Name: Sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D na bazie mikrotubul za pomocą temperatury (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę sterowania prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D za pomocą temperatury. Protokół umożliwia lokalną regulację mikrotubul bez modyfikacji płynu ani ścieżki optycznej mikroskopu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plazmid K401-BCCP-H6 był prezentem od Dr. Zvonimira Dogicia. Badania te były wspierane przez fundusz start-upowy dr Kun-Ta Wu w Worcester Polytechnic Institute. Dziękujemy dr Zvonimirowi Dogicowi za protokoły oczyszczania i znakowania tubuliny oraz syntezy aktywnych płynów. Jesteśmy wdzięczni dr Marcowi Ridilli za jego wiedzę w zakresie ekspresji i oczyszczania białek. Dziękujemy dr Williamowi Benjaminowi Rogerowi za pomoc w budowie sceny z kontrolowaną temperaturą. Uznajemy Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) do użytku w Zakładzie Materiałów Biologicznych (BMF). Wyrażamy uznanie dla Królewskiego Towarzystwa Chemicznego za adaptację danych z Bate et al. na temat Soft Matter33.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kontrolowanie materii czynnej in situ otwiera drzwi do ukierunkowanej samoorganizacji materii aktywnej 4,5,24,28,54. W tym artykule przedstawiamy protokół wykorzystania temperatury do kontroli in situ płynów aktywnych na bazie kinezyny i MT, w oparciu o charakterystykę Arrheniusa układu 29,30,31.<...

Materia aktywna różni się od konwencjonalnej materii pasywnej ze względu na jej zdolność do przekształcania energii chemicznej w pracę mechaniczną. Materiał, który posiada taką zdolność, może składać się z żywych lub nieożywionych jednostek, takich jak bakterie, owady, koloidy, ziarna i włókna cytoszkieletu1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Te materialne byty wchodzą w interakcje ze swoimi sąsiadami. Na większą skalę organizują się samoorganizując się w wiry przypominające turbulenty (turbulencje aktywne) lub przepływy materiałów11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Zrozumienie samoorganizacji materii aktywnej doprowadziło do różnych zastosowań w molekularnych wahadłowcach, urządzeniach optycznych i obliczeniach równoległych21,22,23. Przeniesienie aplikacji na wyższy poziom wymaga kontroli wykraczającej poza samoorganizację. Na przykład Palacci i in. opracowali koloid otoczony hematytem, który samonapędzał się tylko wtedy, gdy był wystawiony na ręcznie kontrolowane niebieskie światło, co doprowadziło do pojawienia się żywych kryształów24. Morin i in. ustalili kontrolę toczących się koloidów Quinckego za pomocą przestrajalnego zewnętrznego pola elektrycznego, co spowodowało koloidalne flokowanie w kanale podobnym do toru wyścigowego25. Te wcześniejsze prace pokazują rolę sterowania lokalnego w zastosowaniach i rozwijają bazę wiedzy o materii aktywnej.
W tym artykule skupiamy się na sterowalności aktywnych płynów 3D opartych na kinezynie, opartych na mikrotubulach (MT). Płyny składają się z trzech głównych składników: MT, silników molekularnych kinezyny i zupleantów. Zubożenia indukują siłę zubożającą, która wiąże MT, które są później mostkowane przez klastry motoryczne. Silniki te chodzą wzdłuż MT w kierunku końca plusa. Gdy para zmostkowanych MTsów jest antyrównoległa, odpowiadające im silniki poruszają się w przeciwnych kierunkach. Jednak silniki są związane w klaster i nie są w stanie się rozdzielić, więc wspólnie rozsuwają pary MT (ślizganie międzywłókienkowe, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Ta dynamika ślizgu kumuluje się, powodując, że wiązki MTs, rozciągają się, aż osiągną punkt niestateczności wyboczeniowej i pękają (wiązki rozciągliwe, <silna klasa="xfig">Rysunek 1B)26. Zerwane wiązki są wyżarzane przez siłę zubożającą, która następnie ponownie się wydłuża i dynamika się powtarza. Podczas procesu powtarzalnej dynamiki ruchy wiązki mieszają pobliską ciecz, indukując przepływy, które można zobrazować przez domieszkowanie znacznikami w skali mikronowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Sanchez i in. oraz Henkin i wsp. scharakteryzowali średnie prędkości znaczników, stwierdzając, że prędkości te były regulowane przez zmianę stężeń trifosforanu adenozyny (ATP), zubożeńców, klastrów motorycznych i MTs19,27. Jednak taka przestrajalność istniała tylko przed aktywną syntezą płynów. Po syntezie zdolność do przestrajania została utracona, a płyny samoorganizowały się na swój własny sposób. Aby kontrolować aktywną aktywność płynów po syntezie, Ross.et al. opisali metodę wykorzystującą aktywowaną światłem dimeryzację białek motorycznych, co pozwala na włączanie i wyłączanie aktywności płynu za pomocą light28. Podczas gdy kontrola światła jest wygodna pod względem lokalnej aktywacji płynów, metoda ta wymaga przeprojektowania struktur białek motorycznych, a także modyfikacji ścieżek optycznych w mikroskopie. W tym przypadku zapewniamy łatwą w użyciu metodę lokalnego kontrolowania przepływu płynów bez modyfikacji mikroskopu przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej struktury silnika.
Nasza metoda lokalnego dostrajania aktywnego przepływu płynu opiera się na prawie Arrheniusa, ponieważ reakcja kinezyna-MT wzrasta wraz z temperaturą29,30,31,32. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że zależność od temperatury średniej prędkości przepływu płynu aktywnego jest zgodna z równaniem Arrheniusa: v = A exp(-Ea/RT), gdzie A jest czynnikiem przedwykładniczym, R jest stałą gazową, Ea jest energią aktywacji, a T jest temperaturą systemu33. W związku z tym aktywność płynu jest wrażliwa na temperaturę otoczenia, a temperatura systemu musi być stała, aby ustabilizować wydajność silnika, a co za tym idzie, prędkość przepływu płynu34. W tym artykule pokazujemy, jak wykorzystać zależność temperatury silnika do ciągłego dostrajania prędkości przepływu płynów aktywnych poprzez regulację temperatury układu. Demonstrujemy również przygotowanie aktywnej próbki płynu, a następnie zamontowanie próbki na stoliku mikroskopowym, którego temperatura jest kontrolowana za pomocą oprogramowania komputerowego. Zwiększenie temperatury z 16 °C do 36 °C przyspiesza średnią prędkość przepływu z 4 do 8 μm/s. Dodatkowo możliwość przestrajania jest odwracalna: wielokrotne zwiększanie i zmniejszanie temperatury sekwencyjnie przyspiesza i zwalnia przepływ. Zademonstrowana metoda ma zastosowanie do szerokiego zakresu systemów, w których główne reakcje są zgodne z prawem Arrheniusa, takich jak test ślizgowy MT 29,30,31,32.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Trolox</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoksysililo)propylokrylan, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC216550050</td><td></td></tr><tr><td>3,2mm I.D. Tygon Rurka R-3603</td><td>HACH</td><td>2074038</td><td>Rurki wodne</td></tr> o <tr><td>średnicy 31,75 mm niepowlekane, Szafirowe okno</td><td>Edmund Optics</td><td>43-637</td><td>Szafirowy dysk</td></tr><tr><td>3M 1181 Taśma miedziana - 1/2 cala szerokości x 18 jardów Długość - 2,6 MIL Grubość całkowita - 27551</td><td>RS HUGHES</td><td>054007-27551</td><td>Taśma miedziana</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór akrylamidu (40%/elektroforeza), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1402-1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli dipotasowej adenozyno-5'-trifosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20006</td><td>Far-red barwnik fluorescencyjny. Alexa 647 może być wstępnie zawieszona w dimetylosulfotlenku (DMSO) przed zmieszaniem z mikrotubulami (1.3.3.2.)</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801024</td><td>Odśrodkowa rurka filtracyjna. Odgraniczna masa cząsteczkowa: 10 kDa</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu, 100g, MP Biomedicals</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN802829</td><td>Sól</td></tr><tr><td>sodowa ampicyliny APS (krystaliczny proszek), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td>Ampicillin</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Nikon</td><td>63-7590S</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>Środek sprzedający agar Bacto, BD Diagnostics</td><td>VWR</td><td>90000-760</td><td>Biotyna agarowa</td></tr><tr><td></td><td>Alfa Aesar</td><td>A14207</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro plastikowe białe - 2 galony</td><td>Bon</td><td>84-715</td><td>Wiadro na wodę</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Katalaza z wątroby bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 4x Obj</td><td>Nikon</td><td>MRD00045</td><td>4x obiektyw powietrzny</td></tr><tr><td>C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift</td><td>Nikon</td><td>96372</td><td>Kostka filtra GFP</td></tr><tr><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>TE Technology</td><td>CH-109-1.4-1.5</td><td>Chłodnica termoelektryczna (TEC)</td></tr><tr><td>Chloramfenikol, 98%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Blok chłodzący</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Niestandardowo frezowane aluminium</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400</td><td>Bio-Rad</td><td>1610400</td><td>Barwnik trifenylometanowy</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (certyfikowany ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DL-1,4-Ditiothreitol, 99%, do biochemii, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165680050</td><td>DTT</td></tr><tr><td>DOWSIL 340 Pasta</td><td>termiczna</td>do radiatorów <td>Dow</td><td>1446622</td></tr><tr><td>ALKOHOL ETYLOWY, 200 PROOF ACS / USP / NF GRADE 5 GALONÓW POLY CUBE</td><td>Pharmco firmy Greenfield Global</td><td>111000200CB05</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Dodatki do podłoży mikrobiologicznych: Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421</td><td>Tryptone</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Dodatki do mediów mikrobiologicznych: Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td>Ekstrakt</td></tr><tr><td>drożdżowy Fluoresbrite YG Microspheres, klasa kalibracji 3.00 i mikro; m</td><td>Polysciences</td><td>18861</td><td>Cząstki znacznikowe</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Guanozyna-5'[ (&alfa;,&beta;)-metyleno]trifosforan (GMPCPP)</td></tr><tr><td>GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 stóp, 99,9% skręcona miedź beztlenowa OFC, czerwono-2-żyłowy przewód zaciskowy zasilający / głośnikowy do samochodu, audio, kina domowego</td><td>Amazon</td><td>B07428NBCW</td><td>Drut miedziany</td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>HEPES Sól sodowa (biały proszek), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410</td><td>NaHEPES</td></tr><tr><td>Wysokowydajny blender</td><td>AIMORES</td><td>AS-UP1250</td><td>Blender</td></tr><tr><td>Jego GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>11003399</td><td>Kolumna grawitacyjna</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy 99%</td><td>Pharmco firmy Greenfield Global</td><td>231000099</td><td>Rotor Isopropanol</td></tr><tr><td>JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy jednowodny sól potasowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>K-glutaminian</td></tr><tr><td>Lizozym z białka jaja kurzego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>MgCl2&bull; 6H2O</td></tr><tr><td>Sól sodowa MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>Sól sodowa kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>Kwas 3-(N-Morfolino)propanosulfonowy</td></tr><tr><td>MP-3022</td><td>TE Technology</td><td>MP-3022</td><td>Termopara</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina 99%, ACROS Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC138450500</td><td>TEMED</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS Nanodrop 2000c Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E112352</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E Mikroskop odwrócony Nikon</td><td></td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>Norland Klej optyczny 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA81</td><td>Klej UV</td></tr><tr><td>Novex Sharp Wstępnie barwione białko Standard</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC5800</td><td>Standardowa drabina białkowa</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe, 1,5 mm, 10-dołkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td>SDS żel Optima</td></tr><tr><td>L-90K Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm PM996 Wrap, 4" szerokość; 125 ft/rolka</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06720-40</td><td>Folia woskowa</td></tr><tr><td>Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide Control Zasilacz Nikon</td><td></td><td>PE-300-UT-L-SB-40</td><td>Fajny oświetlacz LED Fluorek</td></tr><tr><td>fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Sól monopotasowa kwasu fosfoenolopigronowego, 99%</td> <td>BeanTown Chemical</td><td>129745</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Zestaw do oznaczania białek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Pierce Mini tabletki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32953</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>Kwas 1,4-piperazynodietanosulfonowy</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300</td><td>PEG. Średnia masa cząsteczkowa 20 000 Da</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (granulki/certyfikowany ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>KOH</td></tr><tr><td>PowerEase 300W Zasilacz (115 VAC)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PS0300</td><td>Zasilanie DC pudełka żelowego</td></tr><tr><td>PS-12-8.4A</td><td>TE Technology</td><td>PS-12-8.4A</td><td>Zasilanie DC regulatora temperatury</td></tr><tr><td>Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0294</td><td>PK/LDH</td></tr><tr><td>Cicha pompa fontannowa Lifegard, 296 galonów na godzinę</td><td>Amazon</td><td>B005JWA612</td><td>Pompa do akwarium</td></tr><tr><td>Rosetta 2(DE3)pLysS Kompetentne komórki - Novagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>71403</td><td>Kompetentne komórki</td></tr><tr><td>Sharp Microwave ZSMC0912BS Kuchenka mikrofalowa Sharp 900 W, 0,9 stopy sześciennej, stal nierdzewna</td><td>Amazonka</td><td>B01MT6JZMR</td><td>Kuchenka mikrofalowa do gotowania wody</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (krystaliczny / certyfikowany ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>Białko streptawidyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21122</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>TC-720</td><td>TE Technology</td><td>TC-720</td><td>Regulator temperatury</td></tr><tr><td>Tris Base, klasa biologii molekularnej - CAS 77-86-1 - Calbiochem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648310</td><td>Tris-HCL</td></tr><tr><td>Typ 45 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Typ 70 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>337922</tr><tr><td>Typ 70.1 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna taśma do etykietowania laboratoryjnego VWR</td><td>VWR</td><td>89097-916</td><td>Taśmy papierowe</td></tr><tr><td>Okulary VWR Micro Cover Glass, kwadratowe, nr 1 1/2</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>VWR Plain i Frosted Micro Slides, Premium</td><td>VWR</td><td>75799-268</td><td>Szkiełka szklane</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td>Pudełko żelowe</td></tr><tr><td>ZYLA 5.5 USB3.0 Aparat</td><td>Nikon</td><td>ZYLA5.5-USB3</td><td>Monochromatyczny aparat CCD</td></tr></tbody></table>

sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3d na bazie mikrotubul za pomocą temperatury

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

Prezentujemy metodę wykorzystania temperatury do dostrojenia prędkości przepływu trójwymiarowych (3D) płynów aktywnych napędzanych kinezyną, opartych na mikrotubulach. Metoda ta pozwala na dostrajanie prędkości in situ bez konieczności wytwarzania nowych próbek w celu osiągnięcia różnych pożądanych prędkości. Co więcej, metoda ta umożliwia dynamiczną kontrolę prędkości. Cykliczne zmiany temperatury powodują, że płyny przepływają okresowo szybko i wolno. Sterowalność ta opiera się na charakterystyce Arrheniusa dla reakcji kinezyna-mikrotubula, wykazującej kontrolowany średni zakres prędkości przepływu 4–8 μm/s. Przedstawiona metoda otworzy drzwi do projektowania urządzeń mikroprzepływowych, w których natężenia przepływu w kanale są lokalnie regulowane bez konieczności stosowania zaworu.

Przygotowanie aktywnych płynów opartych na mikrotubulach (MT) i napędzanych przez kinezynę wymaga zarówno kinezyny, jak i MT. Mikrotubule spolimeryzowano z oznakowanych tubulin (kroki 1.3 i 1.4), które oczyszczono z mózgów bydlęcych (krok 1.1, Rysunek 2A), a następnie poddano recyklingowi w celu zwiększenia czystości (krok 1.2, Rysunek 2B). Białka motoryczne kinezyny wyekspresowano i oczyszczono z E. coli (kroki 2.1 i 2...

Celem tego protokołu jest wykorzystanie temperatury do kontrolowania prędkości przepływu trójwymiarowych płynów aktywnych. Zaletą tej metody jest nie tylko regulacja prędkości przepływu in situ, ale także dynamiczna kontrola, taka jak okresowe dostrajanie prędkości przepływu w górę i w dół.

Sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D na bazie mikrotubul za pomocą temperatury

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Materia aktywna jest używana w różnych zastosowaniach, takich jak cienie molekularne. Aby przenieść aplikację na wyższy poziom, musimy rozwinąć umiejętność lokalnego kontrolowania materii aktywnej. Zapewniamy łatwą w użyciu metodę, która nie wymaga modyfikacji płynu aktywnego.Nie ma też potrzeby modyfikowania ścieżki optycznej mikroskopu w celu uzyskania lokalnej kontroli płynu aktywnego. Nasza metoda może być stosowana w szerokim zakresie systemów, w których główne reakcje podlegają błędnemu prawu, takim jak test ślizgowy mikrotubul lub systemy oparte na enzymach. Konfiguracja obejmuje system cyrkulacji wody.Jeśli dojdzie do nieszczelności, woda może uszkodzić mikroskop. Dlatego przed przyjęciem naszego protokołu ważne jest, aby upewnić się, że system jest wolny od wycieków. Nasz protokół wymaga zamontowania szklanej próbki na stoliku temperaturowym.Chociaż manuskrypt opisuje procedurę montażu, brakuje w nim mechanicznych subtelności, takich jak mocowanie próbki do stolika. Procedurę zademonstrują Teagan Bate, Edward Jarvis i Megan Varney. Teagan i Edward są studentami studiów magisterskich, a Megan jest studentką studiów licencjackich w laboratorium.Aby przygotować aktywne płyny w probówce Eppendorfa, wymieszaj 16 punktów siedem mikrolitrów po osiem miligramów na mililitr mikrotubul z sześcioma punktami siedmioma mikrolitrami jednopunktowych ośmiomilimolowych kinezyn i jednym punktem jednym mikrolitrem 500 milimolowych naziemnej telewizji cyfrowej o wysokiej zawartości soli w M2B o wysokiej zawartości soli. Połącz mikrotubule, dodając 11 punktów cztery mikrolitry glikolu polietylenowego o zawartości siedmiu procent wagowych. Następnie aktywuj silniki kinezynowe, dodając dwa przecinki po osiem mikrolitrów 50-milimolowego ATP.Utrzymuj stężenia ATP, dodając dwa przecinka osiem mikrolitrów podstawowej kinazy pirogronianowej / dehydrogenazy mleczanowej i 13 przecinek trzy mikrolitry 200 milimolowego pirogronianu fosfenolu. Zmniejsz efekt wybielania fotograficznego, dodając 10 mikrolitrów 20-milimolowego Troloxu, jeden punkt jeden mikrolitr trzech przecinków pięciu miligramów na mililitr katalazy, jeden punkt jeden mikrolitr 20 miligramów na mililitr oksydazy glukozowej i jeden punkt jeden mikrolitr 300 miligramów na mililitr glukozy. Śledź ruch płynu, dodając jeden punkt sześć mikrolitrów punktu zerowego zero dwa pięcioprocentowe objętościowo cząstki znacznikowe.Dodaj M2B o wysokiej zawartości soli, aby uzyskać łączną objętość 100 mikrolitrów. Następnie spłucz szkiełko pokryte poliakrylamidem i szkiełko nakrywkowe wodą DI. Osusz okulary sprężonym powietrzem.Umieść okulary na czystej, płaskiej powierzchni. Wytnij kanał o szerokości trzech milimetrów w filmie woskowym. Całkowita szerokość jest taka sama jak szkiełko nakrywkowe i wynosi 20 milimetrów.Włóż wosk między szkiełko podstawowe a szkiełko nakrywkowe, aby utworzyć kanał komórki przepływowej dla płynu. Przyklej szkło do filmu woskowego, umieszczając kompleks wosku szklanego na płycie grzejnej o temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby stopić wosk. Podczas topienia delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe końcówką pipety, aby równomiernie przykleić warstwę wosku do powierzchni szkła.Po przyklejeniu schłodzić kompleks szklany do temperatury pokojowej. Przygotowane płyny czynne należy niezwłocznie załadować do kanału przepływowego końcówką pipety pod kątem od otworu kanału i w kontakcie ze szklaną powierzchnią szkiełka. Uszczelnij kanał klejem UV.Po zbudowaniu zestawu do kontroli temperatury, umieść aktywną próbkę płynu na szafirowej powierzchni tak, aby strona szkiełka stykała się z powierzchnią. Zabezpiecz szkiełko taśmą papierową. Za pomocą taśmy miedzianej przymocuj czujnik ThermoSensor do powierzchni szkiełka przykrywkowego.Aby zamontować zestaw na stoliku mikroskopu, ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywów, zabezpiecz zestaw za pomocą zacisków igły stolika mikroskopu. Włącz regulator temperatury i pompę do akwarium. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby ustawić temperaturę docelową.Włącz kontrolę temperatury. I rejestruj dane dotyczące temperatury ThermoSensor. Zobrazuj próbkę ze stałym odstępem czasu na mikroskopii fluorescencyjnej wyposażonej w kostkę filtrującą GFP w celu monitorowania cząstek znacznikowych znakowanych Alexa 488 w mieszaninie aktywnej.Dostosuj interwał czasu, aby przesunąć smugę między klatkami z dokładnością do dziewięciu pikseli. W przypadku znaczników obrazowych poruszających się z prędkością 10 mikrometrów na sekundę, przy użyciu czterokrotnego obiektywu, zaleca się, aby odstęp czasu wynosił od jednej do pięciu sekund. Zapisz obrazy jako pliki TIF, nazwij pliki na podstawie numeru klatki i przechowuj je w osobnym folderze.W przypadku tych napędzanych kinezyną płynów aktywnych na bazie mikrotubul temperatura była kontrolowana na poziomie 10, 20, 30 i 40 stopni Celsjusza. Wahania temperatury mieściły się w granicach od jednego do trzech stopni Celsjusza od punktu zerowego przez cztery godziny, co świadczy o stabilności i niezawodności tego systemu kontroli temperatury. Znaczniki były obrazowane co dwie sekundy, co pozwoliło na śledzenie trajektorii znaczników.Średnie prędkości mierzone od 20 do 36 stopni Celsjusza wydawały się być niemal niezależne od czasu od zera do dwóch godzin. Gdzie przy 10 i 40 stopniach Celsjusza średnie prędkości szybko zanikały, co było spowodowane depolimeryzacją mikrotubul poniżej 16 stopni Celsjusza i nieprawidłowym funkcjonowaniem klastrów kinezyny odpowiednio powyżej 36 stopni Celsjusza. Gdy temperatura systemu zmieniała się między 20 a 30 stopni Celsjusza co 30 minut, średnie prędkości aktywnych płynów nie tylko odpowiednio przyspieszały i zwalniały, ale także reagowały na zmianę temperatury w ciągu 10 sekund.Aktywne płyny zaczynają działać nieprawidłowo, gdy są schłodzone poniżej 16 lub podgrzane powyżej 36 stopni. Dlatego podczas manipulowania regulatorem temperatury upewnij się, że temperatura wynosi od 16 do 36 stopni. Możliwość lokalnego dostrojenia płynu aktywnego pozwala na kierowanie mocą płynu, np. dostarczanie ładunku z punktu A do punktu B lub opracowanie urządzenia do mikroprzepływowości, które nie wymaga fizycznego zaworu.Akrylamid używany do powlekania wyrobów szklanych jest neurotoksyną, która może wchłaniać się przez skórę. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny, taki jak rękawice, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne, aby zminimalizować ryzyko.

controlling-flow-speeds-microtubule-based-3d-active-fluids-using

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii interferencyjnej (IRM) do wizualizacji mikrotubul rosnących na powierzchni szkiełka nakrywkowego w obecności odpowiedniego bufora. Po oświetleniu padającym światłem, interfejs szkiełko nakrywkowe-bufor i interfejs bufor-mikrotubula odbijają światło, które łączy się, tworząc wzór interferencyjny, umożliwiając wizualizację mikrotubul jako obrazów o wysokim kontraście na jasnym tle.

Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Tutaj prezentujemy protokół budowy sterowanej ciśnieniem pompy strzykawkowej do zastosowań mikroprzepływowych. Ta pompa strzykawkowa jest wykonana z korpusu wytwarzanego przyrostowo, gotowego sprzętu i elektroniki typu open source. Powstały w ten sposób system jest tani, prosty w budowie i zapewnia dobrze regulowany przepływ płynów, co umożliwia szybkie badania mikroprzepływowe.

Trójwymiarowy druk materiałów termoplastycznych w celu stworzenia zautomatyzowanych pomp strzykawkowych ze sterowaniem zwrotnym do zastosowań mikroprzepływowych

Ten protokół jest przewodnikiem do implementacji mikroskopii odbicia interferencyjnego na standardowym mikroskopie fluorescencyjnym do bezznacznikowego, kontrastowego, szybkiego obrazowania mikrotubul przy użyciu testów powierzchni in vitro.

Implementacja mikroskopii interferencyjnej odbiciowej do bezznacznikowego, szybkiego obrazowania mikrotubul

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

Obecny protokół opisuje krystalizację mikroskopijnych kryształków lodu i hydratów klatratu w urządzeniach mikroprzepływowych, umożliwiając wymianę cieczy wokół utworzonych kryształów. Daje to niezrównane możliwości badania procesu krystalizacji i mechanizmów wiązania inhibitorów.

Mikroprzepływowe podejście do badania krystalizacji lodu i hydratów klatratu

Przedstawione tutaj są metody przygotowania aktywnych nematyków z mikrotubul i silników kinezynowych, w tym przygotowanie i budowa białek oraz wykorzystanie studni do aktywnego uwięzienia nematycznego.

Formowanie, ograniczanie i obserwacja aktywnych nematyk opartych na mikrotubulach

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

Poznaj metodę sterowania prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D za pomocą temperatury. Protokół umożliwia lokalną regulację mikrotubul bez modyfikacji płynu ani ścieżki optycznej mikroskopu.

Sterowanie prędkościami przepływu aktywnych płynów 3D na bazie mikrotubul za pomocą temperatury

Przeglądaj więcej filmów