Name: Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę hodowli komórkowej na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyki do nanoanalizy fluorescencji rentgenowskiej. Technika ta umożliwia zachowanie struktury komórek i analizę dystrybucji pierwiastków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty na linii badawczej ID16A zostały przeprowadzone w ramach propozycji ESRF LS2430, LS2303 i LS2765.

<ol><li>Lewis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+synchrotron+nanoimaging+and+DNA+damage%2Fgenotoxicity+screening+of+novel+lanthanide-coated+nanovectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors.</a> Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).</li>
<li>Fus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+localization+of+osmocenyl-tamoxifen+derivatives+in+hormone-independent+breast+cancer+cells+revealed+by+2D+and+3D+nano+X-ray+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angwendte+Chemie%22%5BJournal%5D)">The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging.</a> Angwendte Chemie. , (2019).</li>
<li>Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJanssens%2C+K+%22Microscopic+X-Ray+Fluorescence+Analysis%22">Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis</a>. , Wiley. Chichester, UK. (2000).</li>
<li>Carmona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+exposure+of+human+dopaminergic+cells+results+in+low+cytotoxicity%2C+accumulation+within+sub-cytoplasmic+regions%2C+and+down+regulation+of+MAO-B%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B.</a> Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).</li>
<li>Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+low+calcium+concentrations+in+cryosectioned+cells+by+parallel-EELS+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping.</a> Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).</li>
<li>Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+scanning+electron+microscopy+to+X-ray+analysis+of+frozen+hydrated+sections.+I.+Specimen+handling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques.</a> Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).</li>
<li>Saubermann, A. J., Heyman, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+digital+X-ray+imaging+using+frozen+hydrated+and+frozen+dried+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections.</a> Journal of Microscopy. 146, Pt2 169-182 (1987).</li>
<li>Wroblewski, J., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microanalysis+of+single+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">X-ray microanalysis of single and cultured cells.</a> Scanning Electron Microscopy. , Pt 4 1875-1882 (1984).</li>
<li>Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+X-ray+microanalysis+of+semi-thick+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections.</a> Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).</li>
<li>Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreparation+of+mammalian+tissue+for+X-ray+microanalysis+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM.</a> Journal of Microscopy. 125, Pt2 149-156 (1982).</li>
<li>Harkiolaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-soft+X-ray+tomography%3A+Using+soft+X-rays+to+explore+the+ultrastructure+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).</li>
<li>McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+and+cryogenic+light+microscopy%3A+the+cool+combination+in+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).</li>
<li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).</li>
<li>Sorrentino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MISTRAL%3A+a+transmission+soft+X-ray+microscopy+beamline+for+cryo+nano-tomography+of+biological+samples+and+magnetic+domains+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).</li>
<li>Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarzaniga%2C+R+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 124, Academic Press. 151-175 (2014).</li>
<li>Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+single+cell+quantitative+elemental+imaging+using+proton+or+synchrotron+radiation+focused+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Atomic+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserving+elemental+content+in+adherent+mammalian+cells+for+analysis+by+synchrotron-based+x-ray+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).</li>
<li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+manganese+on+primary+hippocampal+neurons+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents.</a> Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).</li>
<li>Daoust, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+Cytotoxicity+Assay+on+Hippocampal+Neuronal+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture.</a> Bio-protocol. 5 (1), 1368(2015).</li>
<li>Gibon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+over-expression+of+TRPC6+channels+in+HEK-293+cells+favours+the+intracellular+accumulation+of+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).</li>
<li>Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Uptake+and+Storage+During+the+Formation+of+the+Cerebral+Cortex+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice.</a> Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).</li>
<li>Villar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopositioning+for+the+ESRF+ID16A+Nano-Imaging+Beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Synchrotron+Radiation+News%22%5BJournal%5D)">Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline.</a> Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).</li>
<li>Kosior, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+hard+X-ray+phase+contrast+imaging+and+X-ray+fluorescence+microscopy+for+subcellular+metal+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification.</a> Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).</li>
<li>Bohic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrotron+hard+X-ray+microprobe%3A+fluorescence+imaging+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells.</a> Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Development+of+Electron+Cryo-Microscopy+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angwendte+Chemie%22%5BJournal%5D)">On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture).</a> Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).</li>
<li>Da Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+concentration+of+high-energy+X-rays+for+diffraction-limited+imaging+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution.</a> Optica. 4 (5), 492-495 (2017).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high-pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>Moor, H. Theory and pratice of high pressure freezing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoor%2C+H+%22Cryotechniques+in+Biological+Electron+Microscopy%22">Cryotechniques in Biological Electron Microscopy</a>. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. 175-191 (1987).</li>
<li>Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy+Techniques%22%5BJournal%5D)">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).</li>
<li>Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. Electron Cryo-Tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+JL+%22Cellular+Imaging%22">Cellular Imaging</a>. , Springer, Cham. 61-94 (2018).</li>
<li>Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+metal+content+and+intracellular+distribution+in+primary+hippocampal+neurons+with+synchrotron+X-ray+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence.</a> PLoS One. 11 (7), 0159582(2016).</li>
<li>Vavpetič, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+distribution+and+sample+integrity+comparison+of+freeze-dried+and+frozen-hydrated+biological+tissue+samples+with+nuclear+microprobe%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research+Section+B%3A+Beam+Interactions+with+Materials+and+Atoms%22%5BJournal%5D)">Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).</li>
<li>Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuerquin-Kern%2C+JL+%22Handbook+of+Cryo-Preparation+Methods+for+Electron+Microscopy%22">Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy</a>. , CRC Press. 499-536 (2008).</li>
<li>Gramaccioni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+quantification+of+intracellular+element+concentration+by+X-ray+fluorescence+microscopy+combined+with+X-ray+phase+contrast+nanotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography.</a> Applied Physics Letters. 112 (5), 053701(2018).</li>
<li>Perrin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+and+Copper+Effects+on+Stability+of+Tubulin+and+Actin+Networks+in+Dendrites+and+Spines+of+Hippocampal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons.</a> ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).</li>
<li>Ortega, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-synuclein+over-expression+induces+increased+iron+accumulation+and+redistribution+in+iron-exposed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons.</a> Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).</li>
<li>Fartmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+atomic+and+molecular+species+in+cancer+cultures+with+TOF-SIMS+and+Laser-SNMS%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS.</a> Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).</li>
<li>Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+freeze-substitution+techniques+for+X-ray+microanalysis+of+biological+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Techniques%22%5BJournal%5D)">Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue.</a> Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM) zdobyła Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 2017 r. i jako taka opracowanie J. Dubocheta w zakresie witryfikacji materiału biologicznego do wysokorozdzielczego oznaczania struktury biomolekuł w roztworze25. Jak pisze Dubochet w swoim wykładzie noblowskim "Wiedza o tym, jak zeszkleić kroplę wody, to jedno, a przygotowanie próbki biologicznej do obserwacji biologicznej to drugie"25. Etapy kriopreparacji są obecnie uważane za standardową technikę łagodzenia uszkodzeń spowodowanych dawką promieniowania i badania komórek w pobliżu ich naturalnego stanu. Przygotowania pozostają jednak żmudne. Dzieje się tak, ponieważ mikroskopia elektronowa, ze względu na niezrównaną rozdzielczość przestrzenną, jest wrażliwa na wszelkie artefakty ultrastrukturalne, które pojawiają się podczas przygotowywania próbki. Synchrotronowe krionanosondy zbliżają się obecnie do podobnych trudności, schodząc do rozdzielczości przestrzennej tak niskiej jak 13 nm w zakresie wysokoenergetycznego promieniowania rentgenowskiego26. Twarda mikroskopia rentgenowska może analizować całe komórki, podczas gdy mikroskopia elektronowa cierpi z powodu słabej głębokości penetracji elektronów, co pozwala na obserwację tylko bardzo cienkich wycinków komórek.
Monowarstwy komórek są na tyle cienkie, że poprzez zamrażanie wgłębne w ciekłym etanie osiąga się wymagane szybkości chłodzenia do witryfikacji wody. Teoretycznie szybkość chłodzenia do 108 K/s jest możliwa przy użyciu zamrażaniawysokociśnieniowego 27, co umożliwia witryfikację próbek zbyt grubych do zamrażania wgłębnego. Szybkość chłodzenia 105 K/s, wymagana do umożliwienia pełnej zeszklenia próbki pod ciśnieniemotoczenia 28, jest osiągana w sposób powtarzalny przy użyciu automatycznej maszyny do zamrażania wgłębnego i przedstawionych tutaj parametrów. Pozwala to badaczowi na zeszklenie cienkich próbek biologicznych (<10 μm), takich jak monowarstwa komórek 12,13,14,15,29,30 poprzez zamrażanie wgłębne w ciekłym etanie.
Ważnym wyzwaniem związanym z tym protokołem jest również zachowanie w jak największym stopniu integralności chemicznej zawartości wewnątrzkomórkowej, aby zapewnić niezawodne rozmieszczenie pierwiastków w komórce w 2D lub 3D. Jak opublikowano w innym miejscu 2,16,17,31, w przypadku obrazowania pierwiastkowego na poziomie subkomórkowym należy rozważyć analizę zamrożonych uwodnionych komórek. W przeciwnym razie do analizy temperatury pokojowej można zastosować kombinację zamrażania wgłębnego i liofilizacji komórek. W tym drugim przypadku amorficzny lód jest usuwany w procesie sublimacji, podczas gdy związane cząsteczki wody są usuwane w procesie desorpcji. Proces ten może być daleki od ideału w porównaniu z zamrożonymi uwodnionymi próbkami ze względu na możliwe zmiany błon komórkowych i morfologii niektórych struktur subkomórkowych32. Również w przypadku badań specjacyjnych ekstrakcja wody może prowadzić do artefaktów specjacji metali. Mimo to okazał się sukcesem i stanowi najlepszą alternatywę dla mrożonych uwodnionych próbek do obrazowania pierwiastków na poziomach poniżej 100 nm 2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Jak donoszono37, jakość kriokonserwowanych preparatów komórkowych można ocenić za pomocą stosunku K/Na potasu do sodu. Niestety, nie można go jeszcze określić za pomocą zastosowanej tutaj twardej nanosondy rentgenowskiej, ze względu na niską energię odcięcia krzemowego detektora dryfu używanego do wykrywania fotonów fluorescencji rentgenowskiej pierwiastków (E ≥ 1,3 keV magnezu). Rzeczywiście, wysoki stosunek K/Na (>10), który można zmierzyć za pomocą TOF-SIMS, EPMA lub mikrosondy jądrowej PIXE16,37, wskazuje na zachowaną integralność chemiczną ogniwa w porównaniu z oczekiwanym K/Na wynoszącym 25 w żywej komórce37. Może to być wspierane przez jednocześnie niski współczynnik Cl/K38. Mimo to niedoskonała witryfikacja, szczególnie jeśli prędkość schładzania próbki jest zbyt niska, może prowadzić do tworzenia się dużych kryształków lodu, które mogą uszkadzać błony komórkowe i organelle, w konsekwencji zmieniając rozkład pierwiastków chemicznych. Chociaż nie ma rutynowej procedury monitorowania tego potencjalnego uszkodzenia i wpływu na dystrybucję wewnątrzkomórkową, powyższe proporcje pierwiastków i możliwość obrazowania komórki w wysokiej rozdzielczości za pomocą kontrastu fazowego promieniowania rentgenowskiego lub kriomiękkiej mikroskopii rentgenowskiej mogą być najlepszymi podejściami do wspierania dobrego zachowania przedziałów wewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu integralności pierwiastkowej. Połączenie tych technik i zastosowanie nowo opracowanych kriokorelacyjnych fluorescencyjnych mikroskopów optycznych pomoże ocenić, w jakim stopniu dochodzi do tego uszkodzenia i wpływa na wewnątrzkomórkowy rozkład pierwiastków.
Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiono szczegółowy i kompleksowy protokół przygotowania próbek komórkowych do nanoanalizy fluorescencji synchrotronowej rentgenowskiej. Jest to dobry punkt wyjścia dla środowiska naukowego, pomagający rozwiązać trudną kwestię, jak przygotować odpowiednie próbki komórkowe do obrazowania pierwiastków 2D i 3D za pomocą (krio)twardych nanosond rentgenowskich. Podejścia te można połączyć z możliwościami fluorescencji optycznej i mikroskopii elektronowej w celu uzyskania dogłębnego korelacyjnego obrazowania chemicznego i strukturalnego komórek.

Nowo zaprojektowane nanosondy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej (SR-XRF) umożliwiają wizualizację subkomórkowego rozkładu pierwiastków w sposób w pełni ilościowy. Na przykład ta zdolność analityczna umożliwia badanie absorpcji nanocząstek1 lub cząsteczek metaloorganicznych, takich jak kompleksy na bazie osmu2, zapewniając wgląd w wewnątrzkomórkowy wychwyt cząsteczek na bazie metali o silnych właściwościach przeciwnowotworowych. Jako technika wielopierwiastkowa, SR-XRF3 z nanosondą umożliwia jednoczesne ilościowe i lokalizowanie wewnątrzkomórkowo najważniejszych biologicznie pierwiastków, w tym fosforu, siarki, potasu, wapnia, żelaza, miedzi i. Rzeczywiście, zastosowanie twardego promieniowania rentgenowskiego zapewnia dużą głębokość penetracji w celu zobrazowania całych zamrożonych, uwodnionych komórek w sposób bezznacznikowy. Ponadto, zapewniając dostęp do krawędzi K większości interesujących elementów, fluorescencja promieniowania rentgenowskiego jest wzbudzana najbardziej efektywnie. Zastosowanie metod kriogenicznych pozwala na zmniejszenie uszkodzeń radiacyjnych oraz optymalizację zachowania struktury komórkowej i rozmieszczenia pierwiastków.
Większość dostępnych technik analitycznych w rozdzielczości przestrzennej do badania metali w komórkach to techniki powierzchniowe, które wymagają bardzo cienkich i płaskich odcinków komórek. Obejmuje to głównie skaningową transmisyjną mikroskopię elektronową z analizą rentgenowską z dyspersją energii (STEM-EDX), transmisyjną mikroskopią elektronową z filtrem energii (EF-TEM) oraz nanoskalową spektrometrię mas jonów wtórnych (nanoSIMS). Tej ostatniej nie można przeprowadzić na zamrożonych, uwodnionych skrawkach komórek, podczas gdy krioanalizę można przeprowadzić za pomocą mikroskopii elektronowej o niezrównanej rozdzielczości przestrzennej, ale słabej czułości pierwiastkowej. Emisja promieniowania rentgenowskiego indukowana cząstkami (PIXE) pozwoliła na badanie rozkładów pierwiastków w całych komórkach. Ma tę zaletę, że jest w pełni ilościowy z dobrą czułością pierwiastkową w skali mikronowej, a nawet w rozdzielczości submikronowej4, ale cierpi z powodu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i braku zdolności kriogenicznych do badania zamrożonych i uwodnionych komórek. Wszystkie te techniki analityczne uzupełniają się nawzajem w obrazowaniu pierwiastkowym komórek, ale w przypadku wszystkich technik procedura przygotowania próbki jest kluczowym krokiem. Powinien być prosty, aby ograniczyć możliwe zanieczyszczenie, a także redystrybucję pierwiastków i/lub wyciek, aby uzyskać miarodajne wyniki. Jak wykazano w mikroskopii elektronowej, kriogeniczny przebieg pracy, w tym kriounieruchomienie komórki i kriotransfer do etapu krioskanowania, pozwala na optymalne zachowanie pierwiastków na poziomie subkomórkowym jak najbardziej zbliżonym do stanu natywnego5,6,7,8,9,10. Wiedza ta została z powodzeniem wykorzystana do rozwoju synchrotronowej kriomiękkiej mikroskopii rentgenowskiej (np. mikroskopów pełnopolowych i mikroskopów skaningowych) w celu uzyskania ultrastrukturalnego obrazowania całych zamrożonych i uwodnionych komórek w 2D lub 3D. Opracowano różne kriogeniczne procesy pracy11 dla miękkich mikroskopów rentgenowskich na linii badawczej 2.1 (XM-2) zaawansowanego źródła światła w Lawrence Berkeley National Laboratory12, linia badawcza U41-XM w pierścieniu magazynowania elektronów BESSY II (Niemcy)13, linia MISTRAL źródła światła ALBA (Hiszpania)14, oraz na linii B24 diamentowego źródła światła15, między innymi. Niedawno wykazano, że podobny przebieg pracy jest najbardziej niezawodną metodą przygotowania i konserwacji wewnątrzkomórkowej analizy pierwiastkowej przy użyciu mikrosond rentgenowskich16,17.
Chociaż techniki nanosond rentgenowskich zaczynają być szeroko stosowane do analizy pierwiastków komórkowych, szczególnie wraz z pojawieniem się możliwości kriogenicznych SR-XRF, żaden protokół krokowy nie został jak dotąd rozpowszechniony wśród społeczności naukowej. W tym miejscu przedstawiono szczegółową procedurę przygotowania kriofiksowanych komórek adherentnych hodowanych jako monowarstwy na membranach z azotku krzemu do analizy w warunkach kriogenicznych. Przewidziano również etap liofilizacji, który należy zastosować po protokole, w przypadku gdy analiza rentgenowska musi być przeprowadzona w temperaturze pokojowej. Chociaż proponowany protokół został z powodzeniem zastosowany w przypadku ludzkich komórek raka piersi MD-MB-2312, a liofilizację zademonstrowano m.in. na mysich neuronach18,20,21, można go łatwo rozszerzyć na różne typy komórek ludzkich lub zwierzęcych.

<table><tbody><tr><td>Roztwór octanu amonu, BioUltra, do biologii molekularnej, ~5M w H2O</td><td>SIGMA</td><td>09691-250mL</td><td>Wymagany roztwór można przygotować z wysokiej jakości proszku octanu amonu i ultraczystej wody, pH i osmolarność i tak należy dostosować.</td></tr><tr><td>Suplement B27, 50x</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>do hodowli neuronów hipokampa</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DMEM z czerwienią fenolową/Glutamax I (pożywka modyfikacja ATCC)</td><td>GIBCO</td><td>21885025</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>31966-02</td><td>do hodowli neuronów hipokampa</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #5, prosta samozamykająca, końcówki 0,05x0,01mm,</td><td>precyzyjny instrument</td> Biology World <td>501202</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K750X Chłodzony Peltierem Liofilizator Quorum</td><td>Technology</td><td>EK3147</td><td></td></tr><tr><td>Etan N45</td><td>Ciecz powietrzna</td><td>p0505s05r0a001</td><td>C2H6 > 99,995 % </td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, Performance Plus, certyfikowany format One Shot, pochodzenie z USA</td><td>GIBCO</td><td>A31604-02</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>do hodowli neuronów hipokampa</td></tr><tr><td>Kleszczyki Leica GP z szybkozłączką</td><td>Linia</td><td></td> komórkowa MDA-MB-231 16706435 <td></td></tr><tr><td>nabłonkowa, ludzka komórka raka piersi gruczolakoraka</td><td>ATCC ATCC</td><td> Hodowla komórkowa HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>do hodowli neuronów hipokampa</td></tr><tr><td>Hodowla</td><td>komórkowa</td><td>Nunc 4-dołkowa Thermo</td> Fisher <td>176740</td></tr><tr><td>Mikroosmometr Osmo1 z pojedynczą próbką</td><td>Zaawansowane instrumenty</td><td>Alternatywa Osmo1</td><td>można znaleźć w Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO&reg; Osmometr ciśnienia pary)</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>Można zastosować inny rodzaj powłoki, który jest zależny od typu komórki, która ma być hodowana na membranie, można odpowiednio przetestować inne czynniki adhezji, takie jak fibronektyna, kolagen, poliornityna. Komórka może być hodowana bezpośrednio na membranie z azotku krzemu, ale te ostatnie są lekko hydrofobowe i zalecane są współczynniki adhezji, chyba że membrana jest przetwarzana na hydrofilową (wyładowywana plazma jarzeniowa).</td></tr><tr><td>Robot do zamrażania wgłębnego Jednostka główna Leica EM GP</td><td>Leica</td><td>16706401</td><td>Alternatywą dla automatycznego tłoka są Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Można użyć ręcznego systemu domowej roboty, ale komora z kontrolą środowiska jest atutem do zamrażania wgłębnego.</td></tr><tr><td>Membrana z azotku krzemu (Si3N4)</td><td>Silson Ltd.</td><td>SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl</td><td>Proponowany typ membrany z azotku krzemu jest zoptymalizowany do analizy za pomocą nanosondy rentgenowskiej ID16A ESRF, Wybrano grubość membrany 500 nm, która jest bardziej odporna na manipulację komórkową i kriofiksację szczegółowo opisaną w tym protokole. Można również zastosować membranę o grubości 200 nm lub niższej, chociaż jest dość delikatna, a inne konstrukcje membrany z azotku krzemu można kupić (na przykład membranę kompatybilną z TEM...) od Sislon lub innej firmy, takiej jak Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco...</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td> <td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,05%</td> <td>GIBCO</td><td>25300-054</td><td>hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Ultraśladowa analiza elementarna Grade, woda ultraczysta</td><td>Fisher Chemicals</td><td>W9-1</td><td>MilliQ woda może być używana, ale musi być przetestowana pod kątem poziomu zanieczyszczenia pierwiastkami śladowymi, na przykład za pomocą analizy ICP-MS.</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny Whatman No. 1 z wyciętym otworem</td><td>Można</td><td>użyć alternatywnej bibuły filtracyjnej Leica 16706440, która musi mieć średnicę zewnętrzną 55 mm, można użyć systemu dziurkacza do bibuły filtracyjnej firmy Leica (nr kat. 16706443).</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Bardzo mało wiadomo o rozkładzie jonów metali na poziomie subkomórkowym. Jednak te pierwiastki chemiczne pełnią podstawowe funkcje regulacyjne, a ich zaburzona homeostaza jest zaangażowana w różne choroby. Najnowocześniejsze synchrotronowe nanosondy fluorescencyjne promieniowania rentgenowskiego zapewniają wymaganą czułość i rozdzielczość przestrzenną, aby wyjaśnić dwuwymiarowy (2D) i trójwymiarowy (3D) rozkład i koncentrację metali wewnątrz całych komórek na poziomie organelli. Otwiera to nowe, ekscytujące obszary badań naukowych nad rolą metali w fizjopatologii komórki. Przygotowanie komórkowe jest kluczową i często złożoną procedurą, szczególnie w przypadku analizy podstawowej. Chociaż techniki fluorescencji rentgenowskiej są obecnie szeroko rozpowszechnione i stosowano różne metody przygotowania, bardzo niewiele badań dotyczyło zachowania w najlepszym razie zawartości pierwiastków w komórkach i do tej pory nie opublikowano szczegółowego protokołu krioprzygotowania komórek adherentnych do nanosond fluorescencji rentgenowskiej. Jest to opis protokołu, który zapewnia stopniowe przygotowanie komórkowe do szybkiej kriofiksacji, aby umożliwić synchrotronową nanoanalizę fluorescencji rentgenowskiej komórek w stanie zamrożonym, uwodnionym, gdy dostępne jest środowisko kriogeniczne i transfer. W przypadku, gdy nanoanaliza musi być przeprowadzona w temperaturze pokojowej, zapewnia się dodatkową procedurę liofilizacji preparatu komórkowego przylegającego do kriofiksu. Proponowane protokoły zostały z powodzeniem wykorzystane w poprzednich pracach, ostatnio w badaniu wewnątrzkomórkowej dystrybucji 2D i 3D związku metaloorganicznego w komórkach raka piersi.

Typowy obraz z optycznego mikroskopu wideo mrożonych, uwodnionych komórek MDA-MB-231, które zostały podhodowane na podłożu z membrany Si3N4 powlekanej poli-L-lizyną, przedstawiono na Rysunku 7A. Obraz optyczny próbki w komorze próżniowej uzyskano w trybie odbiciowym przy użyciu dedykowanego mikroskopu wideo online linii wiązki ID16A w ESRF22. Podczas gdy mikroskopia elektronowa lub miękkim promieniowaniem X wymaga, aby warstwa lodu otaczająca komórkę była jak najcieńsza (zazwyczaj &lt;0.5 µm), twarde promieniowanie X (&gt;10 keV) charakteryzuje się znacznie większą głębokością penetracji i mniejszym osadzaniem dawki. Grubość lodu może być zatem większa, zazwyczaj &lt;10 µm wraz z komórką, tak że lód otaczający komórkę ma grubość kilku µm. Można to oszacować na podstawie zmierzonej intensywności promieniowania X w transmisji w porównaniu z intensywnością bez próbki, uwzględniając absorpcję przez membranę Si3N4 o grubości 500 nm. Taką grubość lodu można uzyskać poprzez ręczne odsączanie, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. W obszarze pierścieni Newtona lód może być jeszcze cieńszy (niezmierzony).
Mapowanie pierwiastkowe metodą fluorescencji rentgenowskiej mrożonej hydratowanej komórki przedstawiono na Rysunku 7B, ukazując reprezentatywne rozkłady pierwiastków fizjologicznych, takich jak potas (K), siarka (S) i cynk (Zn). Mapy te reprezentują powierzchniową masę pierwiastkową (tj. rzutowaną masę pierwiastka). Choć w niniejszym przypadku nie zastosowano tej metody, takie mapy mogą być normalizowane poprzez obrazowanie kontrastowe fazowe oparte na propagacji promieni X, które pozwala na oszacowanie rzutowanej masy próbki23. Zgodnie z wieloma badaniami, przyjęto, że silnie dyfundujący jon K w komórkach zachowanych w stanie zbliżonym do natywnego jest rozłożony homogenicznie w całej komórce23,24,16. Jak pokazują dwuwymiarowe obrazy fluorescencji rentgenowskiej na Rysunku 7B, silnie związany pierwiastek S był rozmieszczony w komórce równomiernie, podobnie jak K, i stanowi dobrą estymację profilu masy komórkowej. Rozkład Zn wykazał silniejszy sygnał w jądrze niż w cytozolu i wyraźnie obrysował jądro. Należy zauważyć, że w obrębie jądra, przy rozdzielczości przestrzennej 50 nm, można wykryć niewielkie obszary wzbogacone w Zn.
Istniejące nanosondy rentgenowskie lub te, które zostaną zbudowane, niekoniecznie posiadają możliwości kriogeniczne. W takim przypadku najlepszą alternatywą dla uzyskania obrazów fluorescencji rentgenowskiej komórek z rozdzielczością przestrzenną poniżej 100 nm jest przeprowadzenie procedury liofilizacji opisanej w niniejszym protokole po zamrażaniu szokowym komórek. Rysunek 8A przedstawia typowy widok mikroskopii w polu jasnym otrzymanych liofilizowanych pierwotnych neuronów hipokampa myszy hodowanych bezpośrednio na membranie Si3N4. W takim przypadku, jeśli są przechowywane w czystej komorze osuszającej, próbki mogą zostać przygotowane z 1−2 tygodniowym wyprzedzeniem i obserwowane za pomocą zwykłego pionowego mikroskopu optycznego w celu rejestracji obszarów zainteresowania. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z wilgotnością otoczenia, ponieważ może ona zostać pochłonięta przez liofilizowaną próbkę i doprowadzić do jej uszkodzenia pod wpływem nanowiązki rentgenowskiej. Procedurę tę zastosowano z sukcesem w przypadku komórek bardzo wrażliwych (np. komórek neuronalnych), a jeszcze lepsze wyniki uzyskano w przypadku innych, bardziej odpornych typów komórek, takich jak komórki nowotworowe. Podobnie jak w przypadku komórek zamrożonych szokowo, obrazy fluorescencji rentgenowskiej K, S i Zn w obrębie całej liofilizowanej komórki są podobne do opisanych powyżej. Są one reprezentatywne dla rozkładu pierwiastków występujących w różnych typach liofilizowanych komórek przy rozdzielczości przestrzennej 50−100 nm. Chociaż liofilizacja całych komórek jest alternatywą pozwalającą zachować integralność pierwiastkową, odbywa się to kosztem idealnego zachowania morfologii komórki16, w szczególności błon komórkowych.
<img alt="Elektroniczna pigułka z kapsułką z czujnikiem; technologia diagnostyki medycznej, innowacyjny system dostarczania leków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Typowy podkład próbki do nanoanalizy fluorescencji rentgenowskiej. Podkład z membrany Si3N4 w kapsułce ochronnej. Ten rodzaj podłoża może być stosowany zarówno do analizy w temperaturze pokojowej (przygotowanie komórkowe metodą plunge-freeze, a następnie proces liofilizacji w niskiej temperaturze i niskiej próżni), jak i do kriogenicznej analizy fluorescencji rentgenowskiej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat adhezji komórek na membranie SiN z powłoką z poli-L-lizyny do analizy eksperymentalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schematyczne przedstawienie okien z azotku krzemu po wysianiu komórek. Komórki są hodowane bezpośrednio na płaskiej powierzchni nośnika z membrany Si3N4 pokrytej poli-L-lizyną. Czasami w tylnej wnęce nośnika z membrany Si3N4 mogą zostać uwięzione pęcherzyki powietrza, które należy usunąć zgodnie z opisem w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Komponenty wydrukowane w technologii 3D, porównanie dwóch projektów geometrycznych, struktury okrągłe, analiza wizualna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Opracowane wewnętrznie pudełko kriogeniczne (cryo-box) wydrukowane w technologii 3D do długoterminowego przechowywania podłoży z membran Si3N4 zamrożonych metodą plunge freezing w naczyniu Dewar z ciekłym azotem. (A) Rozmontowane pudełko kriogeniczne z pojemnikiem i zakrętkami (część dolna) oraz (B) zmontowane pudełko kriogeniczne z zablokowanymi zakrętkami. Zakrętkami można manipulować za pomocą pęsety, otwierając je lub blokując poprzez obrót. Szczegółowy plan druku 3D jest dostępny na żądanie z ESRF ID16A. Projekt został wykonany tak, aby pomieścić siatki TEM z azotku krzemu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Pobieranie próbek stałych za pomocą pęsety w układzie z mikropłytką do analizy materiałowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Osuszanie komórek hodowanych na Si3N4. Przed mrożeniem w ciekłym etanie (plunge-freezing) monowarstwa komórek hodowanych na membranie Si3N4 musi zostać wypłukana w roztworze octanu amonu (A) i ostrożnie osuszona ręcznie za pomocą papieru filtracyjnego (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do mikrotomii i mikroskopii elektronowej; nóż mikrotomu (A), ultramikrotom (B-D) do krojenia próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Automatyczne urządzenie do mrożenia szokowego EM-GP. (A) Automatyczna mrożarka szokowa. (B) Komora środowiskowa z zablokowaną pęsetą. (C) Pojemnik z etanem przykryty skraplaczem Leica połączonym z butlą z etanem. (D) Obudowa do mrożenia szokowego ukazująca czarny pojemnik wypełniony upłynnionym etanem oraz kriopudełko do dalszego przechowywania zwitryfikowanych membran Si3N4 w LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do mielenia kriogenicznego z młynkiem rotacyjnym i tłuczkiem; schemat przedstawia etapy przetwarzania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zespół do kriotransferu próbek dla procedury liofilizacji. (A) Pierwszy mosiężny uchwyt dla membran Si3N4 jest zamontowany na górze uchwytu do transferu próbek dostarczonego przez producenta liofilizatora. (B) i (C) pokazują, że druga płaska mosiężna tarcza służy jako pokrywa i pełni rolę obudowy pułapki zimna, która zostanie włożona do komory próżniowej liofilizatora. (D) Kompletny zespół z prętowym uchwytem transferowym z mechanizmem sprężynowym. (E) Uchwyt z próbką zawierającą zwitryfikowany preparat komórkowy wyhodowany na membranie Si3N4 musi zostać następnie wprowadzony do liofilizatora chłodzonego LN2. Wszystkie etapy montażu zespołu są wykonywane w LN2 w pudełku styropianowym. Dla przejrzystości wszystkie obrazy zostały wykonane bez użycia LN2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy mikrostrukturalnej; rama Si, membrana Si₃N₄; mapy pierwiastkowe: rozkład K, S, Zn." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Obrazy krio-rentgenowskiej fluorescencji mrożonej uwodnionej komórki z wykorzystaniem twardej nanosondy rentgenowskiej. (A) Typowy widok online w trybie odbiciowym z wykorzystaniem dedykowanego optycznego mikroskopu wideo linii wiązki ESRF ID16A. Po ręcznym odsączaniu uzyskano całkowitą grubość lodu około 5−10 µm, co pozwala na wyraźny widok mrożonych uwodnionych komórek. Widoczny jest obszar z pierścieniami Newtona, które wskazują na jeszcze cieńszą warstwę lodu. (B) Reprezentatywne komórkowe rozkłady pierwiastków fizjologicznych: potasu (K), siarki (S) i cynku (Zn) w krio-rentgenowskiej fluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig7large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza pierwiastkowa komórek z mapowaniem K, S, Zn. Wyniki mikroskopii i obrazowania spektralnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60461/60461fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Obrazy fluorescencji rentgenowskiej liofilizowanej komórki neuronalnej uzyskane za pomocą twardej nanosondy rentgenowskiej. (A) Typowy widok w mikroskopii pola jasnego liofilizowanych pierwotnych komórek neuronalnych kory, hodowanych bezpośrednio na membranie Si3N4. Pasek skali = 200 µm (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej pojedynczego liofilizowanego neuronu hipokampa, pokazujące rozkład pierwiastków fizjologicznych: potasu (K), siarki (S) i cynku (Zn). Pasek skali = 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60461/60461fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Prezentowany tutaj jest protokół hodowli komórek na membranach z azotku krzemu i zamrażania wgłębnego przed obrazowaniem fluorescencji rentgenowskiej za pomocą synchrotronowej kriogenicznej nanosondy rentgenowskiej. Gdy zapewniona jest tylko nanoanaliza w temperaturze pokojowej, zamrożone próbki można dalej liofilizować . Są to kluczowe kroki w celu uzyskania informacji na temat wewnątrzkomórkowego składu pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Nowo zaprojektowane synchrotronowe nanosondy fluorescencyjne promieniowania rentgenowskiego umożliwiają wizualizację rozkładu pierwiastków w próbce. Stosowanie metod kriogenicznych jest obowiązkowe w celu spowolnienia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem rentgenowskim. Dlatego szybka kriofiksacja jest niezbędna do uzyskania zamrożonych uwodnionych komórek w celu optymalizacji zachowania struktury komórki i jej integralności chemicznej.Specyfika preparatów komórkowych do badań synchrotronowych doprowadziła do optymalizacji tego protokołu pozyskiwania zamrożonych uwodnionych monowarstw komórkowych. Demonstracja wizualna jest ważna dla zrozumienia, w jaki sposób manipulować próbkami jednowarstwowymi komórek, aby uzyskać powtarzalne komórki kriofiksowane osadzone w cienkiej warstwie lodu. Aby przygotować podparcie membrany z azotku krzemu, otwórz kapsułkę zawierającą podparcie membrany i delikatnie ściśnij kapsułkę, aby lekko poluzować podporę.Użyj cienkiej pęsety, aby chwycić jeden róg silikonowej ramy, uważając, aby nie dotknąć membrany z azotku krzemu na środku ramy i umieść ramkę na odkrytej szalce Petriego w komorze laminarnej. Następnie sterylizuj membranę UV przez 25 do 30 minut. Pod koniec sterylizacji dodaj 10 mikrolitrów czynnika przyłączającego, takiego jak poli-L-lizyna.Inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy wilgotności. Następnie napełnij studzienki sterylnej 48-dołkowej płytki 200 do 250 mikrolitrami ultra czystej i ultra śladowej wody o grubości 0,22 mikrometra na studzienkę. Użyj cienkiej pęsety, aby ostrożnie zanurzyć membranę pionowo za pomocą trzech kolejnych 10-sekundowych płukań w jednej studzience z wodą.Po wypłukaniu umieścić membranę pionowo w pustym dołku sterylnej 96-dołkowej płytki pod okapem z przepływem laminarnym i pozostawić na noc do wyschnięcia. W celu wysiewu komórek będących przedmiotem zainteresowania, należy umieścić powlekaną membranę płaską stroną do góry w jednym dołku sterylnej płytki czterodołkowej. Dodać pięć razy 10 do czterech komórek w 10 mikrolitrach odpowiedniej pożywki hodowlanej na powierzchnię membrany z azotku krzemu, nie dotykając membrany.Kropla powinna pokrywać całą membranę. Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. Kiedy komórki zaczną przyczepiać się do podłoża, powoli dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki hodowlanej w dół ścianki każdej studzienki pokrywającej każdą błonę.Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. W celu krioimmobilizacji preparatu komórkowego należy najpierw włączyć automatyczną zamrażarkę wgłębną i napełnić odpowiednią liczbę studzienek w 12-dołkowej plastikowej płytce buforem octanu amonu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bezpośrednio przed płukaniem i zanurzaniem membrany należy wyjąć próbkę z inkubatora i użyć czarnego pierścienia zaciskowego pęsety z szybkozłączką, aby odblokować pęsetę.Użyj odblokowanej pęsety, aby chwycić wspornik membrany i zanurz membranę pionowo w roztworze buforowym octanu amonu na około pięć sekund. Aby usunąć nadmiar bufora, dociśnij dolną część wspornika membrany do bibuły filtracyjnej i osusz każdą stronę ramy na bibułę filtracyjną, nie pozwalając, aby membrana dotykała bibuły. Po usunięciu nadmiaru bufora otwórz drzwiczki komory środowiskowej, szybko wsuń pęsetę do blokady kleszczy i zamknij drzwi komory.Naciśnij blot Zanurzenie. Pęseta trzymająca membranę z azotku krzemu zostanie szybko zanurzona w kriogenie. Po zamrożeniu zanurzeniowym zdejmij pokrywę pojemnika transferowego z wstępnie schłodzonymi kleszczami i naciśnij transfer.Membrana z azotku krzemu zostanie przesunięta nieco powyżej kriogenu. Szybkim, pojedynczym ruchem wysuń i lekko przechyl pęsetę z blokady kleszczy, aby wprowadzić pęsetę bezpośrednio do pustego otworu krioboxa w pojemniku transferowym wypełnionym płynem azotowym. Następnie zwolnij pierścień zaciskowy, aby uwolnić membranę.Do liofilizacji komórek zamrożonych wgłębnie użyj przełącznika kołyskowego znajdującego się na tylnym panelu przyrządu do liofilizacji, aby włączyć urządzenie. Na wyświetlaczu pojawi się naciśnięcie Enter, gdy będzie gotowe do załadowania próbki. Zamontuj mosiężny uchwyt membrany z azotku krzemu na górze uchwytu do przenoszenia próbki dostarczonego przez dostawcę w pojemniku do przechowywania polistyrenu, utrzymując poziom ciekłego azotu na poziomie około jednego do dwóch milimetrów poniżej górnej krawędzi pierwszego elementu mosiądzu.Umieść membranę stroną z próbką komórki skierowaną do góry w mosiężnej wnęce z numeracją uchwytu i wstępnie schłodź pręt transferowy w pudełku z pianki polistyrenowej wypełnionej ciekłym azotem. Użyj pręta, aby zablokować pełny zespół, naciśnij enter, aby przerwać podciśnienie, aby zwolnić pokrywę komory liofilizatora, natychmiast przenieś próbkę do komory liofilizatora i zamknij pokrywę komory liofilizatora. Następnie natychmiast naciśnij start, aby kontynuować cykl liofilizacji.Pod koniec cyklu liofilizacji naciśnij stop, aby odpowietrzyć komorę i wyjmij cały zespół, aby uzyskać dostęp do liofilizowanych próbek. Tutaj pokazano typowy widok z optycznego mikroskopu wideo zamrożonych, uwodnionych komórek linii komórkowej raka piersi hodowanych na podparciu membrany z azotku krzemu pokrytego poli-L-lizyną, jak pokazano. Mapowanie pierwiastkowe fluorescencji rentgenowskiej zamrożonych uwodnionych komórek ujawnia rozkład pierwiastków fizjologicznych, takich jak potas, siarka i.W tym reprezentatywnym przykładzie ściśle związany pierwiastek siarki był równomiernie rozłożony w komórce w podobny sposób jak w przypadku potasu i stanowi dobre oszacowanie profilu masy komórkowej. Dystrybucja wykazywała jednak wyższy sygnał w jądrze niż w cytozolu z wyraźnie określoną separacją sygnału między cytozolem a jądrem. W tym typowym obrazie mikroskopowym Brightfield liofilizowanych pierwotnych neuronów hipokampa myszy hodowanych bezpośrednio na membranie z azotku krzemu, jak pokazano, komórki wykazują typową morfologię neuronalną, na którą nie ma wpływu ich hodowla lub metoda konserwacji.Obrazowanie fluorescencyjne rentgenowskie komórek zamrożonych wgłębnie ujawnia również typowe rozkłady pierwiastków, jakie wykazują te reprezentatywne liofilizowane komórki w rozdzielczości przestrzennej od 50 do 100 nanometrów. Wykreślenie okna azotku krzemu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania możliwie najcieńszej warstwy lodu komórek po zamrożeniu wgłębnym. Zachowanie integralności chemicznej komórek na poziomie subkomórkowym pozwala na badanie metalumu komórek za pomocą nanosond synchrotronowych, a także innych technik mikroanalitycznych.Ponieważ nie wszystkie analizy nanosondami synchrotronowymi można przeprowadzić w temperaturze kriogenicznej, zamrożone uwodnione komórki można poddać dalszej liofilizacji, aby ułatwić ich analizę w temperaturze pokojowej. Podczas pracy z ciekłym azotem należy pamiętać o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej oraz o tym, aby zawsze używać etanu w dygestorium, z dala od płomieni.

cell-culture-on-silicon-nitride-membranes-cryopreparation-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj prezentujemy protokół, jak określić ilość i rozkład metali w próbce za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej. Skupiamy się na komórkach przylegających i opisujemy metodę chemicznego utrwalania w celu przygotowania tej próbki. Następnie opisujemy, jak zamontować i zobrazować próbkę za pomocą synchrotronowego promieniowania rentgenowskiego.

Przygotowanie komórek adherentnych do obrazowania fluorescencji rentgenowskiej metodą utrwalania chemicznego

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Tutaj wprowadzamy eksperymentalne protokoły obserwacji procesu samoorganizacji w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej komórki cieczowej.

Mikroskopia elektronowa transmisyjna z ciekłymi komórkami do śledzenia samoorganizacji nanocząstek

Przedstawiono protokół procesu produkcji polimerowych cienkowarstwowych struktur kompozytowych o różnych modułach lub grubościach Younga. Folie są produkowane do zaawansowanych badań nad kulturami komórkowymi lub jako kleje do skóry.

Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka

Przedstawiono protokół wytwarzania magnetycznych mikro- i nanostruktur o konfiguracjach spinowych tworzących wiry magnetyczne odpowiednie do badań transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i magnetycznej transmisyjnej mikroskopii rentgenowskiej (MTXM).

Wytwarzanie nanostruktur magnetycznych na membranach z azotku krzemu do badań wirów magnetycznych z wykorzystaniem technik mikroskopii transmisyjnej

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania biologicznych próbek kriogenicznych do eksperymentów z synchrotronową spektroskopią absorpcyjną promieniowania rentgenowskiego. Opisujemy wszystkie kroki wymagane do optymalizacji przygotowania próbek i kriokonserwacji wraz z przykładami protokołu z komórkami nowotworowymi i fitoplanktonem. Metoda ta zapewnia uniwersalny standard krioprzygotowania próbek.

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

Prezentowany jest tutaj protokół oznaczania białek błonowych w komórkach ssaków i pokrywania próbki grafenem do skanowania w fazie ciekłej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą tego protokołu można również badać stabilność próbek w stosunku do uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.

Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Tutaj prezentujemy protokół prezentujący optycznie przezroczyste i płaskie podłoże do usprawnionego wychwytywania i analizy cząstek zanieczyszczających w wodzie pitnej. Przedstawiono tutaj Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): elastyczny rurociąg do wychwytywania, kwantyfikacji i identyfikacji cząstek w ciekłych mediach.

Multimodalna analiza mikroplastiku w wodzie pitnej przy użyciu rurociągu do analizy nanomembran krzemowych

Poznaj metodę hodowli komórkowej na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyki do nanoanalizy fluorescencji rentgenowskiej. Technika ta umożliwia zachowanie struktury komórek i analizę dystrybucji pierwiastków.

Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Przeglądaj więcej filmów