Sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D na bazie mikrotubul za pomocą temperatury
November 26th, 2019
Celem tego protokołu jest wykorzystanie temperatury do kontrolowania prędkości przepływu trójwymiarowych płynów aktywnych. Zaletą tej metody jest nie tylko regulacja prędkości przepływu in situ, ale także dynamiczna kontrola, taka jak okresowe dostrajanie prędkości przepływu w górę i w dół.
Materia aktywna jest używana w różnych zastosowaniach, takich jak cienie molekularne. Aby przenieść aplikację na wyższy poziom, musimy rozwinąć umiejętność lokalnego kontrolowania materii aktywnej. Zapewniamy łatwą w użyciu metodę, która nie wymaga modyfikacji płynu aktywnego.
Nie ma też potrzeby modyfikowania ścieżki optycznej mikroskopu w celu uzyskania lokalnej kontroli płynu aktywnego. Nasza metoda może być stosowana w szerokim zakresie systemów, w których główne reakcje podlegają błędnemu prawu, takim jak test ślizgowy mikrotubul lub systemy oparte na enzymach. Konfiguracja obejmuje system cyrkulacji wody.
Jeśli dojdzie do nieszczelności, woda może uszkodzić mikroskop. Dlatego przed przyjęciem naszego protokołu ważne jest, aby upewnić się, że system jest wolny od wycieków. Nasz protokół wymaga zamontowania szklanej próbki na stoliku temperaturowym.
Chociaż manuskrypt opisuje procedurę montażu, brakuje w nim mechanicznych subtelności, takich jak mocowanie próbki do stolika. Procedurę zademonstrują Teagan Bate, Edward Jarvis i Megan Varney. Teagan i Edward są studentami studiów magisterskich, a Megan jest studentką studiów licencjackich w laboratorium.
Aby przygotować aktywne płyny w probówce Eppendorfa, wymieszaj 16 punktów siedem mikrolitrów po osiem miligramów na mililitr mikrotubul z sześcioma punktami siedmioma mikrolitrami jednopunktowych ośmiomilimolowych kinezyn i jednym punktem jednym mikrolitrem 500 milimolowych naziemnej telewizji cyfrowej o wysokiej zawartości soli w M2B o wysokiej zawartości soli. Połącz mikrotubule, dodając 11 punktów cztery mikrolitry glikolu polietylenowego o zawartości siedmiu procent wagowych. Następnie aktywuj silniki kinezynowe, dodając dwa przecinki po osiem mikrolitrów 50-milimolowego ATP.
Utrzymuj stężenia ATP, dodając dwa przecinka osiem mikrolitrów podstawowej kinazy pirogronianowej / dehydrogenazy mleczanowej i 13 przecinek trzy mikrolitry 200 milimolowego pirogronianu fosfenolu. Zmniejsz efekt wybielania fotograficznego, dodając 10 mikrolitrów 20-milimolowego Troloxu, jeden punkt jeden mikrolitr trzech przecinków pięciu miligramów na mililitr katalazy, jeden punkt jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr oksydazy glukozowej i jeden punkt jeden mikrolitr 300 miligramów na mililitr glukozy. Śledź ruch płynu, dodając jeden punkt sześć mikrolitrów punktu zerowego zero dwa pięcioprocentowe objętościowo cząstki znacznikowe.
Dodaj M2B o wysokiej zawartości soli, aby uzyskać łączną objętość 100 mikrolitrów. Następnie spłucz szkiełko pokryte poliakrylamidem i szkiełko nakrywkowe wodą DI. Osusz okulary sprężonym powietrzem.
Umieść okulary na czystej, płaskiej powierzchni. Wytnij kanał o szerokości trzech milimetrów w filmie woskowym. Całkowita szerokość jest taka sama jak szkiełko nakrywkowe i wynosi 20 milimetrów.
Włóż wosk między szkiełko podstawowe a szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć kanał komórki przepływowej dla płynu. Przyklej szkło do filmu woskowego, umieszczając kompleks wosku szklanego na płycie grzejnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby stopić wosk. Podczas topienia delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe końcówką pipety, aby równomiernie przykleić warstwę wosku do powierzchni szkła.
Po przyklejeniu schłodzić kompleks szklany do temperatury pokojowej. Przygotowane płyny czynne należy niezwłocznie załadować do kanału przepływowego końcówką pipety pod kątem od otworu kanału i w kontakcie ze szklaną powierzchnią szkiełka. Uszczelnij kanał klejem UV.
Po zbudowaniu zestawu do kontroli temperatury, umieść aktywną próbkę płynu na szafirowej powierzchni tak, aby strona szkiełka stykała się z powierzchnią. Zabezpiecz szkiełko taśmą papierową. Za pomocą taśmy miedzianej przymocuj czujnik ThermoSensor do powierzchni szkiełka przykrywkowego.
Aby zamontować zestaw na stoliku mikroskopu, ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywów, zabezpiecz zestaw za pomocą zacisków igły stolika mikroskopu. Włącz regulator temperatury i pompę do akwarium. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby ustawić temperaturę docelową.
Włącz kontrolę temperatury. I rejestruj dane dotyczące temperatury ThermoSensor. Zobrazuj próbkę ze stałym odstępem czasu na mikroskopii fluorescencyjnej wyposażonej w kostkę filtrującą GFP w celu monitorowania cząstek znacznikowych znakowanych Alexa 488 w mieszaninie aktywnej.
Dostosuj interwał czasu, aby przesunąć smugę między klatkami z dokładnością do dziewięciu pikseli. W przypadku znaczników obrazowych poruszających się z prędkością 10 mikrometrów na sekundę, przy użyciu czterokrotnego obiektywu, zaleca się, aby odstęp czasu wynosił od jednej do pięciu sekund. Zapisz obrazy jako pliki TIF, nazwij pliki na podstawie numeru klatki i przechowuj je w osobnym folderze.
W przypadku tych napędzanych kinezyną płynów aktywnych na bazie mikrotubul temperatura była kontrolowana na poziomie 10, 20, 30 i 40 stopni Celsjusza. Wahania temperatury mieściły się w granicach od jednego do trzech stopni Celsjusza od punktu zerowego przez cztery godziny, co świadczy o stabilności i niezawodności tego systemu kontroli temperatury. Znaczniki były obrazowane co dwie sekundy, co pozwoliło na śledzenie trajektorii znaczników.
Średnie prędkości mierzone od 20 do 36 stopni Celsjusza wydawały się być niemal niezależne od czasu od zera do dwóch godzin. Gdzie przy 10 i 40 stopniach Celsjusza średnie prędkości szybko zanikały, co było spowodowane depolimeryzacją mikrotubul poniżej 16 stopni Celsjusza i nieprawidłowym funkcjonowaniem klastrów kinezyny odpowiednio powyżej 36 stopni Celsjusza. Gdy temperatura systemu zmieniała się między 20 a 30 stopni Celsjusza co 30 minut, średnie prędkości aktywnych płynów nie tylko odpowiednio przyspieszały i zwalniały, ale także reagowały na zmianę temperatury w ciągu 10 sekund.
Aktywne płyny zaczynają działać nieprawidłowo, gdy są schłodzone poniżej 16 lub podgrzane powyżej 36 stopni. Dlatego podczas manipulowania regulatorem temperatury upewnij się, że temperatura wynosi od 16 do 36 stopni. Możliwość lokalnego dostrojenia płynu aktywnego pozwala na kierowanie mocą płynu, np. dostarczanie ładunku z punktu A do punktu B lub opracowanie urządzenia do mikroprzepływowości, które nie wymaga fizycznego zaworu.
Akrylamid używany do powlekania wyrobów szklanych jest neurotoksyną, która może wchłaniać się przez skórę. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, taki jak rękawice, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne, aby zminimalizować ryzyko.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół demonstruje metodę kontroli prędkości przepływu trójwymiarowych aktywnych płynów przy użyciu temperatury. To podejście umożliwia regulację in situ i dynamiczne dostrajanie prędkości przepływu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Materia aktywna
- Dynamika płynów
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Materia aktywna ma zastosowania w różnych dziedzinach, w tym w cieniach molekularnych.
- Lokalna kontrola aktywnych płynów jest niezbędna do rozwoju tych zastosowań.
- Metoda nie wymaga modyfikacji aktywnego płynu.
- Uniknięto również zmian ścieżki optycznej mikroskopu.
Cel badania
- Rozwój prostego metodu do lokalnej kontroli aktywnych płynów.
- Poprawa przydatności materii aktywnej w zastosowaniach naukowych.
- Zapewnienie wszechstronnego podejścia stosowanego do różnych systemów.
Stosowane metody
- Implementacja systemu obiegu wody.
- Manipulacja temperaturą w celu kontroli prędkości przepływu.
- Zastosowanie metody do systemów podlegających błędnemu prawu.
- Wykorzystanie w badaniach glajdingu mikrotubul oraz systemach opartych na enzymach.
Główne wyniki
- Skuteczna regulacja prędkości przepływu in situ.
- Dynamiczna kontrola prędkości przepływu osiągnięta poprzez regulację temperatury.
- Metoda stosowana do szerokiej gamy systemów materii aktywnej.
- Brak konieczności modyfikacji aktywnego płynu lub konfiguracji mikroskopu.
Wnioski
- Protokół oferuje prostą metodę kontroli aktywnych płynów.
- Zwiększa potencjalne zastosowania materii aktywnej w badaniach.
- Ta metoda może prowadzić do postępów w różnych dziedzinach nauki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Temperature-dependent control of microtubule-based active fluids enables tunable flow rates without physical valves, supporting dynamic microfluidic device design. This approach enhances predictive confidence in active matter systems by leveraging Arrhenius kinetics for reproducible speed modulation. The method reduces experimental variability and supports scalable assay development for target validation and phenotypic screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of motor protein function under controlled thermal conditions to validate kinesin-microtubule interactions as therapeutic targets.
- Operational Value: Provides a tunable, reagent-free system for assessing target engagement and pathway modulation in real time.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by correlating temperature-dependent flow changes with motor protein activity, informing lead identification decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, temperature-dependent flow speed readouts (4–8 µm/s) suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise thermal control, improving reproducibility across replicates and laboratories.
- Scalability: Supports microfluidic integration for parallel compound testing without valve-based flow regulation, reducing device complexity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains physiological relevance by operating within 16–36°C range, aligning with mammalian thermal stability for target proteins.
- Preclinical Modeling: Facilitates disease-relevant system evaluation by simulating thermal stress conditions on cytoskeletal dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows dynamic perturbation studies to assess compound effects on motor protein function under varying thermal profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable biophysical readout that complements biochemical and imaging-based assays for target validation and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of motor protein inhibitors or activators through real-time flow speed modulation.
- Screening: Delivers quantitative, temperature-dependent outputs that enable dose-response analysis and hit confirmation in active matter-based assays.
- Analytics: Provides continuous, trackable tracer displacement data enabling statistical comparison of conditions and compound effects.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling thermal sensitivity of cytoskeletal systems relevant to neurodegenerative and cancer targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for active matter characterization across multiple projects, reducing redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, real-time measurement of motor protein-driven dynamics.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise thermal control, minimizing batch-to-batch variability in active fluid preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling rapid, reversible perturbation of target systems without sample remake.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target engagement under physiologically relevant thermal fluctuations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in active matter preparation, microscopy, and thermal control systems.
- Needs a stable temperature stage with water circulation and leak-proof sealing to prevent microscope damage.
- Demands standardization of sample loading and sealing protocols across users for consistent results.
- Requires adaptation considerations for different tracer particles or surface coatings when scaling to other active matter systems.
- Limited by the 16–36°C operational window due to microtubule depolymerization and motor protein denaturation outside this range.
