Rekapitulacja przejścia od ssania do odsadzenia in vitro przy użyciu organoidów jelitowych płodu

Protokół ten opisuje hodowlę komórek jelitowych płodu myszy, która jest najlepiej przystosowana do osiągnięcia dojrzałości do stadium dorosłego in vitro. To podejście in vitro może być wykorzystane do badania molekularnych mechanizmów przejścia od ssania do odsadzenia, a także modulatorów tego procesu, a także do osiągnięcia bardziej efektywnego wykorzystania zwierząt doświadczalnych. W tym modelu dojrzewania jelit in vitro istotne jest wykorzystanie pierwotnych komórek jelitowych z późnego stadium rozwoju, między 18. a 20. dniem embrionalnym

Za pomocą dwóch małych kleszczy rozciągnij jelito. Używając żołądka i wyrostka robaczkowego jako prowadnic, rozetnij bliższą i dalszą część jelita cienkiego. Używając wyrostka robaczkowego jako przewodnika, rozetnij okrężnicę.

Aby jelito otworzyło się wzdłużnie, umieść żyletkę wzdłuż jelita i pociągnij jelito, przesuwając kleszcze wzdłuż żyletki. Następnie pokrój otwarte jelito na jednocentymetrowe kawałki. Przygotuj trzy 50-mililitrowe probówki z dziesięcioma mililitrami lodowatego PBS.

Przenieś proksymalną i dystalną część jelita cienkiego i okrężnicę oddzielnie do rurek. Trzymaj probówki na lodzie podczas preparowania jelit dodatkowych myszy. Zbierz wszystkie części jelitowe jednego miotu razem w tej samej probówce.

Po umyciu kawałków jelita lodowatym PBS, inkubować z dwoma milimolowymi EDTA przez 30 minut. Aby oddzielić krypty od tkanki, częściowo umyj kawałki lodowatym PBS i dziesięcioprocentową surowicą cielęcą i przefiltruj przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów do nowej probówki. Powtórz mycie chusteczki jeszcze dwa razy i połącz przefiltrowany roztwór.

Odwirować przefiltrowany roztwór zawierający krypty w temperaturze 150 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać krypty w postaci osadów. Przenieś krypty do 15-mililitrowej probówki i ponownie odwiruj. Do dołków płytkowych dodaj do probówki całkowitą ilość potrzebnego żelu macierzy zewnątrzkomórkowej i rozpuść osad.

Dodaj 20 mikrolitrów rozpuszczonych krypt do każdej studzienki ciepłej 48-dołkowej płytki. Po poszyciu pierwszego dołka spójrz pod mikroskop, aby potwierdzić gęstość około 250 do 300 krypt na studnię. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dziesięć minut, aby żel macierzy zewnątrzkomórkowej zastygł.

Następnie przygotuj pożywkę ENR. Dodaj 250 mikrolitrów pożywki ENR do każdego dołka na żel. Zmieniaj podłoże trzy razy w tygodniu i przepuszczaj organoidy raz w tygodniu.

Przez miesiąc, co trzy dni po każdym przejściu, analizuj kulturę. Trzy dni po każdym pasażu wyizoluj RNA z jednego dołka, dodając do dołka 200 mikrolitrów buforu do lizy RNA uzupełnionego dwoma mikrolitrami beta merkaptoetanolu. Następnie przenieś próbkę z dołka do probówki o pojemności 1,5 mililitra bez RNAzy.

W naszych eksperymentach in vitro użyliśmy deksametozonu jako przykładu czynnika zewnętrznego, o którym wiadomo, że przyspiesza dojrzewanie jelit in vivo. Aby wyizolować białko, dodaj 250 mikrolitrów lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek na studzienkę do pięciu dołków organoidów i zbierz je wszystkie w 15-mililitrowej probówce. Inkubować przez co najmniej 30 minut na lodzie w celu rozpuszczenia żelu macierzy zewnątrzkomórkowej.

Umyj lodowatym PBS, dodaj 250 mikrolitrów buforu do lizy komórek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby przeanalizować aktywność enzymu, najpierw przygotuj 0,625 molowy bufor maleinowy o pH sześć i 0,05 molowe roztwory laktozy, sacharozy, maltozy i trehalazy i przechowuj je na lodzie. Przygotuj wzorce testowe, rozcieńczając 5,56 molowy roztwór glukozy ultraczystą wodą, aby otrzymać roztwory o 5 różnych stężeniach.

Następnie, do 96-dołkowej płytki, dodaj osiem różnych grup lizatu organoidowego wraz z odpowiednimi substratami, w tym wzorcami i kontrolą zgodnie z manuskryptem. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby określić ilość glukozy wytwarzanej przez enzymy obecne w lizacie organoidowym, szybko dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwnego PGO i mierz absorbancję na spektrofotometrze przy 450 nanometrach co pięć minut przez trzydzieści minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

W tym protokole wyizolowano proksymalne i dystalne jelito od płodów myszy od E18 do E20. Po izolacji komórki nabłonkowe zostały umieszczone w żelowych kopułach macierzy zewnątrzkomórkowej. Po około 28 do 30 dniach hodowli organoidy płodowe zostały rozwinięte do dojrzałego stanu dorosłego.

Markery proksymalne Onecut2 i Gata4 ulegały ekspresji głównie w proksymalnej hodowli organoidów, podczas gdy dystalne markery Fabp6 i Guca2a ulegały ekspresji głównie w dystalnej hodowli organoidów. Markery płodowe laktaza, Ass1, Blimp-1 i receptor Fc noworodków zmniejszyły swoją względną ekspresję, a dorosłe markery: izomaltazę sacharazy, argenazę 2, trehalazę i lizozym zwiększyły się z czasem zarówno w proksymalnych, jak i dystalnych hodowlach organoidów. Wpływ czynników zewnętrznych niekoniecznie musi być genomiczny.

Ekspresja genu markera płodowego Blimp-1 była zmniejszona w 12. dniu dla organoidów traktowanych deksametazonem w porównaniu z organoidami kontrolnymi. Jednak zarówno ekspresja genów, jak i aktywność enzymatyczna dorosłych markerów izomaltazy sacharazy były zwiększone. Podczas korzystania z tego protokołu ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że tylko organoidy w późnym stadium płodowym są zdolne do przejścia do dorosłych organoidów in vitro.

Liczba od sześciu do dziesięciu płodów jako punkt wyjścia tej hodowli może być dodatkowo zmniejszona, wykorzystując całe jelito do badania ogólnego dojrzewania. Wartość translacyjna tego modelu polega na możliwości wystąpienia wysokich skrajności grupowych: efektory są zdolne do modulowania dojrzewania jelitowego, które jest procesem zachowanym między ssakami ssącymi.