Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

W naszym środowisku znajduje się duża liczba substancji chemicznych EDC, głównie substancji estrogenowych. Różnorodność chemiczna substancji należących do tej grupy utrudnia ich badanie, ponieważ do ich wykrycia potrzebne są różne metody. Na podstawie struktury chemicznej naprawdę trudno jest określić, czy substancja jest rzeczywiście w stanie działać jako estrogen.

Ponadto substancje te nigdy nie występują w czystej postaci w środowisku, więc na ich działanie mogą wpływać również inne związki. Problem ten rozwiązują metody dialektowania efektów, takie jak stosowanie biomonitorów, organizmów bioindykacyjnych, które wykazują działanie estrogenu. Wiadomo, że niektóre geny reagują wrażliwie na estrogen w organizmach żywych.

Wykrywanie produktów genów metodami molekularnymi jest również możliwe na poziomie białka lub mRNA, ale zwykle wiąże się z uśmiercaniem zwierząt. Przepisy dotyczące ochrony zwierząt stają się coraz bardziej rygorystyczne i rośnie zapotrzebowanie na alternatywne systemy testowe. Dzięki temu rozwojowi i odkryciu białek fluorescencyjnych możliwe są technologie krzyżowe, które umożliwiły stworzenie biomarkera.

Za ich pomocą można przetestować in vivo aktywację genów wrażliwych na estrogeny. W tym filmie pokazano możliwą metodę wykorzystania zarodków zebry transgenu vtg:1mCherry do testowania substancji estrogenowych za pomocą dwóch związków. Protokół może służyć jako tło do badania wpływu estrogenów różnych próbek chemicznych lub środowiskowych na zarodki biomarkerów.

Linia danio pręgowanego użyta w naszych eksperymentach to transgeniczna linia zebrywanego reporterowego z witellogeniną. Linia została stworzona przy użyciu systemu Tol2 Transposon. Konstrukt transgenu wykorzystany do opracowania zawierał długą naturalną sekwencję promotora witellogeniny-1 z dużą liczbą stron ERI.

Ekspresja sygnału fluorescencyjnego u dojrzałej płciowo samicy jest ciągła. Jednak u samców w zarodkach pojawia się tylko w wyniku działania lub obecności substancji estrogenowych, więc te ostatnie są bardziej odpowiednie do testów. Czułość i użyteczność zarodków z tej linii została przetestowana na kilku związkach estrogenowych, a także na próbkach środowiskowych.

Wszystkie eksperymenty na żywych zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z węgierską ustawą o dobrostanie zwierząt, a wszystkie badania zostały zakończone, zanim zwierzęta osiągnęły etap swobodnego karmienia. Napełnij zbiorniki kryjące wodą systemową i przygotuj ryby do krycia przed zebraniem jaj. Umieść samce i samice ryb w zbiorniku i oddziel je za pomocą przegrody.

Wyjmij przegrodę ze zbiorników, gdy światło włączy się następnego ranka. Sprawdzaj zbiorniki kryjące pod kątem jaj co 15 do 20 minut. Zbierz wszystkie zarodki za pomocą sitka do herbaty lub gęsto utkanej drobnej siatki i połącz je w jedną dużą szalkę Petriego z buforem E3 lub klarowną wodą systemową.

Umieść zarodki w inkubatorach ustawionych na 25,5 stopnia Celsjusza. Od jednej do półtorej godziny później usuń i wyrzuć niezapłodnione lub nieodpowiednio podzielone jaja za pomocą plastikowej pipety transferowej pod mikroskopem preparacyjnym. Umieścić wybrane zarodki w naczyniach poddanych zabiegowi, na przykład na szalkach Petriego lub płytkach do hodowli tkankowych, które zostały już oznakowane i wypełnione różnymi stężeniami substancji badanej.

Inkubuj zarodki w temperaturze 25,5 stopnia Celsjusza do końca eksperymentu. Odświeżyć roztwór badany, jeśli jest to konieczne w celu utrzymania stężenia poddanego działaniu substancji. Należy zachować ostrożność podczas zmiany roztworu testowego, aby uniknąć uszkodzenia zarodków.

Przygotuj wcześniej czteroprocentową methoseladozę z ms 222. Umieść pięciodniowe larwy na pięciocentymetrowej szalce Petriego dla każdej grupy leczonej za pomocą plastikowej pipety. Usuń roztwór leczniczy z larw za pomocą plastikowej pipety, a następnie napełnij szalkę Petriego dwoma mililitrami 0,02 procent roztworu znieczulającego ms 222.

Wypełnić każdy kwadrat specjalnie zaprojektowanej 10-centymetrowej szalki Petriego czteroprocentową metatulozją ms 222. Przenieś znieczulone larwy do methoseladose z niewielką ilością wody w jednym z dwóch kwadratów. Z pierwszego kwadratu przenieś larwy na drugi kwadrat

W drugim kwadracie obróć i ustaw larwy na ich lewej stronie i delikatnie dociśnij je do dna końcówki do pipet z mikroładowarką przyciętą do dwóch centymetrów. Aby ocenić sygnał osoby zgłaszającej, należy zobrazować zarodki w tym samym widoku i ustawieniach. Umieść szalkę Petriego na stoliku mikroskopu.

Skoncentruj się na wątrobie zarodka i uchwyć obraz jasnego pola za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Przełącz mikroskop na filtr mCherry i wykonaj fluorescencyjny obraz wątroby w świetle fluorescencyjnym za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Powtarzaj poprzednie dwa kroki, aż schwytasz wszystkie zarodki w eksperymencie.

Otwórz ImageJ, a następnie prześlij obraz fluorescencyjny do analizy, przeciągając i upuszczając obraz lub klikając Otwórz plik. Kliknij Obraz, Kolor, Podziel kanały, aby podzielić obraz utworzony przez filtr fluorescencyjny zgodnie z kartą kolorów RGB. Praca z widmem obrazu kanału czerwonego.

Zamknij pozostałe kanały. Wyznacz na obrazie eliptyczny obszar o podobnej wielkości, aby pełne sygnały nie zakłócały oceny. Za pomocą owalnych narzędzi narysuj elipsę nad podświetlonym obszarem wątroby tak dokładnie, jak to możliwe.

Jeśli sygnał jest słaby, użyj świetlnych obrazów mikroskopowych, pary jasnych pól obrazu fluorescencyjnego, aby określić lokalizację wątroby. Kliknij Analizuj, Zmierz, aby określić siłę sygnału i rozmiar dotkniętego obszaru. Zintegrowana wartość gęstości jest automatycznie obliczana przez kolumnę oprogramowania na wykresie.

Kontynuuj analizę, powtarzając poprzednie kroki, aż przeanalizujesz wszystkie obrazy fluorescencyjne wszystkich zarodków w grupie leczonej. Zapisz dane, a następnie przeanalizuj zintegrowane wartości gęstości. W eksperymencie wrażliwe na estrogeny zarodki z linii biomarkera danio pręgowanego traktowano stężeniami alfa i beta-beta-zearalenolu (ZOL) w celu zapłodnienia do piątego dnia życia.

Zbadaliśmy, czy sygnały fluorescencyjne pojawiają się w wątrobie ryb pod koniec eksperymentu z powodu substancji i czy istnieją różnice w estrogenności tych dwóch substancji. Wyniki oceniono na podstawie obrazów fluorescencyjnych i zintegrowanych wartości gęstości. W przypadku alfa-ZOL, przy najwyższym badanym stężeniu, wszystkie osoby zmarły.

Tak więc w tym przypadku nie można było zbadać sygnału fluorescencyjnego. Przy niższych stężeniach można zaobserwować silny sygnał fluorescencyjny w wątrobie zarodka. Przy braku znaczącej różnicy w sile sygnału fluorescencyjnego i wielkości oświetlanych obszarów.

Nie stwierdzono również istotnej różnicy między zintegrowanymi wartościami gęstości a zabiegami. Podczas leczenia beta-ZOL nie stwierdzono śmiertelności. Substancja indukowała aktywność transgenową we wszystkich stężeniach poddanych zabiegowi.

Wzrost natężenia sygnału fluorescencyjnego i wielkości oświetlanego obszaru można zaobserwować na obrazach fluorescencyjnych wraz ze wzrostem stężenia. Badając zintegrowane wartości beta-ZOL, można również odkryć tę zmianę. Średnia wartość gęstości zintegrowanej prawie podwaja się między najniższym a najwyższym stężeniem poddawanym zabiegowi.

Jednak w przypadku beta-ZOL nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy zintegrowanymi wartościami gęstości poszczególnych stężeń. Badając zintegrowane wartości gęstości uzyskane z tych samych stężeń traktowanych przez obie substancje, można powiedzieć, że alfa-ZOL dał wyższe średnie gęstości zintegrowanej w każdym przypadku w stosunku do beta-ZOL, co jest zgodne z różnicami między siłą sygnału obserwowaną na obrazach fluorescencyjnych. Różnice te są znaczące we wszystkich stężeniach.

Stosowanie bioindykatorów do działania estrogenów rozprzestrzenia się w badaniach toksykologicznych. Kilka linii transgenicznych wykazujących działanie estrogenowe zostało również wytworzonych z danio pręgowanego, z których vtg:1mCherry został użyty w naszych badaniach. Opisana tutaj metoda ilustruje możliwy protokół badania zarodków tej linii, w celu umożliwienia wykrycia in vivo aktywności estrogenów w przypadku czystych czynników.

Należy wspomnieć, że w przypadku zarodków ekspresja transgenu, podobnie jak produkcja endogennej witellogeniny, wykazuje dużą dyspersję, a przy projektowaniu eksperymentów należy uwzględnić różnice w indywidualnej wrażliwości. Ważnym aspektem przy określaniu stężeń poddanych działaniu substancji jest to, że komórki zarodków, w tym komórki wątroby, mogą zostać uszkodzone przez wyższe stężenia wysoce toksycznych substancji, co może prowadzić do zmniejszenia indukcji witellogeniny. Dlatego badania należy przeprowadzać przy stężeniach poniżej L-C 10.

Protokół ten może być zmieniany w wielu punktach w zależności od planowanych punktów końcowych testu oraz próbek, które mają być badane. Można go uzupełnić innymi metodami badawczymi, na przykład metodami molekularnymi. W związku z tym mamy nadzieję, że zastosowanie linii vtg:1mCherry pojawi się jako wzór testów estrogenowości, a także może być wzorem dla standaryzowanych metod badawczych.