Test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy (TB-MBLA)
30 kwietnia 2020
Opisujemy test molekularnego obciążenia bakteryjnego gruźlicy przeprowadzony po inaktywacji termicznej plwociny. Inaktywacja termiczna sprawia, że próbki plwociny stają się niezakaźne i eliminuje potrzebę stosowania laboratoriów o poziomie 3 hermetyczności do testów molekularnych na gruźlicę.
Ten molekularny test bakteryjny gruźlicy odpowiada na trzy kluczowe pytania. Po pierwsze: Jaka jest skala obciążenia chorobowego pacjenta? Po drugie: W jaki sposób pacjent reaguje na leki przeciwgruźlicze?
I po trzecie: Jaki jest związek między obciążeniem chorobą a odpowiedzią na leczenie? Test ten daje ilościowy wynik obciążenia pacjenta gruźlicą i mierzy, jak to obciążenie zmienia się wraz z leczeniem w krótkim czasie. Po zmodyfikowaniu metodologia ta może być stosowana do innych patogenów bakteryjnych.
Opracowaliśmy już podobną technologię diagnostyki prątków niegruźliczych oraz bakterii związanych z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc. Wykonując tę technikę po raz pierwszy, obejrzyj film i przećwicz kroki. Bardzo ważne jest, aby ćwiczyć z próbkami, które nie są potrzebne do uzyskania wyników diagnostycznych pacjenta.
Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ upraszcza naukę i opanowanie kroków, zwłaszcza tych części metody, które są trudne do wyjaśnienia w tekście. Zacznij od przygotowania kultur komórkowych. Na czystym stole laboratoryjnym lub kabinie klasy pierwszej zbierz jeden mililitr porcji kultury Bacille Calmette-Guerin lub BCG o fazie wykładniczej do 15-mililitrowych plastikowych probówek i szczelnie je zamknij.
Przygotowując próbki plwociny pacjenta, pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i postępuj zgodnie ze wskazówkami zawartymi w podręczniku GL One Stop TB. Ostrożnie otwórz pojemnik na próbkę i odpipetuj jedną mililitrową porcję do 15-mililitrowych plastikowych probówek wirówkowych. Następnie szczelnie zamknij rurki.
Przenieś probówki z próbkami do stojaka zanurzonego w łaźni wodnej podgrzanej do 95 stopni Celsjusza, upewniając się, że 3/4 każdej probówki jest zanurzone. Gotuj próbki przez 20 minut. Następnie przenieś probówki na ławkę, aby ostygły w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Wykonaj ekstrakcję RNA w dygestorium, jeśli używasz zestawu z fenolem, chloroformem lub etanolem z kapitału nowotworowego. Przedstawiona tutaj procedura RNA to procedura ekstrakcji chloroformu fenolowego. Można jednak również stosować alternatywne metody ekstrakcji RNA.
Przenieś jedną mililitrową porcję próbki inaktywowanej termicznie do probówek o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 100 mikrolitrów kontroli ekstrakcji do każdej próbki. Zamknij probówki i wymieszaj je, odwracając trzy razy. Odwirować probówki z prędkością 20 000 g przez 10 minut.
Następnie odessać supernatant, pozostawiając 50 mikrolitrów osadu. Zawiesiliśmy osad w 950 mikrolitrach buforu do lizy za pomocą pipetowania i przenosimy całą zawiesinę do probówek z matrycą lizującą dostarczonych z zestawem do ekstrakcji RNA. Szczelnie zamknij rurki i upewnij się, że są oznaczone zarówno na pokrywie, jak i z boku.
Następnie homogenizować próbki przez 40 sekund przy 6 000 obr./min. Odwirować lizat z prędkością 12 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj świeże probówki o pojemności jednego mililitra i dodaj 300 mikrolitrów chloroformu.
Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra ostrożnie zassać supernatant bez dotykania matrycy lizującej i przenieść go do probówki z chloroformem. Wiruj rurki przez pięć sekund i pozostaw je do osiadania na pięć minut lub do momentu, gdy trzy fazy będą wyraźnie widoczne. Odwirować probówki z prędkością 12 000 g przez pięć minut.
Następnie ostrożnie odpipetuj górną fazę i przenieś ją do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego 100% etanolu do próbki, zamknij probówkę i odwróć ją trzy razy, aby wymieszać. Inkubować probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 15 minut lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie załaduj probówki do wstępnie schłodzonej mikrowirówki i wiruj przez 20 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant, dodać 500 mikrolitrów 70% lodowatego etanolu i wirować przez kolejne 10 minut przy 13 000 g. Odrzucić cały supernatant.
I inkubuj probówki w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby wysuszyć osad kwasu nukleinowego, upewniając się, że probówki są częściowo otwarte, aby umożliwić odparowanie etanolu. Następnie dodaj 100 mikrolitrów wody wolnej od jądra do osadu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wirować próbkę przez trzy sekundy i kontynuować usuwanie DNA lub przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia.
Przygotowany DNA miesza się zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i pipetuje 11 mikrolitrów do każdej probówki zawierającej ekstrakt RNA. Wiruj przez trzy sekundy i krótko wiruj, aby usunąć wszelkie kropelki ze ścianki rurki. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w gorącym bloku lub inkubatorze.
Po inkubacji dodaj dodatkowy mikrolitr jednego enzymu DNA bezpośrednio do probówki i dobrze wymieszaj przez wirowanie. Następnie inkubuj probówki przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozmrozić i zwirować odczynnik inaktywacyjny DNA.
Następnie dodaj 10 mikrolitrów do każdego ekstraktu RNA. I inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Trzykrotnie zwirować probówki podczas etapu inkubacji.
Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 13 000 g przez dwie minuty i ostrożnie przenieś supernatant do wolnej probówki 1,5 mililitra RNA, uważając, aby nie dotknąć żadnej z matrycy inaktywacyjnej. Rozcieńczyć wszystkie nieznane próbki RNA od 1 do 10 w wolnej wodzie RNA, a następnie wymieszać je, wirując przez pięć sekund i krótko obracając je w dół. Rozmrozić próbki MTB i EC-RNA i uzyskać odpowiednio siedmio- i dziesięciokrotne rozcieńczenia dla krzywej wzorcowej.
Przygotować wzorcowe mieszanki RT plus i RT minus PCR zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Zmieszaj RT plus i przenieś 16 mikrolitrów do każdej probówki RT plus PCR. Następnie zmieszaj mieszankę RT minus i dodaj 16 mikrolitrów do każdej probówki RT minus PCR.
Dodaj cztery mikrolitry ekstraktu RNA lub wody i zduplikuj do probówek RT plus. Woda jest kontrolą bez szablonu lub NTC. Dodaj cztery mikrolitry ekstraktu RNA lub wody do probówek RT minus.
Załaduj probówki reakcyjne do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, zaprogramuj reakcję zgodnie z opisem w manuskrypcie i uruchom reakcję. Aby zinterpretować odpowiedź na leczenie, należy użyć krzywej standardowej do przeliczenia wartości CQ na obciążenie bakteryjne i obliczyć odpowiedź jako zmianę obciążenia bakteryjnego w okresie obserwacji leczenia. Spadek obciążenia bakteryjnego po leczeniu oznacza pozytywną odpowiedź, podczas gdy brak zmiany lub wzrost obciążenia bakteryjnego oznacza negatywną odpowiedź.
Aby sprawdzić, czy wszystkie pałeczki M. tuberculosis zostały inaktywowane termicznie, zmierzono gęstość optyczną komórek i porównano ją z gęstością żywych komórek. Nie zaobserwowano żadnych zmian OD w czasie dla próbek inaktywowanych termicznie, co wskazuje na brak wzrostu. Próbki inaktywowane termicznie inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu określenia, czy RNA ulega degradacji po inaktywacji termicznej komórek.
Nie stwierdzono różnicy między RNA pobranym natychmiast po inaktywacji cieplnej, a RNA wyizolowanym jeden, dwa, trzy i cztery dni później zarówno w hodowlach BCG, jak i plwocinie z dodatnim wynikiem gruźlicy. Gdy enzym A RNA został egzogennie dodany do próbek, przed i po inaktywacji cieplnej, utrata RNA nastąpiła we wszystkich próbkach inaktywowanych termicznie w ciągu czterech dni inkubacji. Wpływ inaktywacji cieplnej na rybosomalne RNA mierzono w kulturach BCG i plwocinie od pacjentów z dodatnim wynikiem gruźlicy.
Zmierzone obciążenie bakteryjne kultury kontrolnej było wyższe niż połączone obciążenie bakteryjne kultury inaktywowanej termicznie w temperaturze 80 stopni Celsjusza, 85 stopni Celsjusza i 95 stopni Celsjusza zarówno dla BCG, jak i próbek plwociny. Inaktywacja termiczna próbek powoduje minimalną utratę RNA, pozostawiając odpowiednią ilość RNA do dalszych TB-MBLA i innych dalszych testów molekularnych. Transmisyjna mikroskopia elektronowa została wykorzystana do zbadania, czy komórki uległy lizie w wyniku inaktywacji cieplnej.
Oględziny komórek w mniejszym i większym powiększeniu ujawniły nienaruszone ściany komórkowe i widoczne wewnątrzkomórkowe ciała lipidowe. Komórki wydawały się wydłużone, ale nie uległy liżi. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dodaniu kontroli ekstrakcji, która kontroluje wszelkie fałszywie ujemne wyniki z powodu złej ekstrakcji RNA.
Podejście to można zastosować do bakterii związanych z przewlekłą obturacyjną chorobą płuc, zakażeniem prątkami niegruźliczymi i innymi patogenami układu oddechowego. Wyniki ilościowe TB-MBLA umożliwiły modelowanie matematyczne i farmakologiczne reakcji pacjentów na leczenie gruźlicy. Z niecierpliwością czekamy na zastosowanie tej techniki w rutynowej opiece, w której leczoni są pacjenci z gruźlicą.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje test molekularnego oznaczenia ładunku bakteryjnego prątków gruźlicy, przeprowadzany po inaktywacji termicznej próbek plwociny. Metoda ta sprawia, że próbki przestają być zakaźne, co umożliwia bezpieczniejsze badanie bez konieczności korzystania z laboratoriów o wysokim stopniu zabezpieczenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Choroby zakaźne
- Metody diagnostyczne
Wstęp
- Gruźlica stanowi istotny problem zdrowotny w skali globalnej.
- Dokładny pomiar ładunku bakteryjnego jest kluczowy dla monitorowania leczenia.
- Tradycyjne metody wymagają wysokiego poziomu zabezpieczeń ze względu na zakaźność próbek.
- Inaktywacja termiczna stanowi bezpieczniejszą alternatywę w zakresie obróbki próbek.
Cel badania
- Opracowanie bezpiecznego i skutecznego testu do pomiaru miana bakterii prątków gruźlicy.
- Ocena obciążenia chorobą u pacjenta oraz odpowiedzi na leczenie.
- Dostarczenie metodologii możliwej do zastosowania w odniesieniu do innych patogenów bakteryjnych.
Zastosowane metody
- Inaktywacja termiczna próbek plwociny w temperaturze 95 °C.
- Ekstrakcja RNA z użyciem fenolu i chloroformu lub metod alternatywnych.
- Real-time PCR w celu kwantyfikacji ładunku bakteryjnego.
- Przygotowanie krzywej standardowej dla zapewnienia dokładnego pomiaru.
Główne wyniki
- Analiza pozwala na uzyskanie ilościowych wyników obciążenia organizmu gruźlicą.
- Skutecznie mierzy ona zmiany w ładunku bakteryjnym podczas leczenia.
- Metodologię tę można dostosować do innych infekcji bakteryjnych.
- Demonstracje wizualne wspomagają naukę i opanowanie techniki.
Wnioski
- Opracowany test stanowi bezpieczną alternatywę dla diagnostyki gruźlicy.
- Umożliwia on efektywne monitorowanie odpowiedzi na leczenie.
- Istnieje potencjał do szerszego zastosowania w diagnostyce innych patogenów bakteryjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
TB-MBLA zapewnia ilościową metodę opartą na RT-qPCR do pomiaru miana prątków Mycobacterium tuberculosis w próbkach plwociny, co umożliwia obiektywną ocenę obciążenia chorobowego oraz odpowiedzi na leczenie. Dzięki zastosowaniu inaktywacji termicznej test pozwala na bezpieczną pracę z próbkami zakaźnymi poza laboratoriami o wysokim stopniu zabezpieczenia, co wspiera szersze zastosowanie w badaniach podstawowych i translacyjnych. Możliwość ta wspomaga walidację celów terapeutycznych oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w rozwoju leków przeciwinfekcyjnych poprzez dostarczanie powtarzalnych i mierzalnych biomarkerów obciążenia patogenem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację zmian w ładunku bakteryjnym jako bezpośredniego odczytu zaangażowania celu i skuteczności leku.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zstandaryzowany, powtarzalny pomiar obciążenia patogenem, który wspiera decyzje typu go/no-go w procesie optymalizacji wiodących związków.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów zmiennej zależnej (eCFU/mL) za pomocą wartości Cq i krzywych standardowych, co umożliwia analizy zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego w badaniach przesiewowych przeciwdrobnoustrojowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skalowalne, kompatybilne z analizą wysokoprzepustową odczyty po ekstrakcji RNA i RT-qPCR, co wspiera standaryzację testów w obrębie bibliotek związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera systemy istotne z punktu widzenia chorób poprzez pomiar obciążenia bakteryjnego w klinicznie istotnych macierzach (plwocinach), łącząc wyniki in vitro z dynamiką patogenów ex vivo.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, dostarczając spójnego biomarkera odpowiedzi na leczenie w różnych fazach badania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda TB-MBLA wpisuje się w proces badawczy, rozciągający się od wczesnego testowania hipotez po przedkliniczną ocenę skuteczności, w którym ilościowe oznaczenie ładunku patogenu stanowi mechanistyczny pomost między ekspozycją na związek a wynikiem biologicznym.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez pomiar ładunku bakteryjnego jako funkcjonalnego odczytu aktywności przeciwprątkowej.
- Przesiewy: Umożliwia przygotowanie testów poprzez standaryzowane procedury ekstrakcji RNA i RT-qPCR, które zapewniają ilościowe, powtarzalne wyniki do oceny związków.
- Analityka: Generuje wartości Cq oraz pomiary eCFU/mL wyznaczone na podstawie krzywej wzorcowej, co pozwala na porównywanie różnych warunków oraz analizę statystyczną efektów leczenia.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wykorzystanie próbek pochodzących z plwociny w celu odzwierciedlenia klinicznie istotnego obciążenia bakteryjnego, wspierając decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi możliwość wielokrotnego wykorzystania metody ilościowego oznaczania ładunku bakteryjnego dla różnych patogenów, z wykazaną przydatnością w przypadku prątków niegruźliczych oraz bakterii związanych z COPD.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez ilościowy, mechanistycznie powiązany biomarker obciążenia bakteryjnego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i skalowalność dzięki inaktywacji termicznej, standaryzowanej ekstrakcji RNA oraz RT-qPCR z wewnętrznymi kontrolami ekstrakcji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne, oparte na danych decyzje go/no-go w oparciu o mierzalne zmiany ładunku patogenów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczenie biomarkera translacyjnego, który koreluje z odpowiedzią na leczenie w fazach odkrywania i etapach przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu molekularnego bezpieczeństwa biologicznego, obchodzenia się z RNA oraz procedur RT-qPCR w celu zarządzania etapami inaktywacji termicznej i ekstrakcji.
- Zależne od dostępu do aparatury do PCR w czasie rzeczywistym, chłodni do przechowywania odczynników oraz pomieszczeń laboratoryjnych zgodnych z zasadami bezpieczeństwa biologicznego do wstępnego przetwarzania próbek.
- Konieczna jest standaryzacja ekstrakcji RNA i stosowania kontroli inhibicji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnych wyników w różnych ośrodkach.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu testu w odniesieniu do różnych typów próbek lub patogenów bakteryjnych poza Mtb.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak strata RNA rzędu <60% log10 eCFU/mL w wyniku lizy wywołanej inaktywacją termiczną, co może wpływać na czułość w próbkach o niskim obciążeniu bakteryjnym.
