Name: Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę wykrywania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną przy użyciu transgenicznych zarodków zebry danio Tg(vtg1:mCherry). Protokół umożliwia in vivo obserwację fluorescencji w wątrobie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowe Biuro Badań, Rozwoju i Innowacji (NKFIH) z Narodowego Funduszu Badań, Rozwoju i Innowacji (NKFIA); Umowa o dofinansowanie: NVKP_16-1-2016-0003, projekt EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 współfinansowany przez Unię Europejską oraz Program Doskonałości Tematycznej NKFIH-831-10/2019 Uniwersytetu Szent István, przyznany przez Ministerstwo Innowacji i Technologii.

Protokół dotyczący zwierząt został zatwierdzony zgodnie z węgierską ustawą o ochronie zwierząt, a wszystkie badania zostały ukończone przed momentem, w którym traktowane osobniki osiągnęłyby etap swobodnego karmienia.
1. Pobranie i obróbka zarodków
<ol>
	<li>Utrzymywać rybki danio Tg(vtg1:mCherry) w temperaturze 25,5 ± 0,5 °C, przy pH = 7 ± 0,2, przewodności między 525 ± 50 μS/m, poziomie tlenu ≥80% nasycenia oraz cyklu 14 h światła i 10 h ciemności.</li>
	<li>Napełnić zbiorniki do tarła wodą systemową i przygotować ryby do rozrodu po południu w dniu poprzedzającym zbiór jaj.</li>
	<li>Umieścić samca i samicę w zbiorniku i oddzielić je za pomocą przegrody.</li>
	<li>Usunąć przegrody ze zbiorników w momencie włączenia światła następnego ranka. Sprawdzać zbiorniki do tarła pod kątem obecności jaj co 15–20 min.</li>
	<li>Zebrać wszystkie embriony za pomocą sitka do herbaty lub gęsto tkanej drobnej siatki i połączyć je w jednej dużej szalce Petriego z buforem E3 (5 mM chlorku sodu, 0,17 mM chlorku potasu, 0,33 mM chlorku wapnia, 0,33 mM siarczanu magnezu) lub czystą wodą systemową.</li>
	<li>Umieścić embriony w inkubatorze ustawionym na 25,5 ± 0,5 °C.</li>
	<li>Po 1–1,5 h usunąć i odrzucić niezapłodnione lub nieprawidłowo dzielące się jaja za pomocą plastikowej pipety transferowej pod mikroskopem stereoskopowym. 
	UWAGA: Jaja niezapłodnione są nieprzezroczyste; jaja zapłodnione są przezroczyste. Aby rozpocząć traktowanie na późniejszym etapie rozwoju, należy zwrócić uwagę na prawidłowy rozwój osobników poddawanych badaniu.</li>
	<li>Umieścić wybrane embriony w naczyniach do traktowania (np. w szalkach Petriego lub płytkach do hodowli tkankowej), które zostały wcześniej oznakowane i napełnione różnymi stężeniami substancji testowej.</li>
	<li>Inkubować embriony w temperaturze 25,5 ± 0,5 °C do końca eksperymentu. 
	UWAGA: Embriony mogą wykazywać znaczną indywidualną wrażliwość na różne związki estrogenowe, dlatego w celu prawidłowej oceny eksperymentu zaleca się użycie co najmniej 15 embrionów w co najmniej trzech powtórzeniach traktowania. Przy wyborze naczynia należy pamiętać, że rozwój jednego embrionu wymaga co najmniej 200 µL wody26. W tym eksperymencie embriony inkubowano do 120 hpf w temperaturze 25,5 ± 0,5 °C.</li>
	<li>Odświeżyć roztwór testowy, jeśli jest to konieczne dla utrzymania stężenia traktowania. Zachować ostrożność podczas wymiany roztworu testowego, aby uniknąć uszkodzenia embrionów. 
	UWAGA: W trakcie eksperymentu można również badać śmiertelność lub objawy subletalne. Użyte stężenia powinny pozostać jak najstabilniejsze, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Można to łatwo osiągnąć poprzez odświeżanie roztworów testowych. Częstotliwość odświeżania może się różnić w zależności od substancji testowej. Dlatego zaleca się sprawdzenie stężenia substancji testowej za pomocą pomiarów analitycznych w celu ustalenia częstotliwości wymiany roztworów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie larw do fotografowania
<ol>
	<li>Wcześniej przygotuj 4% metylocelulozę z MS-222 (trikainometansulfonianem).
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, dodaj 4 mg/mL MS-222 do 100 mL wody dwukrotnej destylowanej do końcowego stężenia 0,168 mg/mL i schłodź roztwór do 4 ˚C. Następnie dodaj 4 g metylocelulozy. Mieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie pozostaw w 4 ˚C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia ponownie wymieszaj roztwór; powinien być on gotowy do użycia. Jeśli metyloceluloza nie rozpuściła się całkowicie, ponownie umieść roztwór w 4 ˚C i odczekaj kilka godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura umieść 5-dniowe larwy w czarce Petriego o średnicy 5 cm dla każdej grupy zabiegowej.</li>
	<li>Usuń roztwór zabiegowy z larw za pomocą plastikowej pipety, a następnie napełnij czarkę Petriego 2 mL 0,02% roztworu anestetyka MS-222. 
	UWAGA: Znieczulenie zazwyczaj działa w czasie krótszym niż minuta. Larwy są znieczulone, jeśli nie odpływają w reakcji na dotyk. Przedawkowanie MS-222 może zabić larwy.</li>
	<li>Wypełnij każde pole specjalnie zaprojektowanej 10 cm czarki Petriego 4% metylocelulozą z MS-222 (Rycina 3). 
	UWAGA: Dwa obszary kwadratowe o wymiarach 1,5 x 1,5 cm na dnie czarki Petriego przyklej za pomocą plastikowych płytek (wysokość 1 mm, szerokość 5 mm). W jednym kwadracie można umieścić obok siebie dwadzieścia larw. Zamiast specjalnie zaprojektowanej czarki Petriego można użyć innego naczynia z niską krawędzią do ustalenia pozycji embrionów.</li>
</ol>
<img alt="Układ szalki Petri do eksperymentu nad wzrostem drobnoustrojów, przedstawiający dwa wzory geometryczne do analizy próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60462/60462fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Szalka Petri o średnicy 10 cm z przyklejonymi kwadratami z plastikowej folii o wymiarach 1,5 x 1,5 cm i grubości 1 mm, służące do przygotowania larw do fotografowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60462/60462fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="5">
	<li>Przenieś znieczulone larwy do metylocelulozy z niewielką ilością wody w jednym z dwóch kwadratów. Z pierwszego kwadratu przenieś larwy do drugiego kwadratu. 
	UWAGA: Dzięki temu przeniesieniu 4% metyloceluloza używana do fotografowania nie zostanie rozcieńczona, a larwy nie będą się obracać podczas obrazowania.</li>
	<li>W drugim kwadracie obróć i zorientuj larwy na lewym boku, a następnie delikatnie dociśnij je do dna celulozy za pomocą końcówki pipety do mikroładowania uciętej do 2 cm. 
	UWAGA: Nie należy używać innych końcówek pipet, ponieważ mogą one spowodować obrażenia larw.</li>
</ol>
3. Mikroskopia
UWAGA: Fotografia nie powoduje śmierci zwierząt. Zwierzęta można wybudzić, usuwając je z metylocelulozy i umieszczając w świeżej wodzie systemowej lub roztworze traktującym, dzięki czemu ten sam osobnik może być badany wielokrotnie w trakcie procesu traktowania.
<ol>
	<li>Aby ocenić sygnał wyrażonego reportera, wykonaj obrazowanie embrionów przy tym samym kadrze i ustawieniach. 
	UWAGA: Optymalne pozycjonowanie embrionów opisano w kroku 2.6. Zdjęcia do publikacji wykonano w opisanych warunkach. Pole jasne: powiększenie 60x, czas ekspozycji 6 ms, przysłona 100%, wzmocnienie (Gain): 1,1; zdjęcia fluorescencyjne: powiększenie 60x, czas ekspozycji 300 ms, przysłona: 100%, wzmocnienie (Gain): 1, filtr mCherry, źródło światła fluorescencyjnego: lampa halogenowa z rtęcią. Do wykonywania zdjęć użyto stereomikroskopu fluorescencyjnego, dedykowanej kamery oraz oprogramowania do mikroskopu.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Ustaw ostrość na wątrobę embrionu i wykonaj obraz w polu jasnym za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Przełącz mikroskop na filtr mCherry i wykonaj obraz fluorescencyjny wątroby przy świetle fluorescencyjnym za pomocą odpowiedniego oprogramowania. 
	UWAGA: Wszystkie etapy obrazowania fluorescencyjnego należy przeprowadzać w ciemności. Nie zmieniaj powiększenia, ostrości ani pozycji embrionu pomiędzy wykonaniem obrazu w polu jasnym a obrazu fluorescencyjnego, co ułatwi późniejszą analizę zdjęć.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.3 i 3.4, aż do momentu wykonania obrazowania wszystkich embrionów biorących udział w eksperymencie.</li>
</ol>
4. Wyznaczanie gęstości zintegrowanej
UWAGA: Jednym z najlepszych wskaźników do porównywania siły sygnału fluorescencyjnego jest wartość gęstości zintegrowanej (tj. iloczyn pola i średniej wartości szarości). Jednym z najprostszych sposobów wyznaczenia gęstości zintegrowanej jest użycie programu ImageJ27. Program jest dostępny w internecie i może zostać zainstalowany na komputerze.
<ol>
	<li>Otwórz program ImageJ, a następnie prześlij obraz fluorescencyjny do analizy, przeciągając i upuszczając plik lub klikając Plik|Otwórz (File|Open).</li>
	<li>Kliknij Obraz|Kolor|Rozdziel (Image|Color|Split) kanały, aby rozdzielić obraz uzyskany za pomocą filtra fluorescencyjnego zgodnie z mapą kolorów RGB.</li>
	<li>Pracuj na spektrum obrazu z kanału czerwonego, a pozostałe kanały zamknij.</li>
	<li>Wyznacz w obrazie obszar eliptyczny o podobnej wielkości, aby fałszywe sygnały nie zakłócały oceny. Używając narzędzia Elipsa (Oval), obrysuj obszar wątroby tak dokładnie, jak to możliwe.</li>
	<li>Jeśli sygnał jest słaby, użyj obrazów z mikroskopii świetlnej (tj. pary obrazów w jasnym polu odpowiadającej obrazowi fluorescencyjnemu), aby ustalić położenie wątroby.</li>
	<li>Kliknij Analiza|Pomiar (Analyze|Measure), aby określić natężenie sygnału i wielkość objętego obszaru. Wartość gęstości zintegrowanej jest obliczana automatycznie przez oprogramowanie (kolumna IntDen w tabeli).</li>
	<li>Kontynuuj analizę, powtarzając kroki 4.1–4.6, aż do przeanalizowania wszystkich obrazów fluorescencyjnych wszystkich embrionów w grupie badawczej.</li>
	<li>Zapisz dane, a następnie przeanalizuj wartości gęstości zintegrowanej. 
	UWAGA: Podczas analizy zawsze wybieraj obszar o tej samej wielkości w obrazach. Wielkość analizowanego obszaru zależy od powiększenia, rozdzielczości obrazu, innych ustawień podczas wykonywania zdjęć itp. Analizę można przyspieszyć lub zwiększyć jej dokładność, korzystając z osobistych makr analitycznych. Na przykład makr można użyć, aby zapewnić, że wybrany obszar w badanych obrazach jest zawsze taki sam. Szczegółowe opisy tworzenia makr umożliwiających optymalną analizę obrazu w zależności od konkretnych ustawień zdjęć znajdują się na stronie internetowej programu ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+Disrupters+in+the+Aquatic+Environment+%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrochimica+et+Hydrobiologica%22%5BJournal%5D)">Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview.</a> Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).</li>
<li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+surfactants+and+some+of+their+degradation+products+assessed+using+a+recombinant+yeast+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).</li>
<li>Sanseverino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Saccharomyces+cerevisiae+BLYES+Expressing+Bacterial+Bioluminescence+for+Rapid%2C+Sensitive+Detection+of+Estrogenic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).</li>
<li>Fetter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-directed+analysis+for+estrogenic+compounds+in+a+fluvial+sediment+sample+using+transgenic+cyp19a1b-GFP+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+estrogen+receptor+transcriptional+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish.</a> Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).</li>
<li>Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+competitive+binding+assay+system+with+recombinant+estrogen+receptors+from+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species.</a> Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).</li>
<li>Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+gene+expression+changes+in+fish+exposed+to+estrogen+-+a+microarray+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach.</a> BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).</li>
<li>Vander Ven, L. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+expression+in+zebrafish+Danio+rerio+evaluation+by+histochemistry%2C+immunohistochemistry%2C+and+in+situ+mRNA+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation.</a> Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).</li>
<li>Bakos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+and+estrogenic+potency+of+zearalenone+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).</li>
<li>Strähle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments+-+A+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+%3A+A+Tool+for+Chemical+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%2C+Part+C%22%5BJournal%5D)">Zebrafish : A Tool for Chemical Screens.</a> Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).</li>
<li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).</li>
<li>Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriogenin+mRNA+induction+in+male+medaka%2C+Oryzias+latipes+as+a+biomarker+of+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption.</a> Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+fluorescent+transgenic+zebrafish+for+detection+of+environmental+estrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens.</a> Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).</li>
<li>Bakos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+sensitive+liver+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+line+%28Tg%28vtg1%3AmCherry%29%29+suitable+for+the+direct+detection+of+estrogenicity+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples.</a> Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).</li>
<li>Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+reporter+zebrafish+line+for+estrogenic+compound+screening+generated+using+a+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).</li>
<li>Tong, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyp19a1b-GFP+%28aromatase+B%29+transgenic+zebrafish+line+that+expresses+GFP+in+radial+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells.</a> Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).</li>
<li>Segner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+a+model+organism+for+investigating+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%2C+Part+C%3A+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption.</a> Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).</li>
<li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+interaction+with+estrogen+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor interaction with estrogen response elements.</a> Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).</li>
<li>Faisal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+beta-cyclodextrins+vs.+zearalenone-induced+toxicity+in+HeLa+cells+and+Tg%28vtg1%3AmCherry%29+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos.</a> Chemosphere. 240, 1-11 (2020).</li>
<li>Kolpin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceuticals%2C+hormones%2C+and+other+organic+wastewater+contaminants+in+U.S.+streams%2C+1999-2000%3A+A+national+reconnaissance%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance.</a> Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).</li>
<li>Kuch, H. M., Ballschmiter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+endocrine-disrupting+phenolic+compounds+and+estrogens+in+surface+and+drinking+water+by+HRGC-%28NCI%29-MS+in+the+picogram+per+liter+range%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range.</a> Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).</li>
<li>Lundgren, M. S., Novak, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+phytoestrogens+in+industrial+waste+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).</li>
<li>Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landfill+leachate+as+a+mirror+of+today%E2%80%99s+disposable+society%3A+Pharmaceuticals+and+other+contaminants+of+emerging+concern+in+final+leachate+from+landfills+in+the+conterminous+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).</li>
<li>Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EFSA+Statement+on+the+establishment+of+guidelines+for+the+assessment+of+additives+from+the+functional+group+%E2%80%98substances+for+reduction+of+the+contamination+of+feed+by+mycotoxins%27+1+EFSA%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA.</a> EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).</li>
<li>Braunbeck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+alternative+for+the+acute+fish+LC%2850%29+test+in+chemical+assessment%3A+the+fish+embryo+toxicity+test+goes+multi-species+-+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update.</a> Altex. 22 (50), 87-102 (2005).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endoderm+formation+to+liver+and+pancreas+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).</li>
<li>Tao, T., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+development+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Liver development in zebrafish (Danio rerio).</a> Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).</li>
<li>Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+for+human+estrogenic+activity+in+zearalenone+mycotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins.</a> Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).</li>
<li>Panel, E., Chain, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriateness+to+set+a+group+health-based+guidance+value+for+zearalenone+and+its+modified+forms+EFSA+Panel+on+Contaminants+in+the+Food+Chain+%28CONTAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM).</a> EFSA Journal. 14, 4425(2016).</li>
<li>Binder, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+risk+of+mycotoxins+in+modern+feed+production%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Feed+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Managing the risk of mycotoxins in modern feed production.</a> Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).</li>
<li>Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+and+Zearalenone-Detoxifying+Profile+of+Rhodococcus+Type+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains.</a> Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stosowanie biomonitorów/bioindykatorów do działania estrogenowego rozprzestrzenia się w badaniach toksykologicznych. Modele in vivo odgrywają znakomitą rolę, ponieważ w przeciwieństwie do testów in vitro nie tylko dostarczają informacji o odpowiedzi komórki lub receptora, ale także pozwalają na badanie złożonych procesów zachodzących w organizmie. Z danio pręgowanego wyprodukowano kilka linii transgenicznych do badania efektów estrogenowych, z których jedna Tg(vtg1:mCherry) została wykorzystana w tych badaniach....

Istnieje znaczna liczba związków zaburzających gospodarkę hormonalną (EDC), które należą do najgroźniejszych substancji w naszym środowisku. Są to głównie związki estrognowe zanieczyszczające wodę z zasobów naturalnych. Różnorodność chemiczna substancji należących do tej grupy utrudnia badanie ich obecności, ponieważ do ich wykrywania wymagane są różne metody analityczne. Na podstawie struktury chemicznej bardzo trudno jest określić, czy dana substancja faktycznie może działać jak estrogen. Ponadto substancje te nigdy nie występują w środowisku w czystej formie, zatem na ich działanie mogą wpływać również inne związki1. Problem ten można rozwiązać za pomocą metod wykrywania efektów, takich jak wykorzystanie organizmów będących biomonitorami/bioindykatorami wykazującymi efekty estrognowe2,3,4,5.
W ostatnim czasie opracowano szereg systemów testowych opartych na liniach komórkowych6 oraz drożdżach2,3 w celu wykrywania efektów estrogennych. Jednakże systemy te zazwyczaj pozwalają jedynie na wykrycie wiązania substancji z receptorami estrogenowymi2,3. Ponadto nie są one w stanie modelować złożonych procesów fizjologicznych w organizmie ani wykrywać faz cyklu życiowego wrażliwych na hormony, co często prowadzi do błędnych wyników.
Wiadomo, że niektóre geny w organizmach żywych reagują w sposób wrażliwy na estrogen7. Wykrywanie produktów genowych metodami biologii molekularnej jest możliwe również na poziomie białek lub mRNA8,9, lecz zazwyczaj wiąże się z uśmierceniem zwierząt. Przepisy dotyczące ochrony zwierząt stały się bardziej rygorystyczne, co zwiększyło zapotrzebowanie na alternatywne systemy testowe, które minimalizują liczbę oraz cierpienie zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach, lub na zastąpienie modelu zwierzęcego innym systemem modelowym10. Dzięki odkryciu białek fluorescencyjnych i stworzeniu linii biomarkerowych, technologie transgeniczne stanowią dobrą alternatywę11. Z wykorzystaniem tych linii można badać aktywację genu wrażliwego na estrogen in vivo.
Wśród kręgowców potencjał ryb w ocenie ryzyka środowiskowego jest wyjątkowy. Oferują one wiele zalet w porównaniu z modelami ssów: jako organizmy wodne są w stanie absorbować zanieczyszczenia całym ciałem, dają liczne potomstwo, a niektóre z ich gatunków charakteryzują się krótkim czasem generacji. Ich układ hormonalny oraz procesy fizjologiczne wykazują duże podobieństwo do innych kręgowców, a nawet ssaków, w tym ludzi12.
Znane są również szeregi genów służących do wykrywania efektów estrogennych u ryb. Najważniejsze z nich to receptory estrogenowe, aromataza-b, choriogenina-H oraz witellogenina (vtg)7,13. Niedawno stworzono również kilka linii biosensorów produkujących estrogeny na podstawie modeli ryb wykorzystywanych w laboratorium, takich jak zebrafish (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Główną zaletą zebrafish w tworzeniu linii biosensorów jest przezroczystość ciała embrionów i larw, dzięki czemu sygnał fluorescencyjnego reportera można łatwo badać in vivo bez uśmiercania zwierzęcia10. Poza ochroną zwierząt jest to również cenna cecha, ponieważ pozwala na badanie reakcji tego samego osobnika w różnych odstępach czasu podczas traktowania18.
W tych eksperymentach wykorzystano transgeniczną linię rybek danio pręgowanych z reporterem witellogeniny15. Konstrukt transgenu użyty do stworzenia Tg(vtg1:mCherry) posiada długi (3,4 kbp) naturalny promotor witellogeniny-1. Receptor estrogenowy (ER) jest białkiem wzmacniającym aktywowanym przez ligandy, reprezentującym superfamilię receptorów steroidowych/jądrowych. ER wiąże się z wysokim powinowactwem do specyficznych sekwencji DNA zwanych elementami odpowiedzi na estrogeny (EREs) i transaktywuje ekspresję genów w odpowiedzi na estradiol oraz inne substancje estrogenne, zatem większa liczba ERE w promotorze wywołuje silniejszą odpowiedź19. W regionie promotorowym konstruktu transgenu Tg(vtg1:mCherry) znajduje się 17 miejsc ERE, co ma na celu odtworzenie ekspresji natywnego genu vtg15. U dojrzałych płciowo samic obserwuje się ciągłą ekspresję sygnału fluorescencyjnego. Jednak u samców i zarodków ekspresja w wątrobie jest widoczna jedynie po podaniu substancji estrogennych (Rycina 1).
<img alt="Porównanie danio pręgowanych, obrazowanie w świetle przechodzącym i mCherry, grupa nietraktowana vs. traktowana E2, analiza fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60462/60462fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Czerwony sygnał fluorescencyjny w wątrobie dorosłych danio pręgowanych oraz embrionów w 5 dpf z linii transgenicznej vtg1:mCherry po indukcji 17-ß-estradiolem (E2).U samic oraz u samców traktowanych E2 (ekspozycja 25 µg/L przez 48 h) widoczna jest silna fluorescencja wątroby, nawet przez pigmentowaną skórę. Brak sygnału fluorescencyjnego jest widoczny u nietraktowanego samca (A). Po indukcji E2 (ekspozycja 50 µg/L w czasie 0-120 hpf) czerwony sygnał fluorescencyjny w wątrobie embrionów w 5 dpf jest również obserwowalny, podczas gdy nie występuje on w embrionach kontrolnych (B). Podczas gdy sygnał fluorescencyjny jest stale obecny u dorosłych samic, do wykrywania efektów estrogennych nadają się przede wszystkim samce i embriony tej linii. (BF: pole jasne, mCherry: widok z czerwonym filtrem fluorescencyjnym, pojedyncze obrazy surowe, pasek skali A: 5 mm, pasek skali B: 250 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60462/60462fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Podobnie jak endogenna witellogenina, reporter mCherry jest ekspresowany wyłącznie w wątrobie. Ponieważ witellogenina jest produkowana tylko w obecności estrogenu, w próbach kontrolnych nie występuje sygnał fluorescencyjny. Dzięki temu, że ekspresja zachodzi tylko w wątrobie, ocena wyników jest znacznie łatwiejsza15.
Czułość i użyteczność zarodków tej linii zostały zbadane w odniesieniu do różnych mieszanin związków estrogennych, a także próbek środowiskowych15,20, a w większości przypadków udokumentowano zależności dawka-odpowiedź (Rysunek 2). Jednak w przypadku substancji silnie toksycznych, głównie hepatotoksycznych (np. zearalenonu), w wątrobie traktowanych zarodków może być widoczny tylko bardzo słaby sygnał fluorescencyjny, a maksymalna intensywność wywołanego sygnału fluorescencyjnego może zostać osiągnięta w bardzo wąskim zakresie stężeń, co utrudnia ustalenie zależności dawka-efekt20.
<img alt="Wykres stężenia EE2 w funkcji zintegrowanej gęstości; obrazy fluorescencyjne białka mCherry w komórkach wątroby." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60462/60462fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wykres zależności odpowiedzi od dawki (A) oraz obrazy fluorescencyjne (mCherry) wątroby (B) poddanej działaniu 17-α-etynyestradiolu (EE2) u 5-dniowych larw vtg1:mCherry. Wyniki przedstawiono jako zintegrowaną gęstość obliczoną na podstawie natężenia sygnału i wielkości obszaru zajętego (±SEM, n = 60). Wartość 100% odnosi się do zaobserwowanego maksimum. Natężenie sygnału fluorescencyjnego wzrastało stopniowo wraz ze wzrostem stężenia. Pasek skali = 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60462/60462fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
W środowisku obecnych jest kilka substancji estrogennych, takich jak 17-β-estradiol (stężenie w środowisku: 0.1–5.1 ng/L)21, 17-α-etynyloestradiol (stężenie w środowisku: 0.16–0.2 µg/L)22, zearalenon (stężenie w środowisku: 0.095–0.22 µg/L)23 oraz bisfenol A (stężenie w środowisku: 0.45–17.2 mg/L)24. Podczas badania tych substancji w czystej postaci aktywnej przy użyciu zarodków transgenicznych mCherry, najniższe zaobserwowane stężenia wywołujące efekt (LOEC) w celu wykrycia sygnału fluorescencyjnego wynosiły 100 ng/L dla 17-ß-estradiolu, 1 ng/L dla 17-α-etynyloestradiolu, 100 ng/L dla zearalenonu oraz 1 mg/L dla bisfenolu A (ekspozycja przez 96–120 hpf), co jest wartością bardzo zbliżoną lub mieszczącą się w zakresie stężeń tych substancji w środowisku15. Linia transgeniczna Tg(vtg1:mCherry) może pomóc w wykrywaniu estrogenowości w próbkach ścieków po bezpośredniej ekspozycji. Linia ta wykazuje czułość porównywalną do powszechnie stosowanego testu estrogenowego z użyciem drożdży, czyli testu bioluminescencyjnego z użyciem drożdży (BLYES)15. Przy pomocy tej linii potwierdzono działanie ochronne beta-cyklodekstryn przeciwko toksyczności indukowanej zearalenonem z wykorzystaniem mieszanin chemicznych20.
W niedawnym raporcie zastosowanie linii transgenicznej in vivo zostało zademonstrowane przy użyciu dwóch estrogennych metabolitów zearalenonu (ZEA): α- i β-zearalenolu (α-ZOL i β-ZOL)25. Podstawowy protokół jest odpowiedni do badania efektów estrogennych kilku związków lub próbek środowiskowych na embrionach Tg(vtg1:mCherry).

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Jet Biofil</td><td>TCP011024</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Reanal Laborvegyszer Ltd.</td><td>16383-0-27-39</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism 6.01</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>Oprogramowanie do publicznego dostępu, do pobrania z: http://imagej.nih.gov/</td></tr> <tr><td>Oprogramowanie kalibrowane w pakiecie Leica Application Suite X</td><td>Leica Microsystems GmbH.</td><td></td><td>Użyliśmy oprogramowania opisanego w eksperymentach, ale każde oprogramowanie fotograficzne jest zgodne z testami</td></tr><tr><td>mikroskopu stereoskopowego Leica M205 FA, aparatu Leica DFC 7000T</td><td>Leica Microsystems GmbH.</td><td></td><td>Użyliśmy sprzętu opisanego w doświadczeniach, ale każdy fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy nadaje się do badań</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>Reanal Laborvegyszer Ltd.</td><td>20342-0-27-38</td><td></td></tr><tr><td>mFiltr wiśniowy</td><td>Leica Microsystems GmbH.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma Aldrich Sp. z o.o.</td><td></td><td></td>274429</tr><tr><td>Końcówka do pipet do mikroładowarek</td><td>Eppendorf GmbH.</td><td></td><td></td>5242956003</tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR International LLC.</td><td>612-1684</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Jet Biofil</td><td>TCD000060</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Reanal Laborvegyszer Ltd.</td><td>18050-0-01-33</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Reanal Laborvegyszer Ltd.</td><td>24640-0-01-38</td><td></td></tr><tr><td>Trikanosulfonian (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich Ltd.</td><td>E10521</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego tg (vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

Using Tg(Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryos to Test the Estrogenic Effects of Endocrine Disrupting Compounds

W środowisku jest wiele związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC), zwłaszcza substancji estrogenowych. Wykrycie tych substancji jest trudne ze względu na ich różnorodność chemiczną; W związku z tym stosuje się coraz więcej metod wykrywania efektów, takich jak organizmy biomonitorujące/bioindykujące wrażliwe na efekt estrogenowy. Te organizmy biomonitorujące obejmują kilka modeli ryb. Protokół ten obejmuje wykorzystanie linii transgenicznej Tg (vtg1: mCherry) danio pręgowanego jako organizmu do biomonitoringu, w tym rozmnażania ryb i leczenia zarodków, z naciskiem na wykrywanie, dokumentację i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez EDC. Celem pracy jest wykazanie wykorzystania zarodków linii transgenicznej Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Praca ta dokumentuje zastosowanie transgenicznych zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych poprzez testowanie dwóch substancji estrogenowych, α- i β-zeralenolu. Opisany protokół jest jedynie podstawą do projektowania testów; Metoda badawcza może być zmieniana w zależności od punktów końcowych badania i próbek. Co więcej, można ją łączyć z innymi metodami testowania, ułatwiając w ten sposób przyszłe wykorzystanie linii transgenicznej.

W eksperymencie przedstawionym w niniejszym manuskrypcie badano efekty dwóch substancji estrogennych w pięciu stężeniach, rozpoczynając od zapłodnienia i trwając przez 5 dni, na embrionach danio pręgowanego Tg(vtg1:mCherry). Zbadaliśmy, czy pod wpływem tych substancji do końca czasu ekspozycji w wątrobie ryb pojawiły się sygnały fluorescencyjne oraz czy istniały różnice w estrogenności obu substancji. Wyniki oceniono na podstawie obrazów fluorescencyjnych oraz wartości gęstości zintegrowanej. Ogólnie obie substa...

Obecny jest tutaj szczegółowy protokół użycia zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Protokół obejmuje rozmnażanie ryb i leczenie zarodków, a także kładzie nacisk na wykrywanie, dokumentowanie i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

There are many endocrine disrupting compounds (EDC) in the environment, especially estrogenic substances. The detection of these substances is difficult ...

W naszym środowisku znajduje się duża liczba substancji chemicznych EDC, głównie substancji estrogenowych. Różnorodność chemiczna substancji należących do tej grupy utrudnia ich badanie, ponieważ do ich wykrycia potrzebne są różne metody. Na podstawie struktury chemicznej naprawdę trudno jest określić, czy substancja jest rzeczywiście w stanie działać jako estrogen.Ponadto substancje te nigdy nie występują w czystej postaci w środowisku, więc na ich działanie mogą wpływać również inne związki. Problem ten rozwiązują metody dialektowania efektów, takie jak stosowanie biomonitorów, organizmów bioindykacyjnych, które wykazują działanie estrogenu. Wiadomo, że niektóre geny reagują wrażliwie na estrogen w organizmach żywych.Wykrywanie produktów genów metodami molekularnymi jest również możliwe na poziomie białka lub mRNA, ale zwykle wiąże się z uśmiercaniem zwierząt. Przepisy dotyczące ochrony zwierząt stają się coraz bardziej rygorystyczne i rośnie zapotrzebowanie na alternatywne systemy testowe. Dzięki temu rozwojowi i odkryciu białek fluorescencyjnych możliwe są technologie krzyżowe, które umożliwiły stworzenie biomarkera.Za ich pomocą można przetestować in vivo aktywację genów wrażliwych na estrogeny. W tym filmie pokazano możliwą metodę wykorzystania zarodków zebry transgenu vtg:1mCherry do testowania substancji estrogenowych za pomocą dwóch związków. Protokół może służyć jako tło do badania wpływu estrogenów różnych próbek chemicznych lub środowiskowych na zarodki biomarkerów.Linia danio pręgowanego użyta w naszych eksperymentach to transgeniczna linia zebrywanego reporterowego z witellogeniną. Linia została stworzona przy użyciu systemu Tol2 Transposon. Konstrukt transgenu wykorzystany do opracowania zawierał długą naturalną sekwencję promotora witellogeniny-1 z dużą liczbą stron ERI.Ekspresja sygnału fluorescencyjnego u dojrzałej płciowo samicy jest ciągła. Jednak u samców w zarodkach pojawia się tylko w wyniku działania lub obecności substancji estrogenowych, więc te ostatnie są bardziej odpowiednie do testów. Czułość i użyteczność zarodków z tej linii została przetestowana na kilku związkach estrogenowych, a także na próbkach środowiskowych.Wszystkie eksperymenty na żywych zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z węgierską ustawą o dobrostanie zwierząt, a wszystkie badania zostały zakończone, zanim zwierzęta osiągnęły etap swobodnego karmienia. Napełnij zbiorniki kryjące wodą systemową i przygotuj ryby do krycia przed zebraniem jaj. Umieść samce i samice ryb w zbiorniku i oddziel je za pomocą przegrody.Wyjmij przegrodę ze zbiorników, gdy światło włączy się następnego ranka. Sprawdzaj zbiorniki kryjące pod kątem jaj co 15 do 20 minut. Zbierz wszystkie zarodki za pomocą sitka do herbaty lub gęsto utkanej drobnej siatki i połącz je w jedną dużą szalkę Petriego z buforem E3 lub klarowną wodą systemową.Umieść zarodki w inkubatorach ustawionych na 25,5 stopnia Celsjusza. Od jednej do półtorej godziny później usuń i wyrzuć niezapłodnione lub nieodpowiednio podzielone jaja za pomocą plastikowej pipety transferowej pod mikroskopem preparacyjnym. Umieścić wybrane zarodki w naczyniach poddanych zabiegowi, na przykład na szalkach Petriego lub płytkach do hodowli tkankowych, które zostały już oznakowane i wypełnione różnymi stężeniami substancji badanej.Inkubuj zarodki w temperaturze 25,5 stopnia Celsjusza do końca eksperymentu. Odświeżyć roztwór badany, jeśli jest to konieczne w celu utrzymania stężenia poddanego działaniu substancji. Należy zachować ostrożność podczas zmiany roztworu testowego, aby uniknąć uszkodzenia zarodków.Przygotuj wcześniej czteroprocentową methoseladozę z ms 222. Umieść pięciodniowe larwy na pięciocentymetrowej szalce Petriego dla każdej grupy leczonej za pomocą plastikowej pipety. Usuń roztwór leczniczy z larw za pomocą plastikowej pipety, a następnie napełnij szalkę Petriego dwoma mililitrami 0,02 procent roztworu znieczulającego ms 222.Wypełnić każdy kwadrat specjalnie zaprojektowanej 10-centymetrowej szalki Petriego czteroprocentową metatulozją ms 222. Przenieś znieczulone larwy do methoseladose z niewielką ilością wody w jednym z dwóch kwadratów. Z pierwszego kwadratu przenieś larwy na drugi kwadrat.W drugim kwadracie obróć i ustaw larwy na ich lewej stronie i delikatnie dociśnij je do dna końcówki do pipet z mikroładowarką przyciętą do dwóch centymetrów. Aby ocenić sygnał osoby zgłaszającej, należy zobrazować zarodki w tym samym widoku i ustawieniach. Umieść szalkę Petriego na stoliku mikroskopu.Skoncentruj się na wątrobie zarodka i uchwyć obraz jasnego pola za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Przełącz mikroskop na filtr mCherry i wykonaj fluorescencyjny obraz wątroby w świetle fluorescencyjnym za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Powtarzaj poprzednie dwa kroki, aż schwytasz wszystkie zarodki w eksperymencie.Otwórz ImageJ, a następnie prześlij obraz fluorescencyjny do analizy, przeciągając i upuszczając obraz lub klikając Otwórz plik. Kliknij Obraz, Kolor, Podziel kanały, aby podzielić obraz utworzony przez filtr fluorescencyjny zgodnie z kartą kolorów RGB. Praca z widmem obrazu kanału czerwonego.Zamknij pozostałe kanały. Wyznacz na obrazie eliptyczny obszar o podobnej wielkości, aby pełne sygnały nie zakłócały oceny. Za pomocą owalnych narzędzi narysuj elipsę nad podświetlonym obszarem wątroby tak dokładnie, jak to możliwe.Jeśli sygnał jest słaby, użyj świetlnych obrazów mikroskopowych, pary jasnych pól obrazu fluorescencyjnego, aby określić lokalizację wątroby. Kliknij Analizuj, Zmierz, aby określić siłę sygnału i rozmiar dotkniętego obszaru. Zintegrowana wartość gęstości jest automatycznie obliczana przez kolumnę oprogramowania na wykresie.Kontynuuj analizę, powtarzając poprzednie kroki, aż przeanalizujesz wszystkie obrazy fluorescencyjne wszystkich zarodków w grupie leczonej. Zapisz dane, a następnie przeanalizuj zintegrowane wartości gęstości. W eksperymencie wrażliwe na estrogeny zarodki z linii biomarkera danio pręgowanego traktowano stężeniami alfa i beta-beta-zearalenolu (ZOL) w celu zapłodnienia do piątego dnia życia.Zbadaliśmy, czy sygnały fluorescencyjne pojawiają się w wątrobie ryb pod koniec eksperymentu z powodu substancji i czy istnieją różnice w estrogenności tych dwóch substancji. Wyniki oceniono na podstawie obrazów fluorescencyjnych i zintegrowanych wartości gęstości. W przypadku alfa-ZOL, przy najwyższym badanym stężeniu, wszystkie osoby zmarły.Tak więc w tym przypadku nie można było zbadać sygnału fluorescencyjnego. Przy niższych stężeniach można zaobserwować silny sygnał fluorescencyjny w wątrobie zarodka. Przy braku znaczącej różnicy w sile sygnału fluorescencyjnego i wielkości oświetlanych obszarów.Nie stwierdzono również istotnej różnicy między zintegrowanymi wartościami gęstości a zabiegami. Podczas leczenia beta-ZOL nie stwierdzono śmiertelności. Substancja indukowała aktywność transgenową we wszystkich stężeniach poddanych zabiegowi.Wzrost natężenia sygnału fluorescencyjnego i wielkości oświetlanego obszaru można zaobserwować na obrazach fluorescencyjnych wraz ze wzrostem stężenia. Badając zintegrowane wartości beta-ZOL, można również odkryć tę zmianę. Średnia wartość gęstości zintegrowanej prawie podwaja się między najniższym a najwyższym stężeniem poddawanym zabiegowi.Jednak w przypadku beta-ZOL nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy zintegrowanymi wartościami gęstości poszczególnych stężeń. Badając zintegrowane wartości gęstości uzyskane z tych samych stężeń traktowanych przez obie substancje, można powiedzieć, że alfa-ZOL dał wyższe średnie gęstości zintegrowanej w każdym przypadku w stosunku do beta-ZOL, co jest zgodne z różnicami między siłą sygnału obserwowaną na obrazach fluorescencyjnych. Różnice te są znaczące we wszystkich stężeniach.Stosowanie bioindykatorów do działania estrogenów rozprzestrzenia się w badaniach toksykologicznych. Kilka linii transgenicznych wykazujących działanie estrogenowe zostało również wytworzonych z danio pręgowanego, z których vtg:1mCherry został użyty w naszych badaniach. Opisana tutaj metoda ilustruje możliwy protokół badania zarodków tej linii, w celu umożliwienia wykrycia in vivo aktywności estrogenów w przypadku czystych czynników.Należy wspomnieć, że w przypadku zarodków ekspresja transgenu, podobnie jak produkcja endogennej witellogeniny, wykazuje dużą dyspersję, a przy projektowaniu eksperymentów należy uwzględnić różnice w indywidualnej wrażliwości. Ważnym aspektem przy określaniu stężeń poddanych działaniu substancji jest to, że komórki zarodków, w tym komórki wątroby, mogą zostać uszkodzone przez wyższe stężenia wysoce toksycznych substancji, co może prowadzić do zmniejszenia indukcji witellogeniny. Dlatego badania należy przeprowadzać przy stężeniach poniżej L-C 10.Protokół ten może być zmieniany w wielu punktach w zależności od planowanych punktów końcowych testu oraz próbek, które mają być badane. Można go uzupełnić innymi metodami badawczymi, na przykład metodami molekularnymi. W związku z tym mamy nadzieję, że zastosowanie linii vtg:1mCherry pojawi się jako wzór testów estrogenowości, a także może być wzorem dla standaryzowanych metod badawczych.

using-tg-vtg1mcherry-zebrafish-embryos-to-test-estrogenic-effects

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Opisujemy procedurę i analizę danych chemicznego systemu przesiewowego sygnalizacji glikokortykosteroidowego hormonu stresu za pomocą larw danio pręgowanego: test aktywności lucyferazy zebry reagujący na glikokortykosteroidy in vivo (GRIZLY). Test z czułością i swoistością wykrywa wpływ związków wymagających metabolizowania lub wpływających na endogenną produkcję glikokortykosteroidów na sygnalizację glikokortykosteroidów.

Chemiczna procedura przesiewowa sygnalizacji glikokortykosteroidów za pomocą systemu reporterowego lucyferazy larw danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Narażenie na toksyny środowiskowe może mieć dotkliwy wpływ na rozwijające się zarodki. Wiadomo, że substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną, takie jak bisfenole, niekorzystnie wpływają na układ nerwowy. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący model sieci neuronalnej kręgowców (zarodków piskląt) in vitro w celu zbadania funkcjonalnego wpływu ekspozycji na toksyny na wczesne zarodki.

Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Chemikalia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważny problem dla organizmów i środowiska naturalnego. Drosophila melanogaster stanowi idealny model do badania efektów EDC in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila, odnosząc się do wpływu EDC na płodność, płodność, czas rozwoju i długość życia muchy.

Metody badania zaburzeń endokrynologicznych u Drosophila melanogaster

Opisujemy przebieg pracy systemu badań przesiewowych i analizę danych do oceny toksyczności związków chemicznych na podstawie reakcji na wibracje zarodka danio pręgowanego. System rejestruje ruchy zarodków danio pręgowanego po wystawieniu na bodziec wibracyjny i pozwala na zintegrowaną ocenę ogólnej toksyczności/śmiertelności i toksyczności nerwowo-mięśniowej.

Ocena toksyczności substancji chemicznych za pomocą systemu badań przesiewowych reakcji na drgania danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj metodę wykrywania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną przy użyciu transgenicznych zarodków zebry danio Tg(vtg1:mCherry). Protokół umożliwia in vivo obserwację fluorescencji w wątrobie.

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

Przeglądaj więcej filmów