Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych
15 listopada 2019
Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.
To, co tutaj prezentujemy, to solidna i prosta metoda analizy dynamiki mikrotubul przy użyciu obrazowania konfokalnego z żywym dyskiem wirującym w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie, a obrazy są następnie analizowane na platformie opartej na MATLAB. Zastosowanie białka fluorescencyjnego z przesunięciem ku czerwieni w połączeniu z mikroskopią wirującego dysku zmniejsza fototoksyczność. W związku z tym w ramach tego samego preparatu można zobrazować większą liczbę komórek.
Dynamika mikrotubul jest zmieniona w wielu stanach patologicznych. Dlatego zrozumienie regulacji i zachowania dynamiki mikrotubul w tych procesach może pomóc nam zrozumieć mechanizm choroby i ostatecznie opracować terapie, które je skompensują. Metoda ta jest również skalowalna, więc może potencjalnie zostać zastosowana w wysiłkach związanych z odkrywaniem leków.
Metodę można modyfikować poprzez zmianę protokołu desynchronizacji fluorescencji i uzyskanie komórek z różnych faz cyklu komórkowego. Może to być przydatne podczas badań przesiewowych leków pod kątem mikrotubul i identyfikacji defektów w komórkach dzielących się i niedzielących się. Konieczna jest optymalizacja protokołu transfekcji i gęstości wysiewu dla każdego typu komórek.
Poziom ekspresji EB3 powinien być niski, aby wykryć pojedyncze rosnące mikrotubule. Zacznij od płukania asynchronicznie rosnących komórek HeLa w DPBS, a następnie inkubuj je z trypsyną-EDTA przez pięć minut, w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zatrzymaj trypsynizację, dodając pożywkę RPMI-1640 uzupełnioną 10% inaktywowanym termicznie FCS w stosunku trzy do jednego, dodaną trypsynę-EDTA.
Oblicz stężenie komórek zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i umieść 50 000 komórek w każdym dołku przygotowanego, komorowego szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko nakrywkowe z powrotem w inkubatorze i hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia wyjmij komórki z inkubatora i kroplami dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny transfekcji do każdej studzienki.
Umieść komórki z powrotem w inkubatorze, a po czterech godzinach inkubacji uzupełnij komórki świeżą pożywką i dodatkowo inkubuj przez 20 godzin. Przygotuj 2,5 mikromolowy roztwór dimetylenastronu lub DME w DMEM wolnym od czerwieni fenolowej, uzupełniony 10% FCS i dwiema milimolowymi L-glutaminą. Zastąp pożywkę wzrostową w komorowym szkiełku nakrywkowym pożywką wzrostową DME i włóż komórki z powrotem do inkubatora.
Po 3,5 godziny inkubacji przenieś komórki do mikroskopu, montując szkiełko nakrywkowe z komorą w komorze środowiskowej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, z ciemnymi panelami do obrazowania. Następnie kontynuuj inkubację przez łącznie cztery godziny. Wykonaj obrazowanie poklatkowe na mikroskopie odwróconym ze 100-krotnym otworem ostrości, aperturą numeryczną 1,49, obiektywem zanurzonym w olejku, dwudyskowym systemem konfokalnym i niezawodnym systemem automatycznego ustawiania ostrości.
Zdefiniuj parametry obrazowania zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Znajdź komórkę w profazie i skup się na płaszczyźnie Z odpowiadającej środkowi monopolarnego wrzeciona mitotycznego. Następnie rejestruj obrazy co 5 sekund, w sumie przez jedną minutę, bez łączenia w grupy i bez oświetlenia między ekspozycjami.
Zacznij od załadowania oprogramowania do analizy numerycznej i dodania folderu u-track V2.2.0 do ścieżki wyszukiwania oprogramowania, nazywanej graficznym interfejsem użytkownika selektora filmu, w oknie poleceń. Następnie zaimportuj pliki RAW wygenerowane przez oprogramowanie do akwizycji obrazów. Ręcznie wprowadź aperturę numeryczną obiektywu i przedział czasu używany do obrazowania.
Po załadowaniu wszystkich obrazów zapisz wprowadzoną serię poklatkową jako film, wybierając opcję Zapisz jako listę filmów i opcję u-track po prawej stronie okna dialogowego. Z menu podręcznego wybierz końcówki plus-end mikrotubul i kliknij przycisk OK, co spowoduje otwarcie nowego okna dialogowego w celu określenia parametrów trzech etapów analizy. Aby wykonać krok pierwszy, kliknij ustawienia i wybierz wykrywanie komety z menu rozwijanego.
Zdefiniuj parametry różnicy filtra Gaussa i segmentacji działu wodnego, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie wybierz zastosuj ustawienia do wszystkich filmów i kliknij Zastosuj. W kroku drugim wybierz dynamikę plus-end mikrotubuli i użyj opcji ustawień, aby zdefiniować wartości funkcji łączenia, zamykania odstępów, łączenia i dzielenia oraz filtrów Kalmana, zgodnie z rękopisem tekstowym.
W przypadku problemów z wymiarowością wybierz dwie z menu rozwijanego i użyj pięciu klatek, aby uzyskać maksymalną przerwę do zamknięcia, oraz trzech klatek, aby uzyskać minimalną długość segmentów ścieżki od pierwszego kroku. Tak jak poprzednio, wybierz opcję Zastosuj ustawienia do wszystkich filmów i kliknij przycisk Zastosuj. W kroku trzecim wybierz klasyfikację dynamiki mikrotubul jako metodę analizy toru i zdefiniuj parametry za pomocą przycisku ustawień.
Zaznacz pola usuwania ścieżek na początku i na końcu filmu, a następnie utwórz histogramy statystyk. Z listy rozwijanej wybierz opcję Użycie dwóch do trzech klatek przed przerwą w przód i 95. percentyla rozkładu prędkości przerwy w przód, odpowiednio dla reklasyfikacji do przodu i do tyłu. Po zdefiniowaniu wszystkich parametrów wybierz opcję Zastosuj zaznaczenie/odznacz do wszystkich filmów i uruchom pola Wszystkie filmy w oknie u-track w panelach sterowania, a następnie naciśnij przycisk uruchom.
Po zakończeniu przetwarzania filmu wyświetlany jest komunikat. Plazmid pEB3-tdTomato ulegał przejściowej ekspresji w komórkach HeLa. Komórki zostały zsynchronizowane z leczeniem DME.
Przeanalizowano filmy poklatkowe wzrostu mikrotubul i wykreślono wynikającą z nich szybkość i dynamikę wzrostu. Parametry opisane w celu wpłynięcia na analizę, takie jak maksymalna długość szczeliny i maksymalny współczynnik skurczu, zostały zmodyfikowane dla tego samego zestawu filmów poklatkowych. Obliczono odpowiednie wartości szybkości i dynamiki wzrostu.
Podczas gdy wynikająca z tego prędkość wzrostu nie uległa znaczącemu wpływowi, dynamika była inna, gdy zmodyfikowano maksymalną długość przerwy. We wszystkich trzech przypadkach detekcja podtorów mikrotubul była podobna, jednak rekonstrukcja pełnych trajektorii MT była najbardziej zaburzona, gdy maksymalna długość przerwy została ustawiona na 15. Aby ocenić, czy warunki obrazowania zakłócają zachowanie mikrotubul, pierwszą i drugą połowę serii poklatkowej analizowano oddzielnie, a następnie porównano odpowiadającą im szybkość i dynamikę wzrostu.
Zgodnie z oczekiwaniami nie wykryto istotnych różnic. Ważne jest, aby pamiętać, że ponieważ komórki są zsynchronizowane w prometafazie, gęstość mikrotubul jest bardzo wysoka. Dlatego należy bardzo ostrożnie ustawiać parametry analizy, aby nie pomylić się w identyfikacji różnych mikrotubul.
Pomiar dynamiki mikrotubul tą metodą można porównać z badaniami innych celów biologicznych bezpośrednio, pośrednio, regulujących mikrotubule.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia niezawodną metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie, z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii dyskowej (spinning disk) żywych komórek oraz przetwarzania obrazów w programie MATLAB. Technika ta ogranicza fototoksyczność, co umożliwia obrazowanie większej liczby komórek i przyczynia się do zrozumienia dynamiki mikrotubul zarówno w warunkach prawidłowych, jak i patologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Dynamika mikrotubul
- Synchronizacja komórek
- Obrazowanie żywych komórek
Wstęp
- Dynamika mikrotubul ma kluczowe znaczenie dla podziału komórki i ulega zaburzeniom w wielu chorobach.
- Zrozumienie ich regulacji może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów chorobowych.
- Metodę tę można również dostosować do prac nad odkrywaniem nowych leków.
Zastosowane metody
- Konfokalna mikroskopia dysku obrotowego w żywych komórkach
- Komórki HeLa zsynchronizowane w prometafazie
- Zsynchronizowany obrazowanie z wykorzystaniem białek fluorescencyjnych o przesunięciu ku czerwieni
Główne wyniki
- Kompleksowa analiza dynamiki końców plus mikrotubul.
- Dane wskazały na minimalny wpływ ustawień obrazowania na prędkość wzrostu, ale znaczące efekty w odniesieniu do dynamiki.
- Osiągnięto stabilne śledzenie i charakteryzację zachowania mikrotubul podczas podziału komórki.
Wnioski
- Badanie przedstawia szczegółową metodę badania dynamiki mikrotubul, która może znaleźć zastosowanie w badaniach klinicznych i opracowywaniu leków.
- Niniejsza praca pogłębia zrozumienie zachowania mikrotubul w komórkach oraz potencjalnych celów terapeutycznych w chorobach z nimi związanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie dynamiki mikrotubul jest kluczowe dla walidacji celów w programach onkologicznych i badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi, w których dysregulacja cytoszkieletu napędza patologię. Metoda ta umożliwia ilościową analizę wysokotreściową (high-content analysis) zachowania mikrotubul w zsynchronizowanych komórkach w fazie mitozy, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku związków ukierunkowanych na tubulinę lub związane z nią regulatory. Dzięki ograniczeniu fototoksyczności i umożliwieniu skalowalnego obrazowania, metoda ta zwiększa wiarygodność danych oraz pewność translacyjną w początkowych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie dynamiki końców plus mikrotubul jako funkcjonalny odczyt zaangażowania celu w szlakach mitotycznych.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje EB3-tdTomato oraz mikroskopię dysku obrotowego do wykrywania pojedynczych rosnących mikrotubul przy niskiej fototoksyczności, co zapewnia powtarzalność pomiarów.
- Wartość prognostyczna: Dostarcza wskaźników dynamiki, które korelują z wpływem związków na wierność mitozy, pomagając w identyfikacji i priorytetyzacji związków wiodących.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe wyniki prędkości wzrostu i dynamiki za pomocą oprogramowania U-Track, co umożliwia standaryzowany screening czynników modulujących mikrotubule.
- Skalowalność: Pozwala na obrazowanie większych populacji komórek w standardowych warunkach hodowli, zwiększając przepustowość profilowania związków.
- Powtarzalność: Nadzorowana analiza automatyczna zapewnia solidność statystyczną pomiędzy powtórzeniami, co wspiera przenaszalność testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Bezpośrednio mierzy dynamikę mikrotubul zmienioną w warunkach patologicznych, łącząc wyniki uzyskane in vitro z mechanizmami chorobowymi.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od walidacji celu do modeli przedklinicznych poprzez dostarczanie konserwatywnych, mierzalnych fenotypów cytoszkieletu.
- Łagodzenie ryzyka: Umożliwia wczesne wykrycie efektów pozatarcowych na mikrotubule, co zmniejsza odsetek niepowodzeń w późnych etapach badań z powodu cytotoksyczności lub niestabilności genomowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, szczególnie w przypadku projektów skoncentrowanych na inhibitorach mitozy, stabilizatorach lub destabilizatorach mikrotubul.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulatorów mikrotubul poprzez kwantyfikację kinetyki wzrostu i skracania w zsynchronizowanych komórkach.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych odczytów (prędkość wzrostu, dynamika) odpowiednich dla kampanii wysokoprzepustowego przesiewania wysokotreściowego (high-content screening).
- Analityka: Wykorzystuje oprogramowanie U-Track do zautomatyzowanej analizy trajektorii, umożliwiając porównanie statystyczne warunków z zastosowaniem związku w stosunku do grup kontrolnych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy cytoszkieletu z wynikami przedklinicznymi poprzez pomiar dynamiki w kontekstach mitotycznych istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę obrazowania i analizy, którą można zastosować w wielu programach ukierunkowanych na tubulinę.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej związanej ze związkami skierowanymi przeciwko mikrotubulom.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar dynamiki mikrotubul dzięki synchronizacji komórek, ograniczeniu fototoksyczności i zautomatyzowanemu śledzeniu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wczesnych, ilościowych sygnałów dotyczących bezpieczeństwa i skuteczności w odniesieniu do cytoszkieletu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia postęp skorygowany o ryzyko poprzez identyfikację związków o korzystnych profilach modulacji mikrotubul.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek, optymalizacji transfekcji oraz w biologii mikrotubul.
- Zależne od zastosowania konfokalnej mikroskopii dyskowej (spinning disk), kontroli komory środowiskowej oraz obiektywów imersyjnych olejowych o wysokiej aperturze numerycznej (high-NA).
- Wymaga standaryzacji protokołów transfekcji, gęstości wysiewu oraz czasu synchronizacji dla poszczególnych typów komórek.
- Wiąże się z adaptacją parametrów U-Track (np. długości przerwy, współczynnika kurczenia), aby uniknąć błędnej identyfikacji w środowiskach o dużym zagęszczeniu mikrotubul.
- Ograniczone koniecznością uzyskania niskiej ekspresji EB3 w celu rozdzielenia pojedynczych końców plus mikrotubul, co wymaga miareczkowania dla każdej linii komórkowej.
