Name: Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj trójwymiarowy model hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej i adipocytów do badania metabolizmu tkanki tłuszczowej. Ta metoda pozwala badać interakcje między macierzą a komórkami tłuszczowymi w kontekście cukrzycy typu 2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa i Retha Geiss za pomoc w koordynacji nauki. SEM został przeprowadzony przez University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Projekt ten był wspierany przez granty NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant z Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans Administration VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Skaningowa mikroskopia elektronowa wykonana przez University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Rysunek 4 tego manuskryptu został pierwotnie opublikowany w Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1 marca; 102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, i został przedrukowany za zgodą Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Aby uzyskać zgodę na ponowne wykorzystanie tych materiałów, odwiedź stronę http://global.oup.com/academic/rights.

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li>
<li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li>
<li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology.+960%22%5BJournal%5D)">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li>
<li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR%CE%B3+and+adipocyte+size%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+in+human+adipose+tissue%3A+composition%2C+distribution%2C+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li>
<li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li>
<li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+fibrosis%2C+hypertrophy%2C+and+hyperplasia%3A+correlations+with+diabetes+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li>
<li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li>
<li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li>
<li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Patholology%22%5BJournal%5D)">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li>
<li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li>
<li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).</li>
<li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Macedonian+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li>
<li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia%27s+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165(2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Model hodowli ECM-adipocytów stanowi cenne narzędzie do analizy indywidualnych ról ECM i komórek w dyktowaniu ostatecznego fenotypu tkanki. Protokół izolacji ECM jest dość powtarzalny, ale można zaobserwować zmienność w procesie decelularyzacji. Etap delipidacji w dniu 3 jest krytycznym punktem protokołu. Po zakończeniu ekstrakcji przez noc delipidacja matrycy powinna być udowodniona przez żółknięcie roztworu rozpuszczalnika polarnego, podczas gdy matryca powinna przejść z żółto-pomarańczowego koloru charakterystycznego ...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) nie tylko stanowi mechaniczne rusztowanie dla tkanek, ale także prowadzi skomplikowane rozmowy z komórkami, które w niej przebywają, regulując różnorodne procesy niezbędne do homeostazy tkanek, w tym proliferację komórek, różnicowanie, sygnalizację i metabolizm1. Podczas gdy zdrowy ECM odgrywa istotną rolę w utrzymaniu prawidłowego funkcjonowania tkanek, dysfunkcyjny ECM jest związany z wieloma chorobami2.
Tkanka tłuszczowa odgrywa ważną rolę w patogenezie choroby metabolicznej. Otyłość wiąże się z nadmiernym przerostem adipocytów i niedotlenieniem komórek, defektami metabolizmu komórkowego adipocytów i retikulum endoplazmatycznego tkanki tłuszczowej oraz stresem oksydacyjnym i stanem zapalnym. Chociaż są słabo poznane, te złożone procesy współdziałają w celu osłabienia zdolności buforowania składników odżywczych w tkance tłuszczowej, prowadząc do przelania składników odżywczych z tkanki tłuszczowej, toksyczności w wielu tkankach i ogólnoustrojowej choroby metabolicznej3,4,5. Sekwencja zdarzeń i specyficzne mechanizmy, które leżą u podstaw niewydolności tkanki tłuszczowej, są słabo poznane, ale zmiany w ECM tkanki tłuszczowej są w to zaangażowane. Skład ECM jest zmieniony w tkance tłuszczowej w otyłości ludzkiej i mysjej, ze zwiększonym odkładaniem się białka ECM wraz z jakościowymi różnicami biochemicznymi i strukturalnymi w ECM tkanki tłuszczowej związanymi z chorobami metabolicznymi człowieka, w tym cukrzycą typu 2 i hiperlipidemią6,7,8,9,10,Rozdział 11.
Pomimo tych obserwacji, rola ECM tkanki tłuszczowej w pośredniczeniu w dysfunkcji tkanki tłuszczowej nie jest dobrze zdefiniowana. Wynika to częściowo z braku wykonalnych modeli eksperymentalnych, które pozwalają na analizę specyficznych ról ECM i adipocytów w regulacji ostatecznej funkcji tkanki tłuszczowej. Posiewy ECM-adipocytów lepiej symulują środowisko in vivo natywnej tkanki tłuszczowej pod co najmniej dwoma względami. Po pierwsze, hodowla ECM zapewnia środowisko molekularne podobne do natywnej tkanki tłuszczowej, w tym natywne kolageny, elastyny i inne białka macierzy nieobecne w standardowej hodowli 2D. Po drugie, wykazano, że hodowla na plastiku 2D zmienia metabolizm adipocytów poprzez efekty mechaniczne spowodowane zmniejszoną elastycznością podłoża z tworzywa sztucznego12, które kultura ECM eliminuje.
Metody inżynierii rusztowań biologicznych poprzez izolację ECM z decelularyzowanych tkanek tłuszczowych i innych tkanek były badane w kontekście medycyny regeneracyjnej i rekonstrukcyjnej oraz inżynierii tkankowej13,14,15,16,17,18. Wcześniej opublikowaliśmy metodologię, w której dostosowaliśmy te metody do opracowania modelu 3D in vitro ludzkiej hodowli adipocytów ECM, przy użyciu ECM i komórek macierzystych adipocytów (preadipocytów) pochodzących z ludzkich trzewnych tkanek tłuszczowych11. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy te metody. Procedura decelularyzacji ludzkiej tkanki tłuszczowej to czterodniowy proces, który obejmuje zabiegi mechaniczne i enzymatyczne w celu usunięcia komórek i lipidów, pozostawiając rusztowanie biologiczne, które zachowuje cechy tkanki, z której pochodzi. Bezkomórkowy ECM wspomaga adipogenne różnicowanie ludzkich preadipocytów, a po rozpuszczeniu z adipocytami zachowuje mikroarchitekturę oraz biochemiczne i specyficzne dla choroby cechy nienaruszonej tkanki tłuszczowej oraz angażuje się w funkcje metaboliczne charakterystyczne dla natywnej tkanki tłuszczowej. Macierz ta może być badana samodzielnie lub ponownie zasiewana komórkami, co pozwala na badanie interakcji i przesłuchów między komórkowymi i zewnątrzkomórkowymi składnikami tkanki tłuszczowej.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Kat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka kriowialna</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m nylonowy filtr siatkowy</td><td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3',5-triiodo-L-tyronina sól sodowa (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Nr kat.#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Kat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Kot#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kot#B4639</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deoksy-D-glukoza, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej, typ II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Nr kat.#D4513</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Nr kat.#D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>#BP231</td><td>Łatwopalny,</td></tr><tr><td>disodowy EDTA Fisher</td><td>Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Kot#BP118</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-pantotenowy sól półwapniowa</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kot#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle: Mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., Król Prus, PA, USA</td><td>Cat#DSP-MD.43</td><td>Łatwopalne</td></tr><tr><td>szkiełka do liczenia komórek EVE, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>Kot#10437028</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Kot#G5882</td><td></td></tr><tr><td>heksametyldisalizan</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kot#440191</td><td>Łatwopalny,</td></tr><tr><td>roztwór insuliny ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Cat#A415</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>izoproterenol</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Kat#I5627</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lipaza z trzustki świni, typ VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>Optymalne cięcie Związek temperatury (OCT)</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Wielka Brytania</td><td>Cat# AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Solution (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Stain Kit</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Tetroxide osmu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#201030</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#93482</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowany fosforanem kaustycznym (PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Kat#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej, typ III-A</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy Tkanka włóknista MiniKit</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>Płyn scyntylacyjny</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr><td>Licznik</td><td></td><td></td><td></td>scyntylacyjny</tr><tr><td>Nożyczki, kleszcze, sterylny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy Sorensena</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana T-150</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, Stany Zjednoczone</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td>orbitalna z kontrolowaną temperaturą</tr><tr><td>Homogenizator tkankowy, homogenizator mikroprobówek BeadBug</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Cat#D1030</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T3309</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania trójglicerydów</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa, 0,4%</td> <td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman Reeve Angel, klasa 201, 150mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

ludzki model 3d zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w regulacji homeostazy tkanek, prowadzeniu rozmów z komórkami i regulowaniu wielu aspektów funkcji komórkowych. ECM odgrywa szczególnie ważną rolę w funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej w otyłości, a zmiany w odkładaniu i składzie tkanki tłuszczowej ECM są związane z chorobami metabolicznymi u myszy i ludzi. Wykonalne modele in vitro, które pozwalają na analizę ról ECM i komórek w przyczynianiu się do globalnego fenotypu tkankowego, są nieliczne. Opisujemy nowatorski model 3D in vitro ludzkiej hodowli adipocytów ECM, który pozwala na badanie specyficznych ról ECM i adipocytów w regulacji fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej. Ludzka tkanka tłuszczowa jest decelularyzacja w celu wyizolowania ECM, który jest następnie ponownie zasiedlany preadipocytami, które są następnie różnicowane w ECM w dojrzałe adipocyty. Metoda ta tworzy konstrukty ECM-adipocytów, które są aktywne metabolicznie i zachowują cechy tkanek i pacjentów, z których pochodzą. Wykorzystaliśmy ten system do zademonstrowania specyficznego dla choroby przesłuchu ECM-adipocytów w ludzkiej tkance tłuszczowej. Ten model hodowli dostarcza narzędzia do analizy ról ECM i adipocytów w przyczynianiu się do globalnego fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej i pozwala na badanie roli ECM w regulacji homeostazy tkanki tłuszczowej.

Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) tkanki tłuszczowej, wysiew preadipocytów oraz różnicowanie in vitro w dojrzałe adipocyty prowadzą do wyraźnych sekwencyjnych zmian morfologicznych w tkance, co umożliwia wizualną ocenę postępów w trakcie całego protokołu (Rycina 1). Preadipocyty wykorzystywane do wysiewu na ECM są izolowane poprzez trawienie kolagenazą z oddzielnych próbek VAT (Rycina 2). Skaningowa mikroskopia elek...

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Nasz protokół pokazuje, że ECM może promować różnicowanie adipogenne przy braku klasycznych mediatorów adipogennych i jest pierwszym, który wykazuje specyficzną dla choroby regulację metabolizmu komórkowego przez ECM. Nasza technika dostarcza narzędzia do analizy roli ECM i adipocytów w metabolizmie tkanki tłuszczowej i pozwala na badanie roli ECM w regulacji homeostazy tkanki tłuszczowej. W porównaniu ze standardową hodowlą komórkową 2D, nasz model 3D pozwala na dokładniejsze badanie i analizę wzajemnych oddziaływań między adipocytami a ECM tkanki tłuszczowej w kontekście cukrzycy typu 2.Zalecamy rozpoczęcie od mniejszych próbek, aby ocenić, jak dobrze jest komórkowy. Należy pamiętać, że istnieje zmienność między pacjentami w zakresie tego, jak dobrze komórki rosną i jak dobrze tkanka deceluloaryzuje. Ważne jest, aby obserwować tkankę przed i po każdym etapie, aby upewnić się, że tkanka ulega decelularyzacji i zrozumieć potencjalne różnice między próbkami.Po uzyskaniu trzewnej tkanki tłuszczowej lub VAT z zabiegu należy przygotować ją do przechowywania, dodając 5-10 gramów tkanki do 15-25 mililitrów roztworu buforowego do zamrażania w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Całkowicie zanurz próbkę i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu decelularyzacji. W celu izolacji preadipocytów umieść dwa gramy świeżej próbki nienaruszonego VAT w 20 mililitrach roztworu kolagenazy typu II, a następnie włóż sterylne nożyczki do probówki i dokładnie zmiel tkankę.Po zmieleniu na drobną zawiesinę inkubuj ją w roztworze kolagenazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej przez 60 minut. Po inkubacji przefiltrować powstały strawiony płyn przez nylonową siatkę o grubości 100 mikrometrów do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Strawiony powinien być żółto-pomarańczowym płynem o umiarkowanej lepkości i niewielkiej ilości resztkowych pasm niestrawionej tkanki.Odwirować próbkę o masie 270 razy g przez 10 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w dwóch mililitrach roztworu lizującego 1X RBC za pomocą pipety. Inkubować roztwór przez minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, następnie dodać 10 mililitrów 15% FBS DMEM F12 i odwirować w temperaturze 270 razy g przez 10 minut. Aby przygotować ECM, należy zamrozić/rozmrozić uprzednio zamrożoną próbkę VAT do temperatury 37 stopni Celsjusza, inkubując ją w podgrzanej łaźni wodnej przez 20 minut z okresowym delikatnym mieszaniem ręcznym.Po rozmrożeniu przenieś tkankę z powrotem do minus 80 stopni Celsjusza na 20 minut i powtórz proces zamrażania/rozmrażania trzy razy, kończąc rozmrożeniem. Użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść próbkę VAT do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 15-25 mililitrów roztworu enzymatycznego 1, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona. Następnie inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 130 obr./min.Następnego dnia przemyć próbkę trzykrotnie 15-25 mililitrami roztworu buforowego do płukania, wylewając roztwór po każdym myciu. Przenieś próbkę do świeżej 50-mililitrowej probówki z 15-25 mililitrami roztworu enzymatycznego 2 i inkubuj ją przez noc. Powtórzyć płukanie roztworem buforowym do płukania i przenieść próbkę do świeżej probówki zawierającej 15-25 mililitrów roztworu do ekstrakcji rozpuszczalnikiem polarnym.Próbkę należy inkubować przez noc, wstrząsając. Po inkubacji z polarnym roztworem rozpuszczalnika ważne jest, aby zbadać próbkę pod kątem usunięcia lipidów. Jeśli większość lipidów nie zostanie usunięta, może być konieczne powtórzenie tego kroku.Można zastosować krótszy czas inkubacji. Po inkubacji przenieść próbkę do świeżej probówki zawierającej 15-25 mililitrów roztworu buforowego do płukania i umyć próbkę trzykrotnie na wytrząsarce. Następnie przemyj próbkę trzykrotnie 70% roztworem etanolu, odlewając etanol po każdym myciu.Umyj próbkę raz roztworem do przechowywania, a następnie użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść ją do świeżej probówki zawierającej 15-25 mililitrów roztworu do przechowywania, upewniając się, że jest całkowicie zanurzona. Próbka może być następnie przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Izopropanol i etanol są łatwopalne i muszą mieć temperaturę pokojową i być utylizowane wraz z odpadami łatwopalnymi.Wszelkie odchody ludzkie należy utylizować oddzielnie od zwykłych odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Przenieść przechowywane fragmenty ECM do indywidualnych dołków na 24-dołkowej płytce za pomocą sterylnych kleszczy, dodając tyle fragmentów, ile jest wymagane do planowanych dalszych testów. Umyj je trzykrotnie 500 mikrolitrami 70% etanolu na wytrząsarce orbitalnej, a następnie nawodnij je, myjąc trzykrotnie PBS.Użyj sterylnych nożyczek, aby pociąć ECM na 100-miligramowe fragmenty. Umieść każdy fragment w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić wyciśnięcie nadmiaru PBS z fragmentów. Następnie ostrożnie usuń wszelkie resztki PBS z dołków za pomocą pipety.Wysiewaj każdy fragment 20 mikrolitrami zawiesiny komórek preadipocytów, pipetując komórki bezpośrednio do ECM. Umieść końcówkę pipety w ECM i delikatnie wyrzuć ją do środka matrycy, upewniając się, że zawiesina komórek nie przeleje się i nie znajdzie się na dnie studzienki. Jeśli zawiesina celi wyleje się z ECM, wyjmij końcówkę pipety z tego miejsca i włóż ją w inne miejsce ECM.Po wysianiu komórek inkubować ECM przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Napełnij każdą studzienkę 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej, aby przykryć wysiane fragmenty ECM. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny.Po 72 godzinach ostrożnie zassać pożywkę wzrostową, nie naruszając fragmentu ECM. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki różnicującej i hoduj komórki przez 14 dni, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni. Sprawdź rozróżnienie za pomocą mikroskopii świetlnej.Komórki gromadzą lipidy, zmieniają kolor na brązowo-żółty i stają się bardziej kuliste w miarę różnicowania. Przygotowanie ECM tkanki tłuszczowej, wysiew preadipocytów i różnicowanie in vitro do dojrzałych adipocytów monitorowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, która ujawniła decelularyzację ECM, a następnie rekapitulację adipocytów zawierających lipidy po ponownym wysiewie i różnicowaniu. Immunohistochemia specyficzna dla kolagenu 1 zdecelularyzowanego ECM wykazała utrzymanie mikroarchitektury kolagenu, podczas gdy barwienie Oil Red-O żywych i utrwalonych konstruktów adipocytów 3D ECM wykazało adipocyty zawierające lipidy.Adipocyty zróżnicowane w ECM poddano badaniom przesiewowym pod kątem genów adipogennych za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, który wykazał, że geny te są regulowane w górę w zróżnicowanych komórkach w stosunku do niezróżnicowanych preadipocytów hodowanych w ECM. Pokazana jest pełna różnica w poziomach transkrypcji. Cztery kombinacje ECM i adipocytów od osób z cukrzycą i bez cukrzycy poddano fenotypowaniu metabolicznemu.Upośledzony wychwyt glukozy w funkcji lipolitycznej odkryto w konstruktach z tkanek cukrzycowych. Co ważne, stwierdzono, że ECM bez cukrzycy ratuje stymulowany insuliną wychwyt glukozy i zdolność lipolityczną w adipocytach cukrzycowych. Zanieczyszczenie wyizolowanych preadipocytów, tkanki pozbawionej komórek i ponownie zasianego ECM nie jest rzadkością.Sterylność musi być starannie utrzymywana przez cały czas trwania protokołu.

a-human-3d-extracellular-matrix-adipocyte-culture-model-for-studying

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) ma krytyczne braki w swoich obecnych pierwotnych modelach hodowli, co utrudnia rozwój farmakologiczny i badania metaboliczne. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania układu mikrofizjologicznego tkanki tłuszczowej poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek zrębu. Ta konstrukcja zapewnia stabilną i adaptowalną platformę dla podstawowej kultury WAT.

Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Hodowla agregatów dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC) to nowa metoda hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować adipocyty z ludzkiej tkanki tłuszczowej i jak skonfigurować MAAC.

Izolacja i hodowla dojrzałych adipocytów ludzkich przy użyciu błonowych dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów (MAAC)

Przedstawiono tutaj protokół dostarczania oligonukleotydów, takich jak mało-interferujące RNA (siRNA), mimiki mikro-RNA (miRs) lub anty-mikro-RNA (anty-miR) do dojrzałych adipocytów w celu modulacji ekspresji białek i mikro-RNA.

Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Poznaj trójwymiarowy model hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej i adipocytów do badania metabolizmu tkanki tłuszczowej. Ta metoda pozwala badać interakcje między macierzą a komórkami tłuszczowymi w kontekście cukrzycy typu 2.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką (Wideo) | JoVE Journal

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Przeglądaj więcej filmów