Sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D na bazie mikrotubul za pomocą temperatury
26 listopada 2019
Celem tego protokołu jest wykorzystanie temperatury do kontrolowania prędkości przepływu trójwymiarowych płynów aktywnych. Zaletą tej metody jest nie tylko regulacja prędkości przepływu in situ, ale także dynamiczna kontrola, taka jak okresowe dostrajanie prędkości przepływu w górę i w dół.
Materia aktywna jest używana w różnych zastosowaniach, takich jak cienie molekularne. Aby przenieść aplikację na wyższy poziom, musimy rozwinąć umiejętność lokalnego kontrolowania materii aktywnej. Zapewniamy łatwą w użyciu metodę, która nie wymaga modyfikacji płynu aktywnego.
Nie ma też potrzeby modyfikowania ścieżki optycznej mikroskopu w celu uzyskania lokalnej kontroli płynu aktywnego. Nasza metoda może być stosowana w szerokim zakresie systemów, w których główne reakcje podlegają błędnemu prawu, takim jak test ślizgowy mikrotubul lub systemy oparte na enzymach. Konfiguracja obejmuje system cyrkulacji wody.
Jeśli dojdzie do nieszczelności, woda może uszkodzić mikroskop. Dlatego przed przyjęciem naszego protokołu ważne jest, aby upewnić się, że system jest wolny od wycieków. Nasz protokół wymaga zamontowania szklanej próbki na stoliku temperaturowym.
Chociaż manuskrypt opisuje procedurę montażu, brakuje w nim mechanicznych subtelności, takich jak mocowanie próbki do stolika. Procedurę zademonstrują Teagan Bate, Edward Jarvis i Megan Varney. Teagan i Edward są studentami studiów magisterskich, a Megan jest studentką studiów licencjackich w laboratorium.
Aby przygotować aktywne płyny w probówce Eppendorfa, wymieszaj 16 punktów siedem mikrolitrów po osiem miligramów na mililitr mikrotubul z sześcioma punktami siedmioma mikrolitrami jednopunktowych ośmiomilimolowych kinezyn i jednym punktem jednym mikrolitrem 500 milimolowych naziemnej telewizji cyfrowej o wysokiej zawartości soli w M2B o wysokiej zawartości soli. Połącz mikrotubule, dodając 11 punktów cztery mikrolitry glikolu polietylenowego o zawartości siedmiu procent wagowych. Następnie aktywuj silniki kinezynowe, dodając dwa przecinki po osiem mikrolitrów 50-milimolowego ATP.
Utrzymuj stężenia ATP, dodając dwa przecinka osiem mikrolitrów podstawowej kinazy pirogronianowej / dehydrogenazy mleczanowej i 13 przecinek trzy mikrolitry 200 milimolowego pirogronianu fosfenolu. Zmniejsz efekt wybielania fotograficznego, dodając 10 mikrolitrów 20-milimolowego Troloxu, jeden punkt jeden mikrolitr trzech przecinków pięciu miligramów na mililitr katalazy, jeden punkt jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr oksydazy glukozowej i jeden punkt jeden mikrolitr 300 miligramów na mililitr glukozy. Śledź ruch płynu, dodając jeden punkt sześć mikrolitrów punktu zerowego zero dwa pięcioprocentowe objętościowo cząstki znacznikowe.
Dodaj M2B o wysokiej zawartości soli, aby uzyskać łączną objętość 100 mikrolitrów. Następnie spłucz szkiełko pokryte poliakrylamidem i szkiełko nakrywkowe wodą DI. Osusz okulary sprężonym powietrzem.
Umieść okulary na czystej, płaskiej powierzchni. Wytnij kanał o szerokości trzech milimetrów w filmie woskowym. Całkowita szerokość jest taka sama jak szkiełko nakrywkowe i wynosi 20 milimetrów.
Włóż wosk między szkiełko podstawowe a szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć kanał komórki przepływowej dla płynu. Przyklej szkło do filmu woskowego, umieszczając kompleks wosku szklanego na płycie grzejnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby stopić wosk. Podczas topienia delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe końcówką pipety, aby równomiernie przykleić warstwę wosku do powierzchni szkła.
Po przyklejeniu schłodzić kompleks szklany do temperatury pokojowej. Przygotowane płyny czynne należy niezwłocznie załadować do kanału przepływowego końcówką pipety pod kątem od otworu kanału i w kontakcie ze szklaną powierzchnią szkiełka. Uszczelnij kanał klejem UV.
Po zbudowaniu zestawu do kontroli temperatury, umieść aktywną próbkę płynu na szafirowej powierzchni tak, aby strona szkiełka stykała się z powierzchnią. Zabezpiecz szkiełko taśmą papierową. Za pomocą taśmy miedzianej przymocuj czujnik ThermoSensor do powierzchni szkiełka przykrywkowego.
Aby zamontować zestaw na stoliku mikroskopu, ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywów, zabezpiecz zestaw za pomocą zacisków igły stolika mikroskopu. Włącz regulator temperatury i pompę do akwarium. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby ustawić temperaturę docelową.
Włącz kontrolę temperatury. I rejestruj dane dotyczące temperatury ThermoSensor. Zobrazuj próbkę ze stałym odstępem czasu na mikroskopii fluorescencyjnej wyposażonej w kostkę filtrującą GFP w celu monitorowania cząstek znacznikowych znakowanych Alexa 488 w mieszaninie aktywnej.
Dostosuj interwał czasu, aby przesunąć smugę między klatkami z dokładnością do dziewięciu pikseli. W przypadku znaczników obrazowych poruszających się z prędkością 10 mikrometrów na sekundę, przy użyciu czterokrotnego obiektywu, zaleca się, aby odstęp czasu wynosił od jednej do pięciu sekund. Zapisz obrazy jako pliki TIF, nazwij pliki na podstawie numeru klatki i przechowuj je w osobnym folderze.
W przypadku tych napędzanych kinezyną płynów aktywnych na bazie mikrotubul temperatura była kontrolowana na poziomie 10, 20, 30 i 40 stopni Celsjusza. Wahania temperatury mieściły się w granicach od jednego do trzech stopni Celsjusza od punktu zerowego przez cztery godziny, co świadczy o stabilności i niezawodności tego systemu kontroli temperatury. Znaczniki były obrazowane co dwie sekundy, co pozwoliło na śledzenie trajektorii znaczników.
Średnie prędkości mierzone od 20 do 36 stopni Celsjusza wydawały się być niemal niezależne od czasu od zera do dwóch godzin. Gdzie przy 10 i 40 stopniach Celsjusza średnie prędkości szybko zanikały, co było spowodowane depolimeryzacją mikrotubul poniżej 16 stopni Celsjusza i nieprawidłowym funkcjonowaniem klastrów kinezyny odpowiednio powyżej 36 stopni Celsjusza. Gdy temperatura systemu zmieniała się między 20 a 30 stopni Celsjusza co 30 minut, średnie prędkości aktywnych płynów nie tylko odpowiednio przyspieszały i zwalniały, ale także reagowały na zmianę temperatury w ciągu 10 sekund.
Aktywne płyny zaczynają działać nieprawidłowo, gdy są schłodzone poniżej 16 lub podgrzane powyżej 36 stopni. Dlatego podczas manipulowania regulatorem temperatury upewnij się, że temperatura wynosi od 16 do 36 stopni. Możliwość lokalnego dostrojenia płynu aktywnego pozwala na kierowanie mocą płynu, np. dostarczanie ładunku z punktu A do punktu B lub opracowanie urządzenia do mikroprzepływowości, które nie wymaga fizycznego zaworu.
Akrylamid używany do powlekania wyrobów szklanych jest neurotoksyną, która może wchłaniać się przez skórę. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, taki jak rękawice, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne, aby zminimalizować ryzyko.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę kontrolowania prędkości przepływu trójwymiarowych płynów aktywnych za pomocą temperatury. Podejście to umożliwia regulację in situ oraz dynamiczne dostrajanie prędkości przepływu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Materia aktywna
- Dynamika płynów
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Materia aktywna znajduje zastosowanie w różnych dziedzinach, w tym w obszarze cieni molekularnych.
- Lokalna kontrola płynów aktywnych jest niezbędna dla rozwoju tych zastosowań.
- Metoda ta nie wymaga wprowadzania modyfikacji do płynu aktywnego.
- Pozwala ona również uniknąć zmian w torze optycznym mikroskopu.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody lokalnego sterowania płynami aktywnymi.
- Zwiększenie użyteczności materii aktywnej w zastosowaniach naukowych.
- Zapewnienie wszechstronnego podejścia, które można zastosować w różnych systemach.
Zastosowane metody
- Wdrożenie systemu cyrkulacji wody.
- Manipulacja temperaturą w celu kontrolowania prędkości przepływu.
- Zastosowanie metody w systemach podlegających błędnemu prawu.
- Wykorzystanie w testach poślizgu mikrotubul oraz w systemach opartych na enzymach.
Główne wyniki
- Skuteczna regulacja prędkości przepływu in situ.
- Dynamiczna kontrola prędkości przepływu osiągnięta poprzez regulację temperatury.
- Metoda możliwa do zastosowania w szerokim zakresie systemów materii aktywnej.
- Brak konieczności wprowadzania modyfikacji w płynie aktywnym lub konfiguracji mikroskopu.
Wnioski
- Protokół oferuje prosty sposób kontrolowania płynów aktywnych.
- Zwiększa on potencjał zastosowań materii aktywnej w badaniach.
- Metoda ta może doprowadzić do postępów w różnych dziedzinach nauki.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zależna od temperatury kontrola aktywnych płynów opartych na mikrotubulach umożliwia regulację szybkości przepływu bez zastosowania zaworów fizycznych, co wspiera dynamiczne projektowanie urządzeń mikrofluidycznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w układach materii aktywnej poprzez wykorzystanie kinetyki Arrheniusa do reprodukowalnej modulacji prędkości. Metoda ta zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera skalowalny rozwój testów w ramach procesów walidacji celów oraz screeningu fenotypowego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji białek motorowych w kontrolowanych warunkach termicznych w celu walidacji oddziaływań kinezyna-mikrotubula jako celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia regulowalny, wolny od odczynników system do oceny zaangażowania celu i modulacji szlaków w czasie rzeczywistym.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez korelację zależnych od temperatury zmian przepływu z aktywnością białek motorowych, co dostarcza informacji niezbędnych do decyzji dotyczących identyfikacji związków wiodących.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty prędkości przepływu zależne od temperatury (4–8 µm/s), odpowiednie do wysokoprzepustowego screeningu bibliotek związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu dzięki precyzyjnej kontroli termicznej, co poprawia powtarzalność wyników między powtórzeniami i laboratoriami.
- Skalowalność: Wspiera integrację mikrofluidyczną w celu równoległego testowania związków bez konieczności stosowania zaworowej regulacji przepływu, co zmniejsza stopień złożoności urządzenia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje istotność fizjologiczną poprzez pracę w zakresie 16–36°C, co jest zgodne ze stabilnością termiczną białek docelowych u ssaków.
- Modelowanie przedkliniczne: Umożliwia ocenę systemów istotnych dla przebiegu chorób poprzez symulację warunków stresu termicznego w odniesieniu do dynamiki cytoszkieletu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Pozwala na prowadzenie badań nad dynamicznymi perturbacjami w celu oceny wpływu związków na funkcję białek motorowych w zmiennych profilach termicznych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając regulowany odczyt biofizyczny, który uzupełnia analizy biochemiczne i obrazowe w procesie walidacji celu oraz optymalizacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących inhibitorów lub aktywatorów białek motorycznych poprzez modulację prędkości przepływu w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników zależnych od temperatury, które umożliwiają analizę zależności dawka-odpowiedź oraz potwierdzenie trafień w testach opartych na materii aktywnej.
- Analityka: Zapewnia ciągłe, możliwe do śledzenia dane o przemieszczeniu znacznika, co umożliwia statystyczne porównanie warunków i efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie wrażliwości termicznej układów cytoszkieletowych istotnych dla celów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych i nowotworach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do charakterystyki materii aktywnej w wielu projektach, co redukuje koszty ponownego opracowywania metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośredni pomiar dynamiki napędzanej przez białka motoryczne w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki precyzyjnej kontroli termicznej, minimalizując zmienność między partiami preparatów płynów aktywnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, umożliwiając szybką i odwracalną perturbację układów docelowych bez konieczności ponownego przygotowania próbek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację zaangażowania celu w warunkach fizjologicznie istotnych fluktuacji termicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie przygotowania materii aktywnej, mikroskopii oraz systemów kontroli termicznej.
- Wymagany jest stabilny stolik temperaturowy z cyrkulacją wody i szczelnym uszczelnieniem, aby zapobiec uszkodzeniu mikroskopu.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów załadunku i uszczelniania próbek dla wszystkich użytkowników w celu uzyskania spójnych wyników.
- Przy skalowaniu do innych systemów materii aktywnej należy uwzględnić dostosowania dla różnych cząstek śledzących lub powłok powierzchniowych.
- Zakres operacyjny jest ograniczony do 16–36°C ze względu na depolimeryzację mikrotubul i denaturację białek motorowych poza tym przedziałem.
