzorcowych dla krzywej wzorcowej należy pobrać wzorce Mtb i EC RNA z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Wykonać siedmio- i sześciokrotne 10-krotne rozcieńczenia odpowiednio próbek wzorcowych Mtb i EC. Wymień końcówki przed przeniesieniem mieszaniny z jednej probówki do drugiej. 
	nuta: Standardowe próbki są dostarczane z zestawem TB-MBLA.</li>
	<li>Przygotowanie mieszanki wzorcowej 
	UWAGA: Mieszanka główna (MM) to roztwór odczynników PCR wystarczający do amplifikacji wszystkich próbek, wzorców i wody w celu kontroli bez matrycy (NTC). Woda używana jako NTC powinna być tą samą wodą, która jest używana do ekstrakcji i przygotowania MM. Upewnij się, że wzorce, każda próbka RNA i jej rozcieńczenie dziesiętne są amplifikowane 2x dla reakcji odwrotnej transkryptazy dodatniej (RT+) i 1x dla reakcji odwrotnej transkryptazy ujemnej (RT-). Reakcja RT- jest kontrolą mającą na celu określenie skuteczności usuwania DNA (tab. 1).
	<ol>
		<li>Przenieść 16 μl MM do każdej probówki reakcyjnej PCR.</li>
		<li>Dodać 4 μl ekstraktu RNA do każdej probówki reakcyjnej RT+ i RT-, a wodę do probówek reakcyjnych NTC.</li>
		<li>Załaduj probówki reakcyjne do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i ustaw warunki PCR w następujący sposób: 50 °C przez 30 minut, 95 °C przez 15 minut, 40 razy cykle w 94 °C przez 45 s i 60 °C przez 1 minutę z akwizycją za pomocą fluoroforów, które absorbują się w kanałach zielonym i żółtym. 
		nuta: Zielony kanał to fluorofor detekcji Mtb, a żółty to fluorofor detekcji kontroli ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Interpretacja wyników 
	UWAGA: Upewnij się, że zduplikowane reakcje tej samej próbki nie różnią się o więcej niż 1 odchylenie standardowe. Wartości Mtb i EC Cq wyższe niż 30 są uważane za ujemne. Więcej szczegółów interpretacji znajduje się w tabeli 2.
	<ol>
		<li>Aby zinterpretować odpowiedź na leczenie, przelicz wartości Cq na obciążenie bakteryjne (eCFU/ml) za pomocą krzywej standardowej. Odczyt odpowiedzi na leczenie jako zmiany obciążenia bakteryjnego w okresie obserwacji leczenia. 
		nuta: Spadek wiremii bakteryjnej po leczeniu oznacza pozytywną odpowiedź (tj. leki przeciwgruźlicze zabijają bakterie gruźlicy), podczas gdy brak zmiany lub wzrost obciążenia bakteryjnego oznacza odpowiedź negatywną, co może oznaczać oporność bakterii gruźlicy na leki przeciwgruźlicze lub niewłaściwe przestrzeganie przez pacjenta dawki terapeutycznej. Spadek obciążenia bakteryjnego mierzony za pomocą TB-MBLA koreluje ze wzrostem czasu do dodatniego wyniku hodowli MGIT (TTP).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Przenieść 2 ml podwielokrotności inaktywowanych termicznie kultur i kontroli do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml. Wirować przez 10 minut przy 20 000 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 700 μl buforu do wiązania komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut w celu utrwalenia komórek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę przez 30 minut przy 16 000 x g, aby uzyskać twardy osad. Odrzucić supernatant i zastąpić go 1% sacharozą w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Przechowywać granulki w sacharozie w temperaturze 4 °C do momentu przekroju do mikroskopii elektronowej.</li>
	<li>Podział na sekcje i TEM 
	UWAGA: Poniższy protokół został zaadaptowany z Griffiths et al.28.
	<ol>
		<li>Krioprotektoratuj osad komórkowy, zanurzając go w 2,1 M sacharozie w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyj 3x lodowatą wodą.</li>
		<li>Schłodzić kriochronione granulki komórek w ciekłym azocie i zamontować je w kriomikrotomii. Za pomocą kriomikrotomu wytnij ultracienkie odcinki przy 90 nm.</li>
		<li>Odzyskaj wycięte sekcje za pomocą pętli z drutu wolframowego mieszaniny 1:1 2% metylocelulozy i 2,1 M sacharozy w PBS.</li>
		<li>Przenieść sekcje na sześciokątne miedziane wsporniki TEM (siatki) TEM z powłoką pioloform o oczkach 150 i przechowywać w temperaturze 4 °C lub przejść do kroku 5.4.5.</li>
		<li>Skontrastuj siatki z octanu uranylu i wysusz na powietrzu w warstwie octanu metylu. Umyj kratki lodowatą wodą, a następnie dwiema kroplami PBS przez 5 minut i susz przez 15-30 minut. Sprawdź sekcje w TEM zgodnie z wytycznymi producenta. 
		nuta: Wszystkie etapy etykietowania zostały wykonane w temperaturze lodu (temperaturze cieczy), z wyjątkiem etapów prania, które zostały wykonane w temperaturze otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((END+TB+Global+Tuberculosis+Report+2017%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">END TB Global Tuberculosis Report 2017.</a> World Health Organization. , (2017).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tuberculosis+report+2018%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global tuberculosis report 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TB+Elimination+in+Low-Incidence+Countries%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">TB Elimination in Low-Incidence Countries.</a> World Health Organization. , (2014).</li>
<li>Boehme, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((diagnostic+accuracy%2C+and+effectiveness+of+decentralised+use+of+the+Xpert+MTB%2FRIF+test+for+diagnosis+of+tuberculosis+and+multidrug+resistance%3A+a+multicentre+implementation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study.</a> The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xpert+MTB%2FRIF+assay+for+the+diagnosis+of+pulmonary+and+extrapulmonary+TB+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children.</a> World Health Organization. , (2010).</li>
<li>Friedrich, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+sensitivity+and+specificity+of+Xpert+MTB%2FRIF+assay+as+an+early+sputum+biomarker+of+response+to+tuberculosis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).</li>
<li>Desjardin, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+Messenger+RNA+as+a+Surrogate+for+Response+to+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy.</a> American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).</li>
<li>Hellyer, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Viable+Mycobacterium+tuberculosis+by+Reverse+Transcriptase-Strand+Displacement+Amplification+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bacterial+Load+Assay+%2C+a+Culture-Free+Biomarker+for+Rapid+and+Accurate+Quantification+of+Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+Bacillary+Load+during+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+Mycobacterium+tuberculosis+mRNA+as+a+Marker+of+Bacteriologic+Clearance+in+Response+to+Antituberculosis+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Bacterial+Load+Assay+Replaces+Solid+Culture+for+Measuring+Early+Bactericidal+Response+to+Antituberculosis+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).</li>
<li>Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+mRNA+as+a+Marker+for+Viability+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).</li>
<li>Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Live+and+Antibiotic-Killed+Bacteria+by+Quantitative+Real-Time+PCR+of+Specific+Fragments+of+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+agents+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA.</a> Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).</li>
<li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+RNA+in+bacteria%3A+Comparison+of+mRNA+and+stable+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA.</a> Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).</li>
<li>Gupta, R. K., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resuscitation+Promoting+Factors%3A+A+Family+of+Microbial+Proteins+in+Survival+and+Resuscitation+of+Dormant+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria.</a> Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).</li>
<li>Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resuscitation-promoting+factors+reveal+an+occult+population+of+tubercle+bacilli+in+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum.</a> American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).</li>
<li>Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mRNA+by+Reverse+Transcription-PCR+as+an+Indicator+of+Viability+in+Escherichia+coliCells+Detection+of+mRNA+by+Reverse+Transcription-PCR+as+an+Indicator+of+Viability+in+Escherichia+coli+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environment+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells.</a> Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bacterial+load+assay%2C+a+culture-free+biomarker+for+rapid+and+accurate+quantification+of+sputum+Mycobacterium+tuberculosis+bacillary+load+during+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).</li>
<li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bacterial+Load+Assay%3A+a+Fast+and+Accurate+Means+for+Monitoring+Tuberculosis+Treatment+Response%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response.</a> BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).</li>
<li>Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K. Mybacterial Load Assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGillespie%2C+H+%22Diagnostic+Bacteriology.+Methods+and+Protocols%22">Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols</a>. Bishop, A. K. , Humana Press. Totowa, NJ. 89-105 (2017).</li>
<li>Juffs, H., Deeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+Evaluation+of+Pasteurisation+for+Pathogen+Reduction+in+Milk+and+Milk+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Standards+Australia+New+Zealand%22%5BJournal%5D)">Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products.</a> Food Standards Australia New Zealand. , Wellington, New Zealand. (2007).</li>
<li>Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolmes%2C+CJ+%22Blood+Purification%22">Blood Purification</a>. 22, 461-468 (2004).</li>
<li>Chedore, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inactivating+and+fixing+unstained+smear+preparations+of+Mycobacterium+tuberculosis+for+improved+laboratory+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).</li>
<li>Cardoso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Tubercle+Bacilli+in+Heat-fixed+and+Stained+Sputum+Smears%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).</li>
<li>Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+the+heat+killing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis.</a> Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).</li>
<li>Honeyborne, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+bacterial+load+assay+replaces+solid+culture+for+measuring+early+bactericidal+response+to+antituberculosis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).</li>
<li>Sabiiti, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+Inactivation+Renders+Sputum+Safe+and+Preserves+Mycobacterium+tuberculosis+RNA+for+Downstream+Molecular+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests.</a> Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).</li>
<li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasructure+Research%22%5BJournal%5D)">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).</li>
<li>Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPT+64+Antigen+detection+for+Rapid+confirmation+of+M.+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates.</a> BMC Research Notes. 4, 79(2011).</li>
<li>Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rendering+of+mycobacteria+safe+for+molecular+diagnostic+studies+and+development+of+a+lysis+method+for+strand+displacement+amplification+and+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR.</a> Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).</li>
<li>Blackwood, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+testing+of+material+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis+prior+to+removal+from+a+Containment+Level-III+Laboratory+as+part+of+a+Laboratory+Risk+Assessment+Program%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program.</a> BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).</li>
<li>Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Mycobacterium+tuberculosis+DNA%3A+a+Question+of+Contaiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).</li>
<li>Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Mycobacterium+tuberculosis+for+DNA+typing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).</li>
<li>McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+stability+in+heat+killed+and+UV-irradiated+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+and+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Appied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7.</a> Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).</li>
<li>Blank, A., Dekker, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleases+of+Human+Serum%2C+Urine%2C+Cerebrospinal+Fluid%2C+and+Leukocytes.+Activity+Staining+following+Electrophoresis+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels.</a> Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).</li>
<li>O'Leary, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+impact+of+endogenous+ribonucleases+on+reverse+transcription-PCR+assay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems.</a> Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).</li>
<li>Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structome+analysis+of+virulent+Mycobacterium+tuberculosis%2C+which+survives+with+only+700+ribosomes+per+0.1+fl+of+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm.</a> PLoS One. 10, 1-14 (2015).</li>
<li>Yang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+species-specific+features+of+the+ribosome+from+the+human+pathogen+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule pokazano, że obróbka cieplna przez 20 minut w temperaturze 80 °C, 85 °C i 95 °C skutecznie dezaktywuje próbki gruźlicy, umożliwiając wykonanie TB-MBLA w placówce innej niż CL3 bez ryzyka zakażenia pracowników laboratoryjnych. Wyniki potwierdzają obserwacje poczynione w poprzednich badaniach, jednocześnie kontrastując z niektórymi na temat skuteczności inaktywacji cieplnej Mtb25,30. Na przykład niektóre raporty wskazują, że ogrzewanie w temperaturze 80 °C nie jest skuteczne w przypadku próbek o dużym obciążeniu bakcyllami 25,31,32,33. W naszym badaniu uniknięto efektu inokulum o dużej gęstości, zapewniając, że cała plwocina i czyste kultury zostały podgrzane w objętości 1 ml na 15 ml probówki wirówkowej, zapewniając odpowiednią przestrzeń do wystawienia każdej części próbki na wrzenie27.
Zachowanie RNA po inaktywacji cieplnej umożliwia przeprowadzenie TB-MBLA. Odkrycie to zgadza się z dwoma badaniami, które wykazały zachowanie RNA po inaktywacji cieplnej12,34. Wykazaliśmy, że RNA w próbkach inaktywowanych termicznie jest stabilne w temperaturze 37 °C przez 4 dni, co oznacza, że laboratoria mogą przeprowadzać testy grupowe, utrzymując inaktywowane próbki w temperaturze pokojowej przez tydzień. Dzięki zastosowaniu zestawów do ekstrakcji RNA, które wymagają chłodzenia lub zamrażania, możliwość utrzymania inaktywowanych próbek w temperaturze pokojowej eliminuje potrzebę wykonywania TB-MBLA w warunkach ograniczonych zasobów zarówno przez laboratoria łańcucha chłodniczego, jak i laboratoria kategorii 3.
Mniej niż 1log obciążenia bakteryjnego zostało utracone przy użyciu 16S rRNA jako markera. Chociaż istniała różnica między próbką żywą a inaktywowaną termicznie, ilość tracona w wyniku inaktywacji cieplnej jest zbyt mała, aby zagrozić dalszym wynikom. Wzrost temperatury nie zwiększył ilości traconego RNA, co oznacza, że obserwowana utrata jest niezależna od obróbki cieplnej. Obróbka cieplna w wysokich temperaturach najprawdopodobniej powoduje lizę komórek, narażając RNA na degradację przez RNazy. Rzeczywiście, egzogenne dodanie RNazy A do frakcji inaktywowanej ciepłem zwiększyło szybkość degradacji RNA. Gotowanie nie zmniejszyło aktywności RNazy, co oznacza, że jest to białko bardzo odporne.
Ważne jest, aby pamiętać, że średnia degradacja RNA wynosząca 1,5 log10 eCFU/ml nie jest dużą stratą. W tym celu stawiamy hipotezę, że ogrzewanie powoduje lizę niewielkiej części pałeczek Mtb, narażając w ten sposób niewielką ilość RNA na działanie RNazy. Za pomocą TEM wykazaliśmy, że morfologia komórek Mtb i integralność ścian komórkowych prawie nie wpływa na ogrzewanie w temperaturze 95 °C. Oznacza to, że może wymagać różnych czynników fizjologicznych i wystarczającej podaży RNaz, takich jak w gospodarzu, aby znacząco zdegradować RNA35,36. Ponadto, będąc rybosomem strukturalnym, 16S rRNA jest potencjalnie mniej podatny na RNazę 37,38. Pojedyncza komórka Mtb zawiera ~ 700 rybosomów / 0,1mm3 cytoplazmy37, co oznacza, że na komórkę przypadają większe ilości rRNA. Zatem mniejsze ilości RNazy mogą mieć mniejszy wpływ38. Istnienie dużej liczby rybosomów daje TB-MBLA przewagę pod względem czułości i zdolności do wykrywania pacjentów z gruźlicą o niskim obciążeniu.
Stwierdzono silną korelację między obciążeniem bakteryjnym mierzonym za pomocą TB-MBLA a TTP hodowli MGIT. Potwierdza to w pewnym stopniu obciążenie bakteryjne jako czynnik wpływający na dodatnie wyniki hodowli. Jednak zaletą TB-MBLA jest to, że bezpośrednio określa ilościowo obciążenie bakcyllacyjne obecne w próbce i nie wymaga proliferacji komórek Mtb przed wykryciem. Kontrastuje to z hodowlą, w której czas do uzyskania dodatniego wyniku zależy od poziomu obciążenia bakteryjnego i tempa proliferacji komórek Mtb. Przyszłe badania będą oceniać przebieg pracy TB-MBLA, w tym inaktywację termiczną, w rutynowych warunkach klinicznych. W badaniu zbadane zostaną również próbki z różnymi ładunkami bakteryjnymi, aby zrozumieć liczbę, która może zmienić się z dodatniej na ujemną (tj. te, w których po inaktywacji cieplnej jest mniej bakterii).
Protokół TB-MBLA do molekularnej kwantyfikacji obciążenia bakteryjnego jest pierwszym tego rodzaju protokołem w bakteriologii. Metoda bezpośrednio określa ilościowo obciążenie prątkami Mtb z plwociny pacjenta i nie wymaga do tego posiewu. To sprawia, że jest szybszy i zwiększa jego potencjał do informowania o decyzjach klinicznych dotyczących postępów pacjenta. Etap inaktywacji termicznej zmniejsza ryzyko infekcji i zwiększa możliwości zastosowania TB-MBLA w warunkach, w których nie ma laboratorium kategorii 3. Po inaktywacji termicznej próbki istnieją trzy etapy protokołu w celu uzyskania wyników TB-MBLA: ekstrakcja RNA, odwrotna transkryptaza (RT)-qPCR i analiza wyników qPCR.
Im wyższa skuteczność izolacji Mtb RNA od próbki pacjenta, tym wyższa jakość wyników. Ważne jest, aby pamiętać, że jakość próbki plwociny wpływa na ilość wyizolowanego RNA. Na przykład plwocina ślinowa jest uważana za niskiej jakości i wiąże się z niskim obciążeniem bakteryjnym. Oznacza to, że ważne jest przeszkolenie pacjenta w zakresie wysokiej jakości odkrztuszania plwociny. Aby ocenić skuteczność procesu ekstrakcji, przed ekstrakcją RNA do próbki wprowadza się kontrolę ekstrakcji (tj. znaną liczbę komórek innych niż Mtb). Odzyskanie kontroli ekstrakcji potwierdza skuteczność procesu ekstrakcji RNA. Proces izolacji RNA nie może być prawidłowy, jeśli nie została pobrana kontrola ekstrakcji. Biorąc pod uwagę fakt, że Mtb jest odpornym organizmem, liza mechaniczna jest kluczową częścią procesu. Homogenizacja próbki z dużą prędkością (600 obr./min) w obecności kulek (tj. matryca lizująca) skutecznie powoduje lizę komórek. W wyniku oczyszczenia lizatu uzyskuje się ekstrakt zawierający zarówno RNA, jak i DNA. Usunięcie DNA jest kluczowym ostatnim etapem ekstrakcji RNA. TB-MBLA ma na celu pomiar żywotnych pałeczek poprzez ilościowe określenie RNA. Tak więc niepowodzenie w usunięciu genomowego DNA oznacza, że wyniki będą miały sygnał z DNA, który nie jest dobrym markerem żywotności komórki6.
RT-qPCR to dupleksowa sonda z podwójnym oznaczeniem do kontroli Mtb i ekstrakcji. Składa się z trzech etapów: 30-minutowej odwrotnej transkrypcji przez odwrotną transkryptazę w temperaturze 50 °C, 15-minutowej denaturacji w temperaturze 95 °C i 40 cykli amplifikacji w temperaturze 94 °C i 60 °C. Akwizycja fluorescencji z sond następuje w temperaturze 60 °C (tj. w fazie wydłużania fragmentów). Należy zauważyć, że TB-MBLA został zoptymalizowany przy użyciu konkretnej maszyny qPCR, więc operatorzy korzystający z innych platform qPCR powinni zoptymalizować warunki dla swojego sprzętu. Skuteczność usuwania DNA jest kontrolowana poprzez przeprowadzenie pojedynczej reakcji na próbkę przy braku RT. Pozytywny wynik tej reakcji oznacza niepełne usunięcie DNA. Próbki o dużym obciążeniu, które zawierają duże ilości DNA, mogą wymagać podwójnej ilości enzymu DNazy do całkowitego usunięcia DNA. Na szczęście w próbkach o dużym obciążeniu prątkami obecność niewielkich ilości DNA jest mniej prawdopodobna, aby wpłynąć na wynik RNA. Rybosomalny RNA, cel TB-MBLA, naturalnie występuje w dwukrotnie większej ilości niż DNA37. W PCR kontrola bez matrycy (NTC), która jest wodą używaną do rozpuszczania odczynników PCR, kontroluje zanieczyszczenie krzyżowe egzogennym DNA lub RNA. Pozytywny sygnał w NTC oznacza zanieczyszczenie krzyżowe, a wynik jest uważany za nieważny. Oznacza to, że wszystkie roztwory sporządzone przy użyciu tej wody muszą zostać wyrzucone, a nowe wykonane przy użyciu świeżej fiolki z wodą. Zaleca się przechowywanie wody PCR w oddzielnych podwielokrotnościach, aby uniknąć zanieczyszczenia całej wody. Kontrola pozytywna (Mtb RNA) służy do kontroli ogólnej skuteczności PCR.
Analiza wyników polega na przeliczeniu Cqs PCR na obciążenie bakteryjne (tj. szacowane jednostki tworzące kolonie na ml) przy użyciu krzywej wzorcowej. Ustawienie i optymalizacja krzywej standardowej ma kluczowe znaczenie na tym etapie. Zalecana jest standardowa sprawność krzywej 0,95–1. Standardowe krzywe dla MTb i kontroli ekstrakcji powinny być skonfigurowane i zoptymalizowane przed uruchomieniem pacjentów lub innych próbek testowych na maszynie. Standardowe próbki są dostarczane z zestawem TB-MBLA. Do PCR zaleca się dziesięciokrotne rozcieńczenie ekstraktu RNA. Oznacza to, że wynik obciążenia bakteryjnego należy pomnożyć przez współczynnik 10, aby uzyskać ostateczny wynik obciążenia bakteryjnego na ml. Należy zauważyć, że Cqs powyżej 30 są uważane za negatywne dla TB-MBLA. Aby można było wnioskować o odpowiedzi na leczenie, wymagane są co najmniej dwa prospektywne wyniki obciążenia bakteryjnego mierzone w różnych punktach czasowych. Zdecydowanie zaleca się, aby jeden z dwóch wyników był wyjściowy przed rozpoczęciem leczenia. Jeśli jednak zainicjowana przez pacjenta ocena obciążenia bakteryjnego następuje w połowie leczenia, musi nastąpić drugi pomiar obciążenia bakteryjnego w punkcie czasowym w celu oceny odpowiedzi na leczenie. TB-MBLA potrafi rozróżnić obciążenie bakteryjne w ciągu 3 dni po leczeniu, ale idealnym rozwiązaniem są dwa pomiary obciążenia bakteryjnego wykonane w odstępie 7 dni.
Chociaż protokół generuje pouczające wyniki ilościowe dotyczące odpowiedzi na leczenie, nadal jest w dużej mierze ręczny i wymaga znacznego czasu na ekstrakcję RNA. Technicy w zatłoczonych laboratoriach mogą nie mieć tego czasu. Trwają przygotowania do automatyzacji procesów ekstrakcji RNA i PCR.

Spowodowane przez Mycobacterium tuberculosis (Mtb), ponad 7 x 106 nowych przypadków gruźlicy (TB) jest zgłaszanych na całym świecie, z czego ponad 1 x 106 umiera rocznie1,2. Aby odwrócić ten trend, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) wprowadziła podejście oparte na trzech filarach, w tym opracowanie skutecznych narzędzi diagnostycznych i leczniczych3. Sklasyfikowana przez ONZ jako niebezpieczna substancja biologiczna B, praca z próbkami, co do których istnieje podejrzenie, że są dodatnie dla Mtb, wymaga poziomu hermetyczności (CL) wynoszącego 3. Laboratoria CL3 są drogie w budowie i utrzymaniu. W związku z tym większość krajów scentralizowała usługi w zakresie hodowli gruźlicy na poziomie regionalnym lub krajowym. Oznacza to, że mikroskopia cytologiczna jest najbardziej dostępnym narzędziem diagnostycznym w peryferyjnych placówkach opieki zdrowotnej.
Istnieje zgoda WHO na wdrożenie szybkich testów molekularnych, takich jak Xpert MTB/RIF w placówkach opieki zdrowotnej poziomu 4, głównie zlokalizowanych na poziomie dystryktu4,5. Niektóre dzielnice są dość duże i mniej dostępne dla niektórych osób. Chociaż jest to korzystne, Xpert MTB/RIF działa poprzez wykrywanie DNA Mtb. DNA jest stabilną cząsteczką, która przetrwa długo po śmierci komórek, a zatem nie jest dobrym standardem do pomiaru żywotnych komórek krytycznych dla monitorowania odpowiedzi na leczenie5,6. Testy oparte na RNA stanowią alternatywę dla dokładnego pomiaru żywotnych komórek7,8,9,10,11,12,13. RNA występuje w różnych gatunkach o różnej stabilności: rybosomalnym RNA (rRNA), transferowym RNA (tRNA) i informacyjnym RNA (mRNA). Informacyjny RNA jest związany z ekspresją genów, a zatem jest najściślej związany z aktywnością i żywotnością komórki14. Ważne jest, aby pamiętać, że brak ekspresji genów nie jest równoznaczny ze śmiercią komórki, ponieważ wiadomo, że patogeny takie jak Mtb istnieją w stanie nieaktywnym (uśpionym), ale zdolnym do życia15,16. Stabilne gatunki RNA, takie jak rRNA, są zatem lepszymi markerami zarówno aktywnych, jak i nieaktywnych stanów żywotnych komórek.
Używając Escherichia coli, Sheridan wykazał, że 16S rRNA proporcjonalnie wzrastało wraz ze wzrostem bakterii mierzonym liczbą jednostek tworzących kolonie (CFU)17. Nastąpił jednoczesny spadek liczby CFU i 16S rRNA, gdy bakterie E. coli były narażone na działanie antybiotyków. Spadek rRNA po śmierci komórki był wskaźnikiem, że może on być używany jako marker żywotności komórki13,17. Opierając się na tej zasadzie, opracowano test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA) do celowania w rRNA M. tuberculosis 16S w celu pomiaru żywotnego obciążenia prątkami gruźlicy jako markera odpowiedzi na leczenie u pacjentów poddawanych terapii przeciwgruźliczej11,18,19. Dalej rozwijaliśmy i optymalizowaliśmy TB-MBLA, aby uwzględnić kontrolę ekstrakcji komórkowej, która odzwierciedla lizę pałeczek M. tuberculosis i jest odporna w różnych warunkach środowiskowych20. Procedura TB-MBLA wymaga, aby pierwsze etapy izolacji RNA z Mtb były przeprowadzane w laboratorium CL3 do momentu całkowitej lizy komórek Mtb, aby zapewnić bezpieczeństwo pracowników. Obejmuje to również przechowywanie próbek do retrospektywnej analizy wsadowej, które mają być utrzymywane w temperaturze -80 °C w tiocyjanianu guanidyny, substancji toksycznej poziomu 4. W tym celu użyliśmy ciepła do inaktywacji Mtb i uczynienia próbek bezpiecznymi do wykonywania TB-MBLA w laboratoriach mikroskopii rozmazowej.
Wykorzystanie ciepła w zastosowaniach laboratoryjnych i klinicznych istnieje od wieków21,22. Jednak niektóre mikroorganizmy, takie jak Mtb, są trudne do zabicia, a krótsza ekspozycja na ciepło nie wystarcza, aby zabić wszystkie komórki23,24. Badanie wykazało, że 20-minutowe ogrzewanie kultur gruźlicy w temperaturze 80 °C zabiło wszystkie pałeczki Mtb bez zniszczenia DNA potrzebnego do PCR25. Następnie, szereg laboratoryjnych technik ekstrakcji DNA podgrzewa się obecnie do 95 °C. Zastosowaliśmy tę samą zasadę, aby pokazać, że próbki gruźlicy wrzące w temperaturze 80 °C, 85 °C lub 95 °C dezaktywują Mtb, zachowując jednocześnie wystarczającą ilość RNA, aby można było przeprowadzić TB-MBLA. Inaktywowaną kulturę lub plwocinę można przechowywać w szczelnie zamkniętych pojemnikach w temperaturze pokojowej lub przechowywać w lodówce przez 7 dni bez zmniejszania ilości mierzalnego rRNA.
TB-MBLA, obecnie używany jako test wyłącznie do celów badawczych (RUO), jest elastyczny i został zastosowany do różnych typów próbek, w tym plwociny, tkanki płucnej i płynu mózgowo-rdzeniowego. Nie został jeszcze zastosowany do płynu pęcherzykowego oskrzeli, krwi i innych rodzajów próbek. Używając plwociny jako próbki, wyniki oceny wieloośrodkowej w Afryce (dane niepublikowane) i poprzednie publikacje18,26 pokazują, że czułość MBLA jest zgodna z płynną hodowlą w probówce wskaźnika wzrostu prątków (MGIT). Jednak TB-MBLA jest szybsza, daje wyniki w ciągu godzin, a nie dni lub tygodni hodowli, jest specyficzna, nie ma wpływu na mikroorganizmy inne niż gruźlica w próbce i daje ilościową miarę ciężkości choroby. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała niedawno TB-MBLA za kandydata do zastąpienia mikroskopii rozmazowej i hodowli w monitorowaniu leczenia gruźlicy2.
W tym artykule szczegółowo opisujemy inaktywację ciepła i protokół TB-MBLA opublikowany w Sabiiti et al.27. Ten szczegółowy protokół zapewni kompleksowe zasoby wizualne dla użytkowników TB-MBLA na całym świecie.

<table><tbody><tr><td>Inaktywacja termiczna:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówki wirówkowe</td><td>Fisher-Scientific</td><td>10136120</td><td>50 ml mogą być używane, jeśli w grę wchodzą większe objętości próbek</td></tr><tr><td>15 ml stojak na rurki druciane</td><td>Fisher-Scientific</td><td>11749128</td><td>Można stosować inne marki o podobnej marce</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher-Scientific</td><td>15700619</td><td>Można stosować inne marki o podobnej marce</td></tr><tr><td>< silna ekstrakcja >RNA: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>372978-1L</td><td>Nie jest konieczne w innych markach zestawów do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Etanol, absolutny 99-100%</td> <td>Sigma</td><td>51976-500ML-F</td><td>Dostępna większa objętość</td></tr><tr><td>Kontrola ekstrakcji</td><td>Grupa SOI St Andrews</td><td>VitalbacteriaEC</td><td>Dostarczany z Zestaw TB-MBLA Vitalbacteria</td></tr><tr><td>FASTRNA Pro niebieski Zestaw</td><td>MP Biomedicals</td><td>116025050</td><td>Dostarczany z probówkami z matrycą lizującą</td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej (bez RNaz)</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td>Qiagen, Fisherscientific może również dostarczyć ten sam produkt</td></tr><tr><td>Homogenizator Precellys 24</td><td>VWR</td><td>432-3750</td><td>FastPrep MP Biomedicals może być również używany</td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem, Fresco 21, Heraeus</td><td>Fisher-Scientific</td><td>15352117</td><td>Można stosować inne marki o podobnej pojemności</td></tr><tr><td>: Termomikser</td><td>Eppendorf</td><td>BLD-455-010C</td><td>Działa z probówkami 1-2 ml</td></tr><tr><td>TURBO bez DNA</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM1907M</td><td>Trwa dłużej, ale jest skuteczniejszy niż krótsze procedury usuwania DNA.</td></tr><tr><td>RT-qPCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primery i sondy Taqman</td><td>grupa SOI St Andrews</td><td>VitalbacteriaPP</td><td>Dostarczany z zestawem TB-MBLA Vitalbacteria. Fluorofory sondy to FAM (zielony) dla Mtb i HEX (żółty) dla kontroli ekstrakcji (EC). Platformy qPCR firmy Applied Biosystems wykorzystują VIC zamiast HEX.</td></tr><tr><td>QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204845</td><td>mieszanka PCR plus enzym RT</td></tr><tr><td>RotorGene Q 5plex maszyna</td><td>Qiagen</td><td>9001580</td><td>Można stosować inne maszyny qPCR: Vii7, Quantistudio, Steponelus itp.</td></tr><tr><td>Można stosować probówki i nakrętki paskowe, 0,1 ml</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td>Inne rozmiary probówek dostępne w zależności od wielkości wirnika. W przypadku innych platform PCR potrzebne są 96-dołkowe płytki PCR.</td></tr><tr><td><silny>Inaktywacja termiczna Materiały do konserwacji próbek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7,5</td><td>Sigma</td><td>93313</td><td>Dostarczany w postaci gotowej do użycia</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Tiocyjanian guanidyny (GTC)</td><td>Marka Promega</td><td>V2791</td><td>Promega zalecana ze względu na jakość</td></tr><tr><td>Woda molekularna ( Bez RNazy)</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td>Zapewnia, że roztwór GTC jest wolny od nukleaz</td></tr><tr><td><silne>Materiały ogólne (używane, ale niespecyficzne dla TB-MBLA)</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml pojemniki plastikowe</td><td></td><td>734-5087</td><td>Marka Nalgene polecana</td></tr><tr>Słoiki <td></td><td></td> na<td>odpady biologiczne</td><td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Słoiki</td> <td>na odpady chemiczne</td><td></td><td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Rękawice jednorazowe, odporne na</td><td></td><td></td> chemikalia <td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Zamrażarka (-20 &deg; C)</td><td></td><td></td> <td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Zamrażarka (-80 & C)</td><td></td><td></td> <td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Lodówka (0-8 & C)</td><td></td><td></td> <td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Dygestoria</td><td></td><td></td><td>Do bezpiecznego obchodzenia się z toksycznymi odczynnikami</td></tr><tr><td>Wagi</td><td></td><td></td><td>laboratoryjne Do dokładnego pomiaru odczynników</td></tr><tr><td>Cylindry miarowe, z tworzyw sztucznych</td><td></td><td></td><td>Aby zapewnić dokładny pomiar odczynników</td></tr><tr><td>Probówki</td><td></td><td></td> reakcyjne PCR <td>Powinny być odpowiednie do używanego</td></tr> <tr><td>przyrządu do PCRPipety i pasujące sterylne końcówki do pipet z filtrem,</td><td></td><td></td> <td>wolne od DNAzy i RNAzy, zakres: P1000, P200, P10, P2 zalecane</td></tr><tr><td>Płytki ładujące Qiagility</td><td></td><td></td><td>5-dołkowa główna płytka mieszająca, 16-dołkowa płytka odczynnikowa, 32-dołkowa płytka do próbek, 72-dołkowe i 96-dołkowe płytki reakcyjne</td></tr><tr><td>QIAgility Robot do pipetowania</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Ważne dla pipetowania</td></tr> <tr><td>o wysokiej przepustowościStojaki na mikroprobówki 1,5 ml i 2 ml oraz na probówki</td><td></td><td></td> Falcon o pojemności 15 ml i 50 ml <td>Odporne na chemikalia i nadające się do sterylizacji w autoklawie zalecane</td></tr><tr><td>RNase Away (usuwa enzymy RNazy z przestrzeni roboczej)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10666421</td> Ważne jest, <td>aby zapewnić, że usługi i urządzenia są wolne od enzymu RNazy</td></tr><tr><td>Okulary ochronne, odporne na chemikalia</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Można również dostać od Sigma. Chronić oczy przed toksycznymi odczynnikami.</td></tr><tr><td>Sterylne pipety Pasteura, 1,5-3 ml</td><td></td><td></td><td>Wielu kompetentnych dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne mikroprobówki</td><td></td><td></td> bez RNAzowe <td>1,5 ml odpowiednie do zamrażania w temperaturze -80 stopni; C zalecany</td></tr><tr><td>środek dezynfekujący gruźlicę, np. Tristel Fuse</td><td></td><td></td><td>Upewnij się, że jest świeżo przygotowany lub przygotowany w ciągu tygodnia</td></tr><tr><td>Zalecana marka Vortex</td><td></td><td></td><td>Genie 2</td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glualdehyd (8%)</td><td>Sigma</td><td>G7526-10ML</td><td>Część bufora utrwalającego komórki (bufor HEPES)</td></tr><tr><td>HEPES ( pH 7,4, 100 mM)</td><td>Sigma</td><td>H4034-25G</td><td>Część bufora do utrwalania komórek (bufor HEPES)</td></tr><tr><td>Leica FCS ultracryo</td><td>Leica</td><td></td><td>Cryomicrotome do cięcia tkanek</td></tr><tr><td>Agar metylocelulozowy</td><td>AGG6425</td><td>Żywica montażowa na zimno</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (4% w PBS)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Część bufora do utrwalania komórek (bufor HEPES)</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>84097-250G</td><td>Medium konserwujące i montażowe</td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td>Uniwersalne barwienie do mikroskopii elektronowej</td></tr></tbody></table>

test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (tb-mbla)

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Gruźlica jest wywoływana przez Mycobacterium tuberculosis (Mtb), patogen sklasyfikowany przez Organizację Narodów Zjednoczonych (ONZ) jako niebezpieczna substancja biologiczna kategorii B. Ze względu na bezpieczeństwo pracowników, obchodzenie się ze wszystkimi próbkami, co do których istnieje podejrzenie, że są nosicielami Mtb, musi odbywać się w laboratorium o poziomie hermetyczności (CL) 3. Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA) jest ilościowym testem reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR), który określa ilościowo obciążenie prątkami Mtb przy użyciu starterów i podwójnie znakowanych sond dla 16S rRNA. Opisujemy zastosowanie inaktywacji cieplnej w celu uczynienia próbek gruźlicy niezakaźnymi, przy jednoczesnym zachowaniu RNA dla TB-MBLA. Porcję 1 ml próbki plwociny w szczelnie zamkniętych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml gotuje się przez 20 minut w temperaturze 80 °C, 85 °C lub 95 °C w celu dezaktywacji pałeczek Mtb. Hodowla próbek inaktywowanych w cieple i kontrolnych (żywych) przez 42 dni potwierdziła śmierć gruźlicy. Inaktywowaną próbkę następnie wzbogaca się 100 μl kontrolnego środka ekstrakcyjnego, a RNA ekstrahuje się zgodnie ze standardową procedurą izolacji RNA. Nie zaobserwowano wzrostu w kulturach próbek poddanych obróbce cieplnej. Wyizolowany RNA poddawany jest procesowi RT-qPCR w czasie rzeczywistym, który amplifikuje określony cel w genie Mtb 16S rRNA, uzyskując wyniki w postaci cykli kwantyfikacji (Cq). Krzywa standardowa służy do przeliczenia Cq na obciążenie bakteryjne lub szacowane jednostki tworzące kolonie na ml (eCFU/ml). Istnieje odwrotna zależność między Cq a obciążeniem bakteryjnym próbki. Ograniczenie polega na tym, że inaktywacja cieplna powoduje lizę niektórych komórek, wystawiając RNA na działanie RNaz, które powodują utratę <1 log10eCFU/ml (tj. <10 CFU/ml). Dalsze badania pozwolą określić odsetek pacjentów o bardzo niskim obciążeniu, którzy powodują fałszywie ujemne wyniki z powodu inaktywacji cieplnej.

Obróbka termiczna inaktywuje wszystkie prątki M. tuberculosis 
Gęstość optyczna (OD) w próbkach kontrolnych (żywe komórki) wzrastała w czasie (0,04OD–0,85OD), natomiast w próbkach inaktywowanych termicznie nie zaobserwowano zmian OD, co odpowiednio wskazywało na wzrost i brak wzrostu (Rycina 1)27. Podobnie kontrolna kliniczna próbka plwociny wykazała wzrost w systemie MGIT do 3. dnia, podczas gdy kliniczne próbki inaktywowane termicznie nie dały wyniku dodatniego aż do końca inkubacji. Wzrost Mtb w systemie MGIT potwierdzono za pomocą mikroskopii barwienia po Ziehl-Neelsenie oraz wykryciem antygenu MPT6429.
RNA w inaktywowanych próbkach jest stabilne w temperaturze 37 °C przez 4 dni 
Próbki inaktywowane termicznie inkubowano w temperaturze 37 °C, aby ustalić, czy RNA ulega degradacji po inaktywacji termicznej komórek. Nie stwierdzono różnic między RNA pobranym w dniu (D) 0 bezpośrednio po inaktywacji termicznej a RNA wyizolowanym w dniach D1, 2, 3 i 4 zarówno w kulturach BCG (Rysunek 2A-C), jak i w plwocinie dodatniej pod kątem TB (Rysunek 2D).
Egzogenna RNaza zwiększa tempo degradacji RNA w frakcjach inaktywowanych termicznie 
Aby ustalić, dlaczego RNA nie ulegało degradacji, egzogennie dodano enzym RNaza A w stężeniu 1 0 U/mL przed i/lub po inaktywacji termicznej. Spowodowało to ubytek RNA odpowiadający obciążeniu bakteryjnemu wynoszącemu odpowiednio 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 - oraz 1,3 ± 0,1 – log10 eCFU/mL przy 80 °C, 85 °C i 95 °C w ciągu 4 dni inkubacji. Odnotowano różnice w ilości zdegradowanego RNA w próbkach, w których RNaza była dodawana przed i/lub po inaktywacji termicznej (Rysunek 3A-C).
Zachowano wystarczającą ilość RNA do badania TB-MBLA, wykorzystując 16S rRNA jako marker referencyjny 
Wpływ inaktywacji termicznej na rRNA mierzono w kulturach BCG oraz w plwocinach pacjentów z dodatnim wynikiem w kierunku gruźlicy. Pomiar miana bakterii w kontrolnej kulturze BCG wyniósł 5,3 ± 0,2 log10 eCFU/ml wynosiło 0,2 ± 0,1 log10 eCFU/mL wyższe niż połączone 5,1 ± 0,3 log10 eCFU/ml kultury inaktywowanej termicznie (ANOVA p &lt; 0,001) przy 80 °C, 85 °Coraz 95 °C (Rycina 4A)27Podobnie ładunek bakteryjny w plwocinie pacjentów z grupy kontrolnej wynosił 7,1 log10 eCFU/ml wynosiło 0,8 ± 0,1 log10 eCFU/ml wyższa niż połączona wartość 6,3 ± 0,41 log10eCFU/ml przy 80 °C, 85 °Ci 95 °C (Rycina 4B)27Redukcja obciążenia bakteryjnego była &lt;1 log w dwóch badanych typach próbek.
Test wielokrotnych porównań Sidaka wykazał istotną różnicę pomiędzy ładunkiem bakteryjnym przy 95 °C a ładunkiem przy 80 °C i 85 °C (p = 0.01). W próbkach TB nie stwierdzono różnic w żadnej z temperatur, p = 0.8.
Integralność ściany komórkowej nie zostaje naruszona przez wysoką temperaturę w większości komórek Mtb 
Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) zbadano, czy komórki uległy lizie w wyniku inaktywacji termicznej. Przygotowano cienkie przekroje z granulatów komórek utrwalonych parafomaldehydem, które przed badaniem w TEM zatopiono w medium bogatym w elektrony. Inspekcja komórek przy niskim i wysokim powiększeniu wykazała nienaruszoną ścianę komórkową oraz widoczne wewnątrzkomórkowe inkluzje lipidowe. Komórki morfologicznie wydawały się wydłużone, ale niezlizowane. Rysunek 5 przedstawia morfologię komórek prątków przy różnych powiększeniach. Dwa górne panele ukazują wewnątrzkomórkowe inkluzje lipidowe oraz niezakłócone tworzenie sznurów, co jest cechą morfologiczną typową dla gatunków Mycobacterium. Dwa dolne panele przedstawiają większe powiększenie, rozszerzając widok na inkluzje lipidowe i ujawniając niektóre mikrostruktury wewnątrzkomórkowe.
Ładunek bakteryjny mierzony metodą TB-MBLA jest odwrotnie skorelowany z czasem do uzyskania wyniku dodatniego w hodowli MGIT 
U pacjentów odpowiadających na terapię ładunek bakteryjny spada średnio o 1 log10 eCFU/mL tygodniowo w trakcie leczenia. Pacjenci szybko reagujący na terapię szybciej eliminują drobnoustroje, osiągając wynik negatywny (zerowy ładunek bakteryjny) po 2 tygodniach leczenia. Spadek ładunku bakteryjnego mierzonego metodą TB-MBLA odpowiadał wydłużeniu czasu do uzyskania wyniku dodatniego (TTP) w hodowli MGIT. Rysunek 6 przedstawia stwierdzoną odwrotną korelację między ładunkiem bakteryjnym a TTP w MGIT. Różnica polega jednak na tym, że wyniki TB-MBLA są dostępne w ciągu 4 h, a czas uzyskania wyniku jest niezależny od poziomu ładunku bakteryjnego. Kontrastuje to z czasem 5–25 dni w przypadku testów hodowlanych MGIT. Zanieczyszczenie bakteriami innymi niż prątki gruźlicy dodatkowo pogarsza wiarygodność wyników testów hodowlanych.
<img alt="Wykres wzrostu gęstości optycznej; próbki żywe i inaktywowane termicznie przy 600 nm w ciągu 40 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Weryfikacja inaktywacji BCG w 80 °C (krzywa wzorca kropek), 85 °C (krzywa w kropka-kreska) oraz 95 °C (krzywa o przerywanej linii). Kontrola (krzywa czarna) stanowiła żywą (niepodgrzewaną) kulturę BCG zaszczepioną w to samo medium wzrostowe. Wzrost w kontroli potwierdzono poprzez wzrost gęstości optycznej (OD) kultury w okresie inkubacji. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Sabiiti et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres wzrostu bakterii; dni inkubacji a obciążenie (log10 JCF/ml); porównanie wielu zestawów danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig2v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Stabilność mierzalnego RNA w próbce inaktywowanej termicznie, inkubowanej w 37 °C przez 4 dni (D0–D4). (A), (B), i (C) przedstawia kultury BCG inaktywowane w 80 °C, 85 °Ci 95 °C odpowiednio. (D) przedstawia plwociny z gruźlicą (TB) inaktywowane w temperaturze 80 °CKulturą kontrolną jest niepoddaną działaniu frakcja (żywa) z tej samej próbki. Słupki błędu = odchylenie standardowe. Trzy powtórzenia, dziewięć replikacji w każdej serii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy obciążenia bakteryjnego, badanie wpływu RNazy, CFU/ml w funkcji dni, wyniki porównania inkubacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Silniejsza degradacja RNA po egzogennym dodaniu enzymu RNaza A. (A) Inaktywacja termiczna (HI) w temperaturze 80 °C, (B) HI w 85 °C, i (CCześć 95 °CSłupki błędów = błąd standardowy średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Porównanie ładunku bakteryjnego w przypadku BCG i Mtb zabitych termicznie; wykres rozrzutowy z istotnością statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zachowanie wystarczającej ilości RNA do pomiaru ładunku bakteryjnego TB-MBLA z wykorzystaniem 16S rRNA jako markeru. (A) Obciążenie bakteryjne oszacowane na podstawie hodowli BCG in vitro. (B) Obciążenie bakteryjne oszacowane na podstawie plwociny dodatniej w kierunku gruźlicy. Słupki błędów = błąd standardowy średniej (n = 18 i 20 powtórzeń dla A i B odpowiednio). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Sabiiti i wsp.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa strzępek grzybów, przedstawiająca ultrastrukturę przy różnych powiększeniach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Mikrografie elektronowe nienaruszonych prątków Mtb po inaktywacji w 95 °C przez 20 min. Podczas badania TEM zaobserwowano nieuszkodzone, wyraźne ściany komórkowe oraz możliwe do policzenia ciałka lipidowe. Góra: obrazy przy niskim powiększeniu grupy komórek, ukazujące niezakłóconą, sznurowatą morfologię prątków oraz wewnątrzkomórkowe ciałka lipidowe. Dół: wysokopowiększenia paneli górnych, rozszerzające widok ciałek lipidowych i ujawniające niektóre mikrostruktury wewnątrzkomórkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obciążenie bakteryjne a TTP w systemie MGIT w ciągu tygodni; wykres liniowy przedstawiający efekty leczenia; dane mikrobiologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60460/60460fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6: Krzywa odpowiedzi na leczenie w ciągu 12 tygodni u pacjenta poddanego terapii przeciwprątkowej, wykazująca odwrotną korelację między mierzonym za pomocą TB-MBLA ładunkiem bakteryjnym a czasem do dodatniego wyniku (TTP) w systemie MGIT. Obciążenie bakteryjne (krzywa niebieska) spada, podczas gdy TTP rośnie (krzywa czerwona) w miarę jak pacjent reaguje na leczenie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60460/60460fig6large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Mieszanina główna (master mix)</td>
			<td>dodatnia reakcja RT</td>
			<td>reakcja kontrolna RT-minus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość na jedną reakcję x liczba reakcji + 5</td>
			<td>Objętość na jedną reakcję x liczba reakcji + 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina Quantitect</td>
			<td>10.0 μL</td>
			<td>10.0 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanina starterów Mtb16S (F + R)</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonda Mtb16S</td>
			<td>0.2 μL</td>
			<td>0.2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanina starterów EC (F + R)</td>
			<td>0.4 μL</td>
			<td>0.4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonda EC</td>
			<td>0.2 μL</td>
			<td>0.2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>enzym RT</td>
			<td>0.2 μL</td>
			<td>-------</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>woda wolna od RNaz</td>
			<td>4.6 μL</td>
			<td>4.8 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>16 µL</td>
			<td>16 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Instrukcja przygotowania master mixu dla qPCR TB-MBLA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Typ</td>
			<td>kanał MTB</td>
			<td>kanał EC</td>
			<td>Interpretacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Ważny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Nieoznaczony</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Ważne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Nieprawidłowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTB + Kontrola</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Ważny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola ekstrakcji (EC)</td>
			<td>Ujemny</td>
			<td>Dodatni</td>
			<td>Ważne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola DNA</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Ważne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola negatywna (NTC)</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Negatywny</td>
			<td>Ważny</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przewodnik po interpretacji wyników TB-MBLA.

Opisujemy test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy przeprowadzony po inaktywacji termicznej plwociny. Inaktywacja termiczna sprawia, że próbki plwociny stają się niezakaźne i eliminuje potrzebę stosowania laboratoriów o poziomie 3 hermetyczności do testów molekularnych na gruźlicę.

Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Ten molekularny test bakteryjny gruźlicy odpowiada na trzy kluczowe pytania. Po pierwsze: Jaka jest skala obciążenia chorobowego pacjenta? Po drugie: W jaki sposób pacjent reaguje na leki przeciwgruźlicze?I po trzecie: Jaki jest związek między obciążeniem chorobą a odpowiedzią na leczenie? Test ten daje ilościowy wynik obciążenia pacjenta gruźlicą i mierzy, jak to obciążenie zmienia się wraz z leczeniem w krótkim czasie. Po zmodyfikowaniu metodologia ta może być stosowana do innych patogenów bakteryjnych.Opracowaliśmy już podobną technologię diagnostyki prątków niegruźliczych oraz bakterii związanych z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc. Wykonując tę technikę po raz pierwszy, obejrzyj film i przećwicz kroki. Bardzo ważne jest, aby ćwiczyć z próbkami, które nie są potrzebne do uzyskania wyników diagnostycznych pacjenta.Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ upraszcza naukę i opanowanie kroków, zwłaszcza tych części metody, które są trudne do wyjaśnienia w tekście. Zacznij od przygotowania kultur komórkowych. Na czystym stole laboratoryjnym lub kabinie klasy pierwszej zbierz jeden mililitr porcji kultury Bacille Calmette-Guerin lub BCG o fazie wykładniczej do 15-mililitrowych plastikowych probówek i szczelnie je zamknij.Przygotowując próbki plwociny pacjenta, pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i postępuj zgodnie ze wskazówkami zawartymi w podręczniku GL One Stop TB. Ostrożnie otwórz pojemnik na próbkę i odpipetuj jedną mililitrową porcję do 15-mililitrowych plastikowych probówek wirówkowych. Następnie szczelnie zamknij rurki.Przenieś probówki z próbkami do stojaka zanurzonego w łaźni wodnej podgrzanej do 95 stopni Celsjusza, upewniając się, że 3/4 każdej probówki jest zanurzone. Gotuj próbki przez 20 minut. Następnie przenieś probówki na ławkę, aby ostygły w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Wykonaj ekstrakcję RNA w dygestorium, jeśli używasz zestawu z fenolem, chloroformem lub etanolem z kapitału nowotworowego. Przedstawiona tutaj procedura RNA to procedura ekstrakcji chloroformu fenolowego. Można jednak również stosować alternatywne metody ekstrakcji RNA.Przenieś jedną mililitrową porcję próbki inaktywowanej termicznie do probówek o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 100 mikrolitrów kontroli ekstrakcji do każdej próbki. Zamknij probówki i wymieszaj je, odwracając trzy razy. Odwirować probówki z prędkością 20 000 g przez 10 minut.Następnie odessać supernatant, pozostawiając 50 mikrolitrów osadu. Zawiesiliśmy osad w 950 mikrolitrach buforu do lizy za pomocą pipetowania i przenosimy całą zawiesinę do probówek z matrycą lizującą dostarczonych z zestawem do ekstrakcji RNA. Szczelnie zamknij rurki i upewnij się, że są oznaczone zarówno na pokrywie, jak i z boku.Następnie homogenizować próbki przez 40 sekund przy 6 000 obr./min. Odwirować lizat z prędkością 12 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj świeże probówki o pojemności jednego mililitra i dodaj 300 mikrolitrów chloroformu.Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra ostrożnie zassać supernatant bez dotykania matrycy lizującej i przenieść go do probówki z chloroformem. Wiruj rurki przez pięć sekund i pozostaw je do osiadania na pięć minut lub do momentu, gdy trzy fazy będą wyraźnie widoczne. Odwirować probówki z prędkością 12 000 g przez pięć minut.Następnie ostrożnie odpipetuj górną fazę i przenieś ją do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego 100% etanolu do próbki, zamknij probówkę i odwróć ją trzy razy, aby wymieszać. Inkubować probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 15 minut lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie załaduj probówki do wstępnie schłodzonej mikrowirówki i wiruj przez 20 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant, dodać 500 mikrolitrów 70% lodowatego etanolu i wirować przez kolejne 10 minut przy 13 000 g. Odrzucić cały supernatant.I inkubuj probówki w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby wysuszyć osad kwasu nukleinowego, upewniając się, że probówki są częściowo otwarte, aby umożliwić odparowanie etanolu. Następnie dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od jądra do osadu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wirować próbkę przez trzy sekundy i kontynuować usuwanie DNA lub przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia.Przygotowany DNA miesza się zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i pipetuje 11 mikrolitrów do każdej probówki zawierającej ekstrakt RNA. Wiruj przez trzy sekundy i krótko wiruj, aby usunąć wszelkie kropelki ze ścianki rurki. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w gorącym bloku lub inkubatorze.Po inkubacji dodaj dodatkowy mikrolitr jednego enzymu DNA bezpośrednio do probówki i dobrze wymieszaj przez wirowanie. Następnie inkubuj probówki przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozmrozić i zwirować odczynnik inaktywacyjny DNA.Następnie dodaj 10 mikrolitrów do każdego ekstraktu RNA. I inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Trzykrotnie zwirować probówki podczas etapu inkubacji.Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 13 000 g przez dwie minuty i ostrożnie przenieś supernatant do wolnej probówki 1,5 mililitra RNA, uważając, aby nie dotknąć żadnej z matrycy inaktywacyjnej. Rozcieńczyć wszystkie nieznane próbki RNA od 1 do 10 w wolnej wodzie RNA, a następnie wymieszać je, wirując przez pięć sekund i krótko obracając je w dół. Rozmrozić próbki MTB i EC-RNA i uzyskać odpowiednio siedmio- i dziesięciokrotne rozcieńczenia dla krzywej wzorcowej.Przygotować wzorcowe mieszanki RT plus i RT minus PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Zmieszaj RT plus i przenieś 16 mikrolitrów do każdej probówki RT plus PCR. Następnie zmieszaj mieszankę RT minus i dodaj 16 mikrolitrów do każdej probówki RT minus PCR.Dodaj cztery mikrolitry ekstraktu RNA lub wody i zduplikuj do probówek RT plus. Woda jest kontrolą bez szablonu lub NTC. Dodaj cztery mikrolitry ekstraktu RNA lub wody do probówek RT minus.Załaduj probówki reakcyjne do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, zaprogramuj reakcję zgodnie z opisem w manuskrypcie i uruchom reakcję. Aby zinterpretować odpowiedź na leczenie, należy użyć krzywej standardowej do przeliczenia wartości CQ na obciążenie bakteryjne i obliczyć odpowiedź jako zmianę obciążenia bakteryjnego w okresie obserwacji leczenia. Spadek obciążenia bakteryjnego po leczeniu oznacza pozytywną odpowiedź, podczas gdy brak zmiany lub wzrost obciążenia bakteryjnego oznacza negatywną odpowiedź.Aby sprawdzić, czy wszystkie pałeczki M. tuberculosis zostały inaktywowane termicznie, zmierzono gęstość optyczną komórek i porównano ją z gęstością żywych komórek. Nie zaobserwowano żadnych zmian OD w czasie dla próbek inaktywowanych termicznie, co wskazuje na brak wzrostu. Próbki inaktywowane termicznie inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu określenia, czy RNA ulega degradacji po inaktywacji termicznej komórek.Nie stwierdzono różnicy między RNA pobranym natychmiast po inaktywacji cieplnej, a RNA wyizolowanym jeden, dwa, trzy i cztery dni później zarówno w hodowlach BCG, jak i plwocinie z dodatnim wynikiem gruźlicy. Gdy enzym A RNA został egzogennie dodany do próbek, przed i po inaktywacji cieplnej, utrata RNA nastąpiła we wszystkich próbkach inaktywowanych termicznie w ciągu czterech dni inkubacji. Wpływ inaktywacji cieplnej na rybosomalne RNA mierzono w kulturach BCG i plwocinie od pacjentów z dodatnim wynikiem gruźlicy.Zmierzone obciążenie bakteryjne kultury kontrolnej było wyższe niż połączone obciążenie bakteryjne kultury inaktywowanej termicznie w temperaturze 80 stopni Celsjusza, 85 stopni Celsjusza i 95 stopni Celsjusza zarówno dla BCG, jak i próbek plwociny. Inaktywacja termiczna próbek powoduje minimalną utratę RNA, pozostawiając odpowiednią ilość RNA do dalszych TB-MBLA i innych dalszych testów molekularnych. Transmisyjna mikroskopia elektronowa została wykorzystana do zbadania, czy komórki uległy lizie w wyniku inaktywacji cieplnej.Oględziny komórek w mniejszym i większym powiększeniu ujawniły nienaruszone ściany komórkowe i widoczne wewnątrzkomórkowe ciała lipidowe. Komórki wydawały się wydłużone, ale nie uległy liżi. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dodaniu kontroli ekstrakcji, która kontroluje wszelkie fałszywie ujemne wyniki z powodu złej ekstrakcji RNA.Podejście to można zastosować do bakterii związanych z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc, zakażeniem prątkami niegruźliczymi i innymi patogenami układu oddechowego. Wyniki ilościowe TB-MBLA umożliwiły modelowanie matematyczne i farmakologiczne reakcji pacjentów na leczenie gruźlicy. Z niecierpliwością czekamy na zastosowanie tej techniki w rutynowej opiece, w której leczoni są pacjenci z gruźlicą.

a-tuberculosis-molecular-bacterial-load-assay-tb-mbla

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy alternatywne podejście do enumeracji prątków in vitro, w którym zamiast jednostek tworzących kolonie (CFU) wykorzystuje się prątki oznakowane genem reporterowym. „Przeżywalność” organizmów oraz markery odpowiedzi gospodarza są mierzone jednocześnie, co zapewnia niskokosztowy, wszechstronny i funkcjonalny system do badań interakcji gospodarz-patogen w kontekście gruźlicy.

Funkcjonalny test z wykorzystaniem krwi pełnej do pomiaru żywotności prątków, z użyciem BCG lub M.Tb znakowanych genem reporterowym (BCG lux/M.Tb lux)

Test Xpert MTB/RIF integruje dekontaminację próbki, obsługę bezdotykową, pokładowe przetwarzanie próbki oraz ultrasensytywną hemi-zagnieżdżoną reakcję PCR w celu jednoczesnego wykrywania Mycobacterium tuberculosis oraz oporności na ryfampicynę, zarówno w odkrztuszonej plwocinie, jak i w zagęszczonych osadach z plwociny, w czasie około dwóch godzin. Badanie jest zestandaryzowane i wymaga jedynie umiarkowanej infrastruktury laboratoryjnej oraz przeszkolenia.

Diagnostyka gruźlicy płuc za pomocą testu Xpert MTB/RIF

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

Mikrodysekcja jest szeroko stosowana do badania DNA, RNA i białek w tkance.   Mikroskopia laserowa (LCM) jest najczęściej stosowaną metodą, ale od niedawna dostępna jest nowa technika mielenia, mezodysekcja.  Pokazujemy ekstrakcję RNA z mezorozpreparowanych szkiełek tkankowych zatopionych w parafinie w formalinie ziarniniaków Mycobacterium tuberculosis.

Nowatorskie podejście do mikrodysekcji w celu odzyskania specyficznych transkryptów Mycobacterium tuberculosis z ziarniniaków płuc zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Poznaj test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy z nieaktywowanym uprzednio plwocinowym materiałem biologicznym. Ta metoda umożliwia bezpieczne i skuteczne monitorowanie odpowiedzi na leczenie.

Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)

Przeglądaj więcej filmów