Hodowla komórkowa na membranach z azotku krzemu i kriopreparatyka do nanoanalizy synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej

Nowo zaprojektowane synchrotronowe nanosondy fluorescencyjne promieniowania rentgenowskiego umożliwiają wizualizację rozkładu pierwiastków w próbce. Stosowanie metod kriogenicznych jest obowiązkowe w celu spowolnienia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem rentgenowskim. Dlatego szybka kriofiksacja jest niezbędna do uzyskania zamrożonych uwodnionych komórek w celu optymalizacji zachowania struktury komórki i jej integralności chemicznej.

Specyfika preparatów komórkowych do badań synchrotronowych doprowadziła do optymalizacji tego protokołu pozyskiwania zamrożonych uwodnionych monowarstw komórkowych. Demonstracja wizualna jest ważna dla zrozumienia, w jaki sposób manipulować próbkami jednowarstwowymi komórek, aby uzyskać powtarzalne komórki kriofiksowane osadzone w cienkiej warstwie lodu. Aby przygotować podparcie membrany z azotku krzemu, otwórz kapsułkę zawierającą podparcie membrany i delikatnie ściśnij kapsułkę, aby lekko poluzować podporę.

Użyj cienkiej pęsety, aby chwycić jeden róg silikonowej ramy, uważając, aby nie dotknąć membrany z azotku krzemu na środku ramy i umieść ramkę na odkrytej szalce Petriego w komorze laminarnej. Następnie sterylizuj membranę UV przez 25 do 30 minut. Pod koniec sterylizacji dodaj 10 mikrolitrów czynnika przyłączającego, takiego jak poli-L-lizyna.

Inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przy wilgotności. Następnie napełnij studzienki sterylnej 48-dołkowej płytki 200 do 250 mikrolitrami ultra czystej i ultra śladowej wody o grubości 0,22 mikrometra na studzienkę. Użyj cienkiej pęsety, aby ostrożnie zanurzyć membranę pionowo za pomocą trzech kolejnych 10-sekundowych płukań w jednej studzience z wodą.

Po wypłukaniu umieścić membranę pionowo w pustym dołku sterylnej 96-dołkowej płytki pod okapem z przepływem laminarnym i pozostawić na noc do wyschnięcia. W celu wysiewu komórek będących przedmiotem zainteresowania, należy umieścić powlekaną membranę płaską stroną do góry w jednym dołku sterylnej płytki czterodołkowej. Dodać pięć razy 10 do czterech komórek w 10 mikrolitrach odpowiedniej pożywki hodowlanej na powierzchnię membrany z azotku krzemu, nie dotykając membrany.

Kropla powinna pokrywać całą membranę. Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. Kiedy komórki zaczną przyczepiać się do podłoża, powoli dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki hodowlanej w dół ścianki każdej studzienki pokrywającej każdą błonę.

Następnie hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością. W celu krioimmobilizacji preparatu komórkowego należy najpierw włączyć automatyczną zamrażarkę wgłębną i napełnić odpowiednią liczbę studzienek w 12-dołkowej plastikowej płytce buforem octanu amonu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Bezpośrednio przed płukaniem i zanurzaniem membrany należy wyjąć próbkę z inkubatora i użyć czarnego pierścienia zaciskowego pęsety z szybkozłączką, aby odblokować pęsetę.

Użyj odblokowanej pęsety, aby chwycić wspornik membrany i zanurz membranę pionowo w roztworze buforowym octanu amonu na około pięć sekund. Aby usunąć nadmiar bufora, dociśnij dolną część wspornika membrany do bibuły filtracyjnej i osusz każdą stronę ramy na bibułę filtracyjną, nie pozwalając, aby membrana dotykała bibuły. Po usunięciu nadmiaru bufora otwórz drzwiczki komory środowiskowej, szybko wsuń pęsetę do blokady kleszczy i zamknij drzwi komory.

Naciśnij blot Zanurzenie. Pęseta trzymająca membranę z azotku krzemu zostanie szybko zanurzona w kriogenie. Po zamrożeniu zanurzeniowym zdejmij pokrywę pojemnika transferowego z wstępnie schłodzonymi kleszczami i naciśnij transfer.

Membrana z azotku krzemu zostanie przesunięta nieco powyżej kriogenu. Szybkim, pojedynczym ruchem wysuń i lekko przechyl pęsetę z blokady kleszczy, aby wprowadzić pęsetę bezpośrednio do pustego otworu krioboxa w pojemniku transferowym wypełnionym płynem azotowym. Następnie zwolnij pierścień zaciskowy, aby uwolnić membranę.

Do liofilizacji komórek zamrożonych wgłębnie użyj przełącznika kołyskowego znajdującego się na tylnym panelu przyrządu do liofilizacji, aby włączyć urządzenie. Na wyświetlaczu pojawi się naciśnięcie Enter, gdy będzie gotowe do załadowania próbki. Zamontuj mosiężny uchwyt membrany z azotku krzemu na górze uchwytu do przenoszenia próbki dostarczonego przez dostawcę w pojemniku do przechowywania polistyrenu, utrzymując poziom ciekłego azotu na poziomie około jednego do dwóch milimetrów poniżej górnej krawędzi pierwszego elementu mosiądzu.

Umieść membranę stroną z próbką komórki skierowaną do góry w mosiężnej wnęce z numeracją uchwytu i wstępnie schłodź pręt transferowy w pudełku z pianki polistyrenowej wypełnionej ciekłym azotem. Użyj pręta, aby zablokować pełny zespół, naciśnij enter, aby przerwać podciśnienie, aby zwolnić pokrywę komory liofilizatora, natychmiast przenieś próbkę do komory liofilizatora i zamknij pokrywę komory liofilizatora. Następnie natychmiast naciśnij start, aby kontynuować cykl liofilizacji.

Pod koniec cyklu liofilizacji naciśnij stop, aby odpowietrzyć komorę i wyjmij cały zespół, aby uzyskać dostęp do liofilizowanych próbek. Tutaj pokazano typowy widok z optycznego mikroskopu wideo zamrożonych, uwodnionych komórek linii komórkowej raka piersi hodowanych na podparciu membrany z azotku krzemu pokrytego poli-L-lizyną, jak pokazano. Mapowanie pierwiastkowe fluorescencji rentgenowskiej zamrożonych uwodnionych komórek ujawnia rozkład pierwiastków fizjologicznych, takich jak potas, siarka i.

W tym reprezentatywnym przykładzie ściśle związany pierwiastek siarki był równomiernie rozłożony w komórce w podobny sposób jak w przypadku potasu i stanowi dobre oszacowanie profilu masy komórkowej. Dystrybucja wykazywała jednak wyższy sygnał w jądrze niż w cytozolu z wyraźnie określoną separacją sygnału między cytozolem a jądrem. W tym typowym obrazie mikroskopowym Brightfield liofilizowanych pierwotnych neuronów hipokampa myszy hodowanych bezpośrednio na membranie z azotku krzemu, jak pokazano, komórki wykazują typową morfologię neuronalną, na którą nie ma wpływu ich hodowla lub metoda konserwacji.

Obrazowanie fluorescencyjne rentgenowskie komórek zamrożonych wgłębnie ujawnia również typowe rozkłady pierwiastków, jakie wykazują te reprezentatywne liofilizowane komórki w rozdzielczości przestrzennej od 50 do 100 nanometrów. Wykreślenie okna azotku krzemu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania możliwie najcieńszej warstwy lodu komórek po zamrożeniu wgłębnym. Zachowanie integralności chemicznej komórek na poziomie subkomórkowym pozwala na badanie metalumu komórek za pomocą nanosond synchrotronowych, a także innych technik mikroanalitycznych.

Ponieważ nie wszystkie analizy nanosondami synchrotronowymi można przeprowadzić w temperaturze kriogenicznej, zamrożone uwodnione komórki można poddać dalszej liofilizacji, aby ułatwić ich analizę w temperaturze pokojowej. Podczas pracy z ciekłym azotem należy pamiętać o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej oraz o tym, aby zawsze używać etanu w dygestorium, z dala od płomieni.