Name: Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach HeLa zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii wirujących dysków i platformy MATLAB. Technika ta umożliwia zmniejszenie fototoksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Centrum Mikroskopii Świetlnej, Instytutu Medycyny Eksperymentalnej Maxa-Plancka, za ich fachowe porady i wsparcie.

1. Wysiewanie komórek HeLa
<ol>
	<li>Przygotować 2 mL roztworu fibronektyny o stężeniu 5 μg/mL w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) i dodać po 450 μL do każdego dołka szkiełka podstawowego z 4 komorami (#1.5). Inkubować szkiełko przez 15 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Przepłukać asynchronicznie rosnące komórki HeLa solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) i inkubować z trypsyną-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) przez 5 min w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję enzymatyczną poprzez dodanie pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej o 10% inaktywowanego ciepłem płodowego surowicy cielęcej (FCS) w stosunku 3:1 (v:v) względem dodanej trypsyny-EDTA. 
	UWAGA: Komórki HeLa były hodowane w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% inaktywowanego ciepłem FCS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 oraz rutynowo pasażowane po osiągnięciu 80–90% konfluencji zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Określić stężenie komórek przy użyciu komory Neubauera. Wymieszać 50 μL alikwot zawiesiny komórkowej z błękitem trypanu w stosunku 1:1 (v:v), resuspendować i przenieść 10 μL zawiesiny do komory. Odliczyć tylko komórki niebarwiące się błękitem trypanu w obrębie czterech dużych kwadratów (szczegóły patrz Phelan et al.47). Obliczyć stężenie komórek na podstawie liczby odliczonych komórek, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/60478/60478eq1.jpg" /></li>
	<li>Zwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 300 x g przez 2 min. Resuspendować w świeżej pożywce RPMI 1640, aby uzyskać stężenie 1 x 106 komórek/mL.</li>
	<li>Usunąć fibronektynę z komorowego szkiełka podstawowego, dwukrotnie przemyć dołki DPBS i wysiać po 50 000 komórek na dołek.</li>
	<li>Przenieść szkiełko podstawowe z komórkami z powrotem do inkubatora i hodować przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
2. Ekspresja pEB3-tdTomato w komórkach HeLa
<ol>
	<li>Przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Do każdej probówki wprowadzić 2 μg pEB3-tdTomato48 i rozcieńczyć buforem do transfekcji (produkt syntetyczny w roztworze wodnym) do objętości końcowej 396 μL.</li>
	<li>Do pierwszej probówki dodać 4 μL odczynnika do transfekcji (nielipidowy, zawierający polietylenoiminę) i natychmiast wymieszać na wortexie przez dokładnie 10 s.</li>
	<li>Krótko wirować probówkę w mikrocentry fudze i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 min.</li>
	<li>Wyjąć komórki HeLa z inkubatora. Do każdego dołka 4-komorowego szkiełka podstawowego dodać kroplami 100 μL mieszaniny do transfekcji, a następnie umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Po 4 h inkubacji w 37 °C i 5% CO2 uzupełnić świeżą pożywką wzrostową i inkubować przez co najmniej 24 h w 37 °C i 5% CO2. 
	UWAGA: Konieczna jest optymalizacja warunków transfekcji dla każdego typu komórek. Poziomy ekspresji muszą być na tyle niskie, aby umożliwić identyfikację pojedynczych końców rosnących MT. Alternatywnie, w eksperymentach można zastosować linię komórkową stabilnie eksponującą EB3-tdTomato; pozwoliłoby to zmniejszyć zmienność poziomów ekspresji EB3-tdTomato pomiędzy preparatami oraz między komórkami z tego samego preparatu49.</li>
</ol>
3. Synchronizacja i obrazowanie żywych komórek HeLa wykazujących ekspresję pEB3-tdTomato
<ol>
	<li>Przygotować 2,5 μM roztwór dimetylenastronu (DME) w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej o 10% FCS i 2 mM L-glutaminy lub alternatywne źródło glutaminy.</li>
	<li>Wymienić pożywkę wzrostową na szkiełku podstawowym z komorą na 500 μL pożywki wzrostowej zawierającej 2,5 μM DME i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Po 3,5 h inkubacji z DME przenieść komórki pod mikroskop, zamocować szkiełko z komorą w komorze inkubacyjnej z ciemnymi panelami do obrazowania w 37 °C i 5% CO2 i inkubować dalej, aż całkowity czas inkubacji wyniesie 4 h. 
	UWAGA: Utrzymanie stałej temperatury 37 °C bez wahań jest kluczowe dla eksperymentu.</li>
	<li>Przeprowadzić obrazowanie time-lapse przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw imersyjny 100x 1,49 N.A., konfokalny system z podwójnym dyskiem obrotowym oraz niezawodny system autofokusa do ciągłego utrzymywania płaszczyzny ostrości. Parametry obrazowania zdefiniować w następujący sposób. 
	UWAGA: Stosujemy kamerę EM-CCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device).
	<ol>
		<li>Do wzbudzenia EB3-tdTomato użyć linii lasera 561 nm z czasem ekspozycji 200 ms. Emitowane światło zbierać poprzez czteropasmowe lustro dichroiczne (405, 488, 561, 640 nm) i filtr emisyjny 600/52 nm. 
		UWAGA: Moc lasera może być dostosowywana dla każdej obrazowanej komórki, aby zapobiec nasyceniu obrazu. We wszystkich przedstawionych tutaj filmach time-lapse moc lasera została ustawiona na 5,3 mW.</li>
		<li>Znaleźć komórkę w profazie i ustawić ostrość w płaszczyźnie Z odpowiadającej centrum monopolarnego wrzeciona mitotycznego. Pozyskiwać obrazy co 0,5 s przez łącznie 1 min, bez binningu i bez oświetlenia pomiędzy ekspozycjami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza dynamiki MT przy użyciu oprogramowania U-Track v2.2.0
<ol>
	<li>Do analizy dynamiki MT wymagane jest oprogramowanie do obliczeń numerycznych (np. MATLAB). 
	UWAGA: Do przeprowadzenia analizy wystarczy podstawowa znajomość oprogramowania. Kompleksowe materiały pomocnicze i samouczki są dostępne na stronie internetowej producenta (https://uk.mathworks.com/products/&#173;matlab/&#173;getting-started.html).</li>
	<li>Pobrać (https://github.com/DanuserLab/u-track) i zainstalować otwartoźródłowe oprogramowanie U-Track v2.2.0 zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w pliku „Readme_u-track.pdf”50,51,52.</li>
	<li>Uruchomić oprogramowanie do analizy numerycznej i dodać folder U-Track v2.2.0 wraz z podfolderami do ścieżki wyszukiwania oprogramowania.</li>
	<li>Z okna poleceń wywołać „movieSelectorGUI”. Otworzy to okno dialogowe, z którego można zaimportować surowe pliki wygenerowane przez oprogramowanie do akwizycji obrazu w mikroskopie (Rysunek dodatkowy 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4). 
	UWAGA: Oprogramowanie U-Track jest kompatybilne z innymi formatami danych obrazowych. Wykorzystuje ono Bio-Formats, który rozpoznaje różne formaty danych stosowane w naukach o życiu53.</li>
	<li>Rozmiar każdego obrazu jest odczytywany automatycznie z metadanych. Ręcznie wprowadzić aperturę numeryczną obiektywu (w tym przypadku 1,49) oraz odstęp czasu (0,5 s) zastosowany podczas obrazowania (Rysunek dodatkowy 1B). Dodatkowo można podać informacje o długości fali wzbudzenia, fluoroforze i czasie ekspozycji, ale nie są one kluczowe dla dalszej analizy.</li>
	<li>Po załadowaniu wszystkich obrazów zapisać wprowadzoną serię time-lapse jako listę filmów, wybierając opcję „Save As Movie List”. Po prawej stronie okna dialogowego wybrać opcję „U-Track” i nacisnąć „Continue” (Rysunek dodatkowy 1C). 
	UWAGA: Wartości zostały zoptymalizowane dla komórek HeLa. W przypadku przejścia na inną linię komórkową wartości należy zdefiniować ponownie. Alternatywnie można skorzystać z ustawień zalecanych przez twórców oprogramowania. Szczegółowe wyjaśnienie każdego z parametrów oraz sposób ich definiowania można znaleźć w raporcie technicznym dostarczonym z poprzednią wersją oprogramowania, plusTipTracker50.</li>
	<li>Z okna pop-up wybrać „Microtubule Plus-Ends” i nacisnąć „Ok” (Rysunek dodatkowy 1C). Nowe okno dialogowe umożliwia określenie parametrów dla trzech etapów analizy (Rysunek dodatkowy 1D), którymi są detekcja, śledzenie oraz analiza ścieżek.</li>
	<li>W kroku 1 wybrać „Settings” i z menu rozwijanego wybrać „Comet Detection” jako metodę detekcji (Rysunek dodatkowy 2B).
	<ol>
		<li>W nowym oknie dialogowym zdefiniować parametry filtra różnicy Gaussianów (DoG) oraz segmentacji watershed w następujący sposób (Rysunek dodatkowy 2C): Mask process to be used for the detection = None; Low-pass Gaussian standard deviation = 1 pixel; High-pass Gaussian standard deviation = 3 pixels; Minimum threshold = 3 standard deviations; Threshold step size = 0,25 standard deviations. Wybrać „Apply Settings to All Movies” i „Apply”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W kroku 2 parametry funkcji łączenia (linking), zamykania przerw (gap closing), scalania i rozdzielania (merging and splitting) oraz filtra Kalmana są definiowane w trzech etapach, odpowiednio zaznaczonych kolorem różowym, zielonym i niebieskim (Rysunek dodatkowy 3B). Dla tych etapów wybrać „Microtubule Plus-end Dynamics” i w opcji „Setting” zdefiniować wartości zgodnie z tym, co wskazano odpowiednio na Rysunku dodatkowym 3C–E.
	<ol>
		<li>W przypadku problemów z wymiarowością wybrać „2” z menu rozwijanego. Ustawić Maximum Gap to Close = 5 frames; Minimum Length of Track Segments from First Step = 3 frames. Podobnie jak wcześniej, wybrać „Apply Settings to All Movies” i kliknąć „Apply”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W kroku 3 analizy wykryte ścieżki MT są klasyfikowane (Rysunek dodatkowy 4). Jako metodę analizy ścieżek wybrać „Microtubule Dynamics Classification” i zdefiniować parametry za pomocą przycisku „Setting”, jak wskazano na Rysunku dodatkowym 4B,C. Następnie zaznaczyć pole „Apply Settings to All Movies” i kliknąć „Apply”.</li>
	<li>Po zdefiniowaniu wszystkich parametrów w oknie „Control Panel–U-Track” (Rysunek dodatkowy 1D) zaznaczyć pola „Apply Check/Uncheck to All Movies” oraz „Run All Movies” i nacisnąć „Run”. Rozpocznie to analizę MT serii time-lapse.</li>
	<li>Po zakończeniu przetwarzania filmów wyświetli się komunikat „Your movie(s) have been processed successfully”. Nacisnąć „Ok”, a następnie „Save”.</li>
	<li>Można teraz bezpiecznie zamknąć oprogramowanie do analizy numerycznej. Wyniki przetwarzania filmów są przechowywane w strukturach podfolderów jako pliki m-files w folderze, w którym znajdują się pliki surowe.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna dynamiki mikrotubul
<ol>
	<li>Zaimportuj pliki m-files do preferowanego programu do analizy statystycznej. 
	UWAGA: W naszym przypadku najpierw importujemy pliki do standardowego arkusza kalkulacyjnego, aby były czytelne. Pliki m-files zawierają informacje statystyczne (medianę, średnią i odchylenie standardowe) dotyczące różnych parametrów (np. prędkości wzrostu, dynamiki MT). Szczegółowa lista parametrów znajduje się w raporcie technicznym dostarczonym z poprzednią wersją oprogramowania plusTipTracker50,52. Wygenerowane pliki m-files można również zaimportować do innego oprogramowania do przetwarzania danych.</li>
	<li>Wybierz parametr &#34;growth speed mean&#34; i zaimportuj go do tabeli w celu przeprowadzenia analizy statystycznej i prezentacji danych. Informacje o innych parametrach (np. &#34;dynamicity&#34;) wprowadź do nowej tabeli lub do nowej kolumny tej samej tabeli zgrupowanej i wykresu.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy modyfikację metody ustanowionej po raz pierwszy przez Ertycha i wsp.44. Wraz z kilkoma innymi modyfikacjami łączymy tę technikę analizy dynamiki MT z obrazowaniem konfokalnym z podwójnym wirującym dyskiem. Zastosowanie podwójnego wirującego dysku poprawia rozdzielczość rosnących MT przy jednoczesnym zmniejszeniu fototoksyczności36. Jeszcze bardziej zmniejszamy fotowybielanie i uszkodzenia komórek wywołane światłem laserowym, przełączając się na repor...

Mikrotubule (MT) są wysoce dynamicznymi strukturami występującymi praktycznie we wszystkich komórkach eukariotycznych oraz u niektórych bakterii1. Wraz z aktyną i włóknami pośrednimi rzeźbią cytoszkielet2,3. Podział komórek4, transport molekuł5, bicie wici6, odczucie otaczającego środowiska przez pierwotną rzęskę7, słuch (kinocilium)8,9, embriogeneza10,11,12, inwazja i przerzuty13,14, a nawet tworzenie pamięci15,16,17,18, a wiele innych procesów opiera się głównie na MT. Udział MT we wszystkich tych wydarzeniach byłby niemożliwy bez ich niezwykłej zdolności do szybkiego przełączania się między wzrostem (polimeryzacją) a kurczeniem się (depolimeryzacją). Ta właściwość jest opisana jako niestabilność dynamiczna19. Dynamika MT ulega zmianie w wielu stanach patologicznych20,21,22. W związku z tym określenie charakteru tej właściwości może pomóc w zrozumieniu mechanizmów choroby, a następnie ich leczenia.
Opracowano długą listę metod analizy dynamiki MT, z których większość opiera się na technikach obrazowania23. Początkowo mikroskopy świetlne o szerokim polu widzenia były używane do obserwacji powstawania polimerów tubuliny in vitro24. Odkrycie białek wiążących końcówki (EB), które gromadzą się na plus-końcach MT oraz opracowanie metod fluorescencyjnego znakowania białek umożliwiło obserwację zachowania MT bezpośrednio w żywych komórkach za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych o szerokim polu i konfokalnych25,26,27. Jedno białko EB to białko wiążące koniec 3 (EB3)28; poprzez nadekspresję i śledzenie EB3 połączonego z białkiem fluorescencyjnym, można określić szybkość składania plus-end MT 29,30.
Konfokalna laserowa skaningowa mikroskopia fluorescencyjna (CLSM) jest często używana do śledzenia dynamiki MT. Jednak ta technika obrazowania stwarza wysokie ryzyko fototoksyczności i fotowybielania, dwóch niepożądanych procesów obrazowania żywych komórek i próbek przyciemnionych31. Aby uzyskać lepszy stosunek sygnału do szumu, moc lasera i czas naświetlania powinny być wystarczająco wysokie, a jednocześnie nie uszkadzać próbek, a to wymaga poświęcenia rozdzielczości w zamian za szybkość. Odpowiednią alternatywą dla CLSM jest mikroskopia z wirującym dyskiem32. Ta metoda obrazowania opiera się na użyciu dysku Nipkowa 33, który składa się z ruchomego dysku z układem otworków i działa równoważnie z wieloma mikroskopami CLS obrazującymi tę samą próbkę jednocześnie34. Dlatego światło z lasera oświetli jednocześnie kilka obszarów w próbce, ale zachowa konfokalny charakter. Dysk Nipkow pozwala więc na uzyskanie obrazów podobnych do CLSM, ale szybszych i przy mniejszym zużyciu mocy lasera. Dysk Nipkow został dodatkowo ulepszony przez Yokogawa Electric, która wprowadziła drugi dysk z układem mikrosoczewek, które indywidualnie kierują światło do odpowiedniego otworka, co jeszcze bardziej zmniejsza fototoksyczność i fotowybielanie35. W ten sposób laserowa mikroskopia skaningowa z wirującym dyskiem stała się metodą z wyboru do obrazowania żywych komórek i umożliwia uzyskanie obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu przy dużej prędkości31,36, co ma kluczowe znaczenie dla rozdzielczości sygnałów, takich jak te z szybko rosnących końców MT.
MT dynamika różni się tymczasowo. Na przykład mitotyczne MT są bardziej dynamiczne niż międzyfazowe37,38. Podobnie, różnice w szybkości wzrostu i kurczenia się zaobserwowano nawet w tej samej fazie cyklu komórkowego, np. mitosis39,40. W związku z tym, aby uniknąć gromadzenia fałszywych danych, pomiar dynamiki MT powinien być ograniczony do wąskiego okna czasowego podczas cyklu komórkowego. Na przykład, pomiar dynamiki MT w prometafazie można osiągnąć, traktując komórki dimetylenastronem (DME), analogiem monoastrolu, który hamuje kinezynę motoryczną Eg541 i zapobiega tworzeniu się dwubiegunowego wrzeciona mitotycznego42. Hamowanie komórek w prometafazie za pomocą inhibitora Eg5 DME i innych pochodnych monoastrolu nie wpływa na dynamikę MT43,44,45, co sprawia, że DME jest użytecznym narzędziem do badania dynamiki MT zarówno w stałych, jak i żywych komórkach44.
Tutaj łączymy metodę analizy dynamiki MT w komórkach prometafazowych opisaną przez Ertych et al.44 z obrazowaniem podwójnego wirującego dysku. Metoda ta umożliwia pomiar dynamiki MT w komórkach prometafazy pobranych z pojedynczej płaszczyzny ogniskowej z większą szybkością obrazowania, ale bez fotowybielania i minimalnej fototoksyczności. Ponadto, jako reporter fluorescencyjny, używamy tandemowego dimera białka fluorescencyjnego pomidora (tdTomato), które ma lepszą jasność i fotostabilność w porównaniu z białkiem zielonej fluorescencji (EGFP) i jest wzbudzane światłem o niższej energii46. Dlatego tdTomato wymaga mniejszej mocy lasera do wzbudzenia i jest mniej fototoksyczny. Ogólnie rzecz biorąc, jeszcze bardziej udoskonaliliśmy tę metodę, zmniejszając fototoksyczność oraz poprawiając rozdzielczość i przetwarzanie końcowe wymagane do analizy dynamiki MT. Dodatkowo tworzymy bazę do przyszłych modyfikacji metody poprzez łączenie jej z innymi technikami synchronizacji.

<table><tbody><tr><td>Dimetylenastron</td><td>Merck</td><td>324622</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>31053-28</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biochrom</td><td>S0415</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna Osocze bydlęce</td><td>Merck</td><td>F4759</td><td>Sterylny proszek</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Stabilny substytut glutaminy</td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>EB3-TdTomato</td><td>Addgene</td><td>plazmid #50708</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>0,05%/0,02 % w/o wapń i magnez</td></tr><tr><td> szkiełko</td><td>Ibidi</td><td>80426</td><td>4-dołkowe z szkiełkiem nakrywkowym #1,5</td></tr><tr><td>Eclipse Ti Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>CFI Apo TIRF 100xC Olej</td></tr><tr><td>ACAL Laser Excahnger</td><td>Nikon</td><td></td><td>Skrzynka laserowa. 405, 458, 488, 514, 561 i 647 nm</td></tr><tr><td>Moduł dysku obrotowego</td><td>Andor</td><td>CSU-W</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td> Komora środowiskowa <td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Okolab</td><td></td><td>Ciemna komora wyposażona w zasilanie CO2, regulację temperatury i nawilżacz</td></tr><tr><td>HeLa Cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements v4</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskop z wirującym dyskiem. Oprogramowanie do akwizycji</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Środowisko obliczeniowe</td></tr><tr><td>Prism 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej i wyświetlania</td></tr></tbody></table>

pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

Opisujemy modyfikację ustalonej metody określania dynamiki mikrotubul w żywych komórkach. Protokół opiera się na ekspresji genetycznie kodowanego markera dodatnich końców mikrotubul (EB3 znakowany białkiem fluorescencyjnym tdTomato) oraz szybkim obrazowaniu żywych komórek o wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Synchronizację cyklu komórkowego i zwiększenie gęstości mikrotubul uzyskuje się poprzez hamowanie separacji centrosomalnej w komórkach mitotycznych, a analizę wzrostu przeprowadza się za pomocą oprogramowania U-Track o otwartym kodzie źródłowym. Zastosowanie jasnego i przesuniętego ku czerwieni białka fluorescencyjnego, w połączeniu z niższą mocą lasera i skróconym czasem ekspozycji wymaganym do mikroskopii wirującego dysku, zmniejsza fototoksyczność i prawdopodobieństwo artefaktów wywołanych światłem. Pozwala to na obrazowanie większej liczby komórek w tym samym preparacie przy jednoczesnym utrzymaniu komórek w pożywce wzrostowej w standardowych warunkach hodowli. Ponieważ analiza jest wykonywana w sposób nadzorowany automatycznie, wyniki są statystycznie solidne i powtarzalne.

Zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 1A, plazmid pEB3-tdTomato wykazano w formie ekspresji przejściowej w asynchronicznie rosnących komórkach HeLa. Komórki zsynchronizowano 48 h po transfekcji w prometafazie poprzez traktowanie DME (Rysunek 1B). Krok ten zapewnił, że pomiary dynamiki MT zawsze przeprowadzano w tej samej fazie cyklu komórkowego. Filmy time-lapse zostały następnie przetworzone i przeanalizowane za pomocą oprogramowania U-Track v2.2.0, zg...

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

To, co tutaj prezentujemy, to solidna i prosta metoda analizy dynamiki mikrotubul przy użyciu obrazowania konfokalnego z żywym dyskiem wirującym w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie, a obrazy są następnie analizowane na platformie opartej na MATLAB. Zastosowanie białka fluorescencyjnego z przesunięciem ku czerwieni w połączeniu z mikroskopią wirującego dysku zmniejsza fototoksyczność. W związku z tym w ramach tego samego preparatu można zobrazować większą liczbę komórek.Dynamika mikrotubul jest zmieniona w wielu stanach patologicznych. Dlatego zrozumienie regulacji i zachowania dynamiki mikrotubul w tych procesach może pomóc nam zrozumieć mechanizm choroby i ostatecznie opracować terapie, które je skompensują. Metoda ta jest również skalowalna, więc może potencjalnie zostać zastosowana w wysiłkach związanych z odkrywaniem leków.Metodę można modyfikować poprzez zmianę protokołu desynchronizacji fluorescencji i uzyskanie komórek z różnych faz cyklu komórkowego. Może to być przydatne podczas badań przesiewowych leków pod kątem mikrotubul i identyfikacji defektów w komórkach dzielących się i niedzielących się. Konieczna jest optymalizacja protokołu transfekcji i gęstości wysiewu dla każdego typu komórek.Poziom ekspresji EB3 powinien być niski, aby wykryć pojedyncze rosnące mikrotubule. Zacznij od płukania asynchronicznie rosnących komórek HeLa w DPBS, a następnie inkubuj je z trypsyną-EDTA przez pięć minut, w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zatrzymaj trypsynizację, dodając pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FCS w stosunku trzy do jednego, dodaną trypsynę-EDTA.Oblicz stężenie komórek zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i umieść 50 000 komórek w każdym dołku przygotowanego, komorowego szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem w inkubatorze i hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia wyjmij komórki z inkubatora i kroplami dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcji do każdej studzienki.Umieść komórki z powrotem w inkubatorze, a po czterech godzinach inkubacji uzupełnij komórki świeżą pożywką i dodatkowo inkubuj przez 20 godzin. Przygotuj 2,5 mikromolowy roztwór dimetylenastronu lub DME w DMEM wolnym od czerwieni fenolowej, uzupełniony 10% FCS i dwiema milimolowymi L-glutaminą. Zastąp pożywkę wzrostową w komorowym szkiełku nakrywkowym pożywką wzrostową DME i włóż komórki z powrotem do inkubatora.Po 3,5 godziny inkubacji przenieś komórki do mikroskopu, montując szkiełko nakrywkowe z komorą w komorze środowiskowej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, z ciemnymi panelami do obrazowania. Następnie kontynuuj inkubację przez łącznie cztery godziny. Wykonaj obrazowanie poklatkowe na mikroskopie odwróconym ze 100-krotnym otworem ostrości, aperturą numeryczną 1,49, obiektywem zanurzonym w olejku, dwudyskowym systemem konfokalnym i niezawodnym systemem automatycznego ustawiania ostrości.Zdefiniuj parametry obrazowania zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Znajdź komórkę w profazie i skup się na płaszczyźnie Z odpowiadającej środkowi monopolarnego wrzeciona mitotycznego. Następnie rejestruj obrazy co 5 sekund, w sumie przez jedną minutę, bez łączenia w grupy i bez oświetlenia między ekspozycjami.Zacznij od załadowania oprogramowania do analizy numerycznej i dodania folderu u-track V2.2.0 do ścieżki wyszukiwania oprogramowania, nazywanej graficznym interfejsem użytkownika selektora filmu, w oknie poleceń. Następnie zaimportuj pliki RAW wygenerowane przez oprogramowanie do akwizycji obrazów. Ręcznie wprowadź aperturę numeryczną obiektywu i przedział czasu używany do obrazowania.Po załadowaniu wszystkich obrazów zapisz wprowadzoną serię poklatkową jako film, wybierając opcję Zapisz jako listę filmów i opcję u-track po prawej stronie okna dialogowego. Z menu podręcznego wybierz końcówki plus-end mikrotubul i kliknij przycisk OK, co spowoduje otwarcie nowego okna dialogowego w celu określenia parametrów trzech etapów analizy. Aby wykonać krok pierwszy, kliknij ustawienia i wybierz wykrywanie komety z menu rozwijanego.Zdefiniuj parametry różnicy filtra Gaussa i segmentacji działu wodnego, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie wybierz zastosuj ustawienia do wszystkich filmów i kliknij Zastosuj. W kroku drugim wybierz dynamikę plus-end mikrotubuli i użyj opcji ustawień, aby zdefiniować wartości funkcji łączenia, zamykania odstępów, łączenia i dzielenia oraz filtrów Kalmana, zgodnie z rękopisem tekstowym.W przypadku problemów z wymiarowością wybierz dwie z menu rozwijanego i użyj pięciu klatek, aby uzyskać maksymalną przerwę do zamknięcia, oraz trzech klatek, aby uzyskać minimalną długość segmentów ścieżki od pierwszego kroku. Tak jak poprzednio, wybierz opcję Zastosuj ustawienia do wszystkich filmów i kliknij przycisk Zastosuj. W kroku trzecim wybierz klasyfikację dynamiki mikrotubul jako metodę analizy toru i zdefiniuj parametry za pomocą przycisku ustawień.Zaznacz pola usuwania ścieżek na początku i na końcu filmu, a następnie utwórz histogramy statystyk. Z listy rozwijanej wybierz opcję Użycie dwóch do trzech klatek przed przerwą w przód i 95. percentyla rozkładu prędkości przerwy w przód, odpowiednio dla reklasyfikacji do przodu i do tyłu. Po zdefiniowaniu wszystkich parametrów wybierz opcję Zastosuj zaznaczenie/odznacz do wszystkich filmów i uruchom pola Wszystkie filmy w oknie u-track w panelach sterowania, a następnie naciśnij przycisk uruchom.Po zakończeniu przetwarzania filmu wyświetlany jest komunikat. Plazmid pEB3-tdTomato ulegał przejściowej ekspresji w komórkach HeLa. Komórki zostały zsynchronizowane z leczeniem DME.Przeanalizowano filmy poklatkowe wzrostu mikrotubul i wykreślono wynikającą z nich szybkość i dynamikę wzrostu. Parametry opisane w celu wpłynięcia na analizę, takie jak maksymalna długość szczeliny i maksymalny współczynnik skurczu, zostały zmodyfikowane dla tego samego zestawu filmów poklatkowych. Obliczono odpowiednie wartości szybkości i dynamiki wzrostu.Podczas gdy wynikająca z tego prędkość wzrostu nie uległa znaczącemu wpływowi, dynamika była inna, gdy zmodyfikowano maksymalną długość przerwy. We wszystkich trzech przypadkach detekcja podtorów mikrotubul była podobna, jednak rekonstrukcja pełnych trajektorii MT była najbardziej zaburzona, gdy maksymalna długość przerwy została ustawiona na 15. Aby ocenić, czy warunki obrazowania zakłócają zachowanie mikrotubul, pierwszą i drugą połowę serii poklatkowej analizowano oddzielnie, a następnie porównano odpowiadającą im szybkość i dynamikę wzrostu.Zgodnie z oczekiwaniami nie wykryto istotnych różnic. Ważne jest, aby pamiętać, że ponieważ komórki są zsynchronizowane w prometafazie, gęstość mikrotubul jest bardzo wysoka. Dlatego należy bardzo ostrożnie ustawiać parametry analizy, aby nie pomylić się w identyfikacji różnych mikrotubul.Pomiar dynamiki mikrotubul tą metodą można porównać z badaniami innych celów biologicznych bezpośrednio, pośrednio, regulujących mikrotubule.

measurement-microtubule-dynamics-spinning-disk-microscopy-monopolar

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii interferencyjnej (IRM) do wizualizacji mikrotubul rosnących na powierzchni szkiełka nakrywkowego w obecności odpowiedniego bufora. Po oświetleniu padającym światłem, interfejs szkiełko nakrywkowe-bufor i interfejs bufor-mikrotubula odbijają światło, które łączy się, tworząc wzór interferencyjny, umożliwiając wizualizację mikrotubul jako obrazów o wysokim kontraście na jasnym tle.

Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Mikrotubule są z natury niestabilnymi polimerami, a ich przełączanie między wzrostem a skracaniem jest stochastyczne i trudne do kontrolowania. Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące segmentowane mikrotubule z fotoablakowalnymi czapeczkami stabilizującymi. Depolimeryzacja segmentowanych mikrotubul może być wyzwalana z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną, wspomagając w ten sposób analizę ruchów z demontującymi końcami mikrotubul.

Przygotowanie segmentowanych mikrotubul do badania ruchów napędzanych przez demontujące się końce mikrotubul

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Dynamiczna mikroskopia różnicowa (DDM) łączy w sobie cechy dynamicznego rozpraszania światła i mikroskopii. W tym artykule przedstawiono proces wykorzystania DDM do scharakteryzowania odtworzonych sieci cytoszkieletów poprzez ilościowe określenie subdyfuzyjnej i zamkniętej w klatce dynamiki cząstek w sieciach wimentynowych oraz ruchu balistycznego aktywnych kompozytów aktynowo-mikrotubulowych napędzanych miozyną.

Kwantyfikacja dynamiki cytoszkieletu za pomocą dynamicznej mikroskopii różnicowej

Poznaj metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach HeLa zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii wirujących dysków i platformy MATLAB. Technika ta umożliwia zmniejszenie fototoksyczności.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Przeglądaj więcej filmów