Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Nasz protokół pokazuje, że ECM może promować różnicowanie adipogenne przy braku klasycznych mediatorów adipogennych i jest pierwszym, który wykazuje specyficzną dla choroby regulację metabolizmu komórkowego przez ECM. Nasza technika dostarcza narzędzia do analizy roli ECM i adipocytów w metabolizmie tkanki tłuszczowej i pozwala na badanie roli ECM w regulacji homeostazy tkanki tłuszczowej. W porównaniu ze standardową hodowlą komórkową 2D, nasz model 3D pozwala na dokładniejsze badanie i analizę wzajemnych oddziaływań między adipocytami a ECM tkanki tłuszczowej w kontekście cukrzycy typu 2.

Zalecamy rozpoczęcie od mniejszych próbek, aby ocenić, jak dobrze jest komórkowy. Należy pamiętać, że istnieje zmienność między pacjentami w zakresie tego, jak dobrze komórki rosną i jak dobrze tkanka deceluloaryzuje. Ważne jest, aby obserwować tkankę przed i po każdym etapie, aby upewnić się, że tkanka ulega decelularyzacji i zrozumieć potencjalne różnice między próbkami.

Po uzyskaniu trzewnej tkanki tłuszczowej lub VAT z zabiegu należy przygotować ją do przechowywania, dodając 5-10 gramów tkanki do 15-25 mililitrów roztworu buforowego do zamrażania w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Całkowicie zanurz próbkę i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu decelularyzacji. W celu izolacji preadipocytów umieść dwa gramy świeżej próbki nienaruszonego VAT w 20 mililitrach roztworu kolagenazy typu II, a następnie włóż sterylne nożyczki do probówki i dokładnie zmiel tkankę.

Po zmieleniu na drobną zawiesinę inkubuj ją w roztworze kolagenazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej przez 60 minut. Po inkubacji przefiltrować powstały strawiony płyn przez nylonową siatkę o grubości 100 mikrometrów do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Strawiony powinien być żółto-pomarańczowym płynem o umiarkowanej lepkości i niewielkiej ilości resztkowych pasm niestrawionej tkanki.

Odwirować próbkę o masie 270 razy g przez 10 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w dwóch mililitrach roztworu lizującego 1X RBC za pomocą pipety. Inkubować roztwór przez minutę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, następnie dodać 10 mililitrów 15% FBS DMEM F12 i odwirować w temperaturze 270 razy g przez 10 minut. Aby przygotować ECM, należy zamrozić/rozmrozić uprzednio zamrożoną próbkę VAT do temperatury 37 stopni Celsjusza, inkubując ją w podgrzanej łaźni wodnej przez 20 minut z okresowym delikatnym mieszaniem ręcznym.

Po rozmrożeniu przenieś tkankę z powrotem do minus 80 stopni Celsjusza na 20 minut i powtórz proces zamrażania/rozmrażania trzy razy, kończąc rozmrożeniem. Użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść próbkę VAT do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 15-25 mililitrów roztworu enzymatycznego 1, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona. Następnie inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 130 obr./min.

Następnego dnia przemyć próbkę trzykrotnie 15-25 mililitrami roztworu buforowego do płukania, wylewając roztwór po każdym myciu. Przenieś próbkę do świeżej 50-mililitrowej probówki z 15-25 mililitrami roztworu enzymatycznego 2 i inkubuj ją przez noc. Powtórzyć płukanie roztworem buforowym do płukania i przenieść próbkę do świeżej probówki zawierającej 15-25 mililitrów roztworu do ekstrakcji rozpuszczalnikiem polarnym.

Próbkę należy inkubować przez noc, wstrząsając. Po inkubacji z polarnym roztworem rozpuszczalnika ważne jest, aby zbadać próbkę pod kątem usunięcia lipidów. Jeśli większość lipidów nie zostanie usunięta, może być konieczne powtórzenie tego kroku.

Można zastosować krótszy czas inkubacji. Po inkubacji przenieść próbkę do świeżej probówki zawierającej 15-25 mililitrów roztworu buforowego do płukania i umyć próbkę trzykrotnie na wytrząsarce. Następnie przemyj próbkę trzykrotnie 70% roztworem etanolu, odlewając etanol po każdym myciu.

Umyj próbkę raz roztworem do przechowywania, a następnie użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść ją do świeżej probówki zawierającej 15-25 mililitrów roztworu do przechowywania, upewniając się, że jest całkowicie zanurzona. Próbka może być następnie przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Izopropanol i etanol są łatwopalne i muszą mieć temperaturę pokojową i być utylizowane wraz z odpadami łatwopalnymi.

Wszelkie odchody ludzkie należy utylizować oddzielnie od zwykłych odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Przenieść przechowywane fragmenty ECM do indywidualnych dołków na 24-dołkowej płytce za pomocą sterylnych kleszczy, dodając tyle fragmentów, ile jest wymagane do planowanych dalszych testów. Umyj je trzykrotnie 500 mikrolitrami 70% etanolu na wytrząsarce orbitalnej, a następnie nawodnij je, myjąc trzykrotnie PBS.

Użyj sterylnych nożyczek, aby pociąć ECM na 100-miligramowe fragmenty. Umieść każdy fragment w jednym dołku na 24-dołkowej płytce i inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby umożliwić wyciśnięcie nadmiaru PBS z fragmentów. Następnie ostrożnie usuń wszelkie resztki PBS z dołków za pomocą pipety.

Wysiewaj każdy fragment 20 mikrolitrami zawiesiny komórek preadipocytów, pipetując komórki bezpośrednio do ECM. Umieść końcówkę pipety w ECM i delikatnie wyrzuć ją do środka matrycy, upewniając się, że zawiesina komórek nie przeleje się i nie znajdzie się na dnie studzienki. Jeśli zawiesina celi wyleje się z ECM, wyjmij końcówkę pipety z tego miejsca i włóż ją w inne miejsce ECM.

Po wysianiu komórek inkubować ECM przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Napełnij każdą studzienkę 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej, aby przykryć wysiane fragmenty ECM. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny.

Po 72 godzinach ostrożnie zassać pożywkę wzrostową, nie naruszając fragmentu ECM. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki różnicującej i hoduj komórki przez 14 dni, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni. Sprawdź rozróżnienie za pomocą mikroskopii świetlnej.

Komórki gromadzą lipidy, zmieniają kolor na brązowo-żółty i stają się bardziej kuliste w miarę różnicowania. Przygotowanie ECM tkanki tłuszczowej, wysiew preadipocytów i różnicowanie in vitro do dojrzałych adipocytów monitorowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, która ujawniła decelularyzację ECM, a następnie rekapitulację adipocytów zawierających lipidy po ponownym wysiewie i różnicowaniu. Immunohistochemia specyficzna dla kolagenu 1 zdecelularyzowanego ECM wykazała utrzymanie mikroarchitektury kolagenu, podczas gdy barwienie Oil Red-O żywych i utrwalonych konstruktów adipocytów 3D ECM wykazało adipocyty zawierające lipidy.

Adipocyty zróżnicowane w ECM poddano badaniom przesiewowym pod kątem genów adipogennych za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, który wykazał, że geny te są regulowane w górę w zróżnicowanych komórkach w stosunku do niezróżnicowanych preadipocytów hodowanych w ECM. Pokazana jest pełna różnica w poziomach transkrypcji. Cztery kombinacje ECM i adipocytów od osób z cukrzycą i bez cukrzycy poddano fenotypowaniu metabolicznemu.

Upośledzony wychwyt glukozy w funkcji lipolitycznej odkryto w konstruktach z tkanek cukrzycowych. Co ważne, stwierdzono, że ECM bez cukrzycy ratuje stymulowany insuliną wychwyt glukozy i zdolność lipolityczną w adipocytach cukrzycowych. Zanieczyszczenie wyizolowanych preadipocytów, tkanki pozbawionej komórek i ponownie zasianego ECM nie jest rzadkością.

Sterylność musi być starannie utrzymywana przez cały czas trwania protokołu.