Name: Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj trójwymiarowy model hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej i adipocytów do badania metabolizmu tkanki tłuszczowej. Ta metoda pozwala badać interakcje między macierzą a komórkami tłuszczowymi w kontekście cukrzycy typu 2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa i Retha Geiss za pomoc w koordynacji nauki. SEM został przeprowadzony przez University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Projekt ten był wspierany przez granty NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant z Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans Administration VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Skaningowa mikroskopia elektronowa wykonana przez University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Rysunek 4 tego manuskryptu został pierwotnie opublikowany w Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1 marca; 102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, i został przedrukowany za zgodą Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Aby uzyskać zgodę na ponowne wykorzystanie tych materiałów, odwiedź stronę http://global.oup.com/academic/rights.

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li>
<li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li>
<li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li>
<li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology.+960%22%5BJournal%5D)">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li>
<li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR%CE%B3+and+adipocyte+size%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+in+human+adipose+tissue%3A+composition%2C+distribution%2C+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li>
<li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li>
<li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+fibrosis%2C+hypertrophy%2C+and+hyperplasia%3A+correlations+with+diabetes+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li>
<li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology%2C+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li>
<li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li>
<li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Patholology%22%5BJournal%5D)">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li>
<li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li>
<li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).</li>
<li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Macedonian+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li>
<li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia%27s+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165(2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li>
<li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Model hodowli ECM-adipocytów stanowi cenne narzędzie do analizy indywidualnych ról ECM i komórek w dyktowaniu ostatecznego fenotypu tkanki. Protokół izolacji ECM jest dość powtarzalny, ale można zaobserwować zmienność w procesie decelularyzacji. Etap delipidacji w dniu 3 jest krytycznym punktem protokołu. Po zakończeniu ekstrakcji przez noc delipidacja matrycy powinna być udowodniona przez żółknięcie roztworu rozpuszczalnika polarnego, podczas gdy matryca powinna przejść z żółto-pomarańczowego koloru charakterystycznego ...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) nie tylko stanowi mechaniczne rusztowanie dla tkanek, ale także prowadzi skomplikowane rozmowy z komórkami, które w niej przebywają, regulując różnorodne procesy niezbędne do homeostazy tkanek, w tym proliferację komórek, różnicowanie, sygnalizację i metabolizm1. Podczas gdy zdrowy ECM odgrywa istotną rolę w utrzymaniu prawidłowego funkcjonowania tkanek, dysfunkcyjny ECM jest związany z wieloma chorobami2.
Tkanka tłuszczowa odgrywa ważną rolę w patogenezie choroby metabolicznej. Otyłość wiąże się z nadmiernym przerostem adipocytów i niedotlenieniem komórek, defektami metabolizmu komórkowego adipocytów i retikulum endoplazmatycznego tkanki tłuszczowej oraz stresem oksydacyjnym i stanem zapalnym. Chociaż są słabo poznane, te złożone procesy współdziałają w celu osłabienia zdolności buforowania składników odżywczych w tkance tłuszczowej, prowadząc do przelania składników odżywczych z tkanki tłuszczowej, toksyczności w wielu tkankach i ogólnoustrojowej choroby metabolicznej3,4,5. Sekwencja zdarzeń i specyficzne mechanizmy, które leżą u podstaw niewydolności tkanki tłuszczowej, są słabo poznane, ale zmiany w ECM tkanki tłuszczowej są w to zaangażowane. Skład ECM jest zmieniony w tkance tłuszczowej w otyłości ludzkiej i mysjej, ze zwiększonym odkładaniem się białka ECM wraz z jakościowymi różnicami biochemicznymi i strukturalnymi w ECM tkanki tłuszczowej związanymi z chorobami metabolicznymi człowieka, w tym cukrzycą typu 2 i hiperlipidemią6,7,8,9,10,Rozdział 11.
Pomimo tych obserwacji, rola ECM tkanki tłuszczowej w pośredniczeniu w dysfunkcji tkanki tłuszczowej nie jest dobrze zdefiniowana. Wynika to częściowo z braku wykonalnych modeli eksperymentalnych, które pozwalają na analizę specyficznych ról ECM i adipocytów w regulacji ostatecznej funkcji tkanki tłuszczowej. Posiewy ECM-adipocytów lepiej symulują środowisko in vivo natywnej tkanki tłuszczowej pod co najmniej dwoma względami. Po pierwsze, hodowla ECM zapewnia środowisko molekularne podobne do natywnej tkanki tłuszczowej, w tym natywne kolageny, elastyny i inne białka macierzy nieobecne w standardowej hodowli 2D. Po drugie, wykazano, że hodowla na plastiku 2D zmienia metabolizm adipocytów poprzez efekty mechaniczne spowodowane zmniejszoną elastycznością podłoża z tworzywa sztucznego12, które kultura ECM eliminuje.
Metody inżynierii rusztowań biologicznych poprzez izolację ECM z decelularyzowanych tkanek tłuszczowych i innych tkanek były badane w kontekście medycyny regeneracyjnej i rekonstrukcyjnej oraz inżynierii tkankowej13,14,15,16,17,18. Wcześniej opublikowaliśmy metodologię, w której dostosowaliśmy te metody do opracowania modelu 3D in vitro ludzkiej hodowli adipocytów ECM, przy użyciu ECM i komórek macierzystych adipocytów (preadipocytów) pochodzących z ludzkich trzewnych tkanek tłuszczowych11. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy te metody. Procedura decelularyzacji ludzkiej tkanki tłuszczowej to czterodniowy proces, który obejmuje zabiegi mechaniczne i enzymatyczne w celu usunięcia komórek i lipidów, pozostawiając rusztowanie biologiczne, które zachowuje cechy tkanki, z której pochodzi. Bezkomórkowy ECM wspomaga adipogenne różnicowanie ludzkich preadipocytów, a po rozpuszczeniu z adipocytami zachowuje mikroarchitekturę oraz biochemiczne i specyficzne dla choroby cechy nienaruszonej tkanki tłuszczowej oraz angażuje się w funkcje metaboliczne charakterystyczne dla natywnej tkanki tłuszczowej. Macierz ta może być badana samodzielnie lub ponownie zasiewana komórkami, co pozwala na badanie interakcji i przesłuchów między komórkowymi i zewnątrzkomórkowymi składnikami tkanki tłuszczowej.

<table><tbody><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Kat#25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka kriowialna</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#89370-094</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m nylonowy filtr siatkowy</td><td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td><td>Cat#352360</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#D8375</td><td></td></tr><tr><td>2 nM 3,3',5-triiodo-L-tyronina sól sodowa (T3)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T6397</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Nr kat.#10861-700</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kat#I5879</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Kat#10861-666</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (ABAM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Kot#15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kot#B4639</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#A8806</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>Cat#79216</td><td></td></tr><tr><td>Ciglitizone</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#C3974</td><td></td></tr><tr><td>Deoksy-D-glukoza, 2-[1,2-3H (N)]-</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#NET328A250UC</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej, typ II-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Nr kat.#D4513</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Nr kat.#D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>#BP231</td><td>Łatwopalny,</td></tr><tr><td>disodowy EDTA Fisher</td><td>Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Kot#BP118</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-pantotenowy sól półwapniowa</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kot#21210</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle: Mieszanina składników odżywczych F-12 (DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#11320033</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc., Król Prus, PA, USA</td><td>Cat#DSP-MD.43</td><td>Łatwopalne</td></tr><tr><td>szkiełka do liczenia komórek EVE, NanoEnTek</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>Kot#10437028</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Kot#G5882</td><td></td></tr><tr><td>heksametyldisalizan</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kot#440191</td><td>Łatwopalny,</td></tr><tr><td>roztwór insuliny ludzkiej</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Kat#I9278</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Cat#A415</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>izoproterenol</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Kat#I5627</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S25484</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lipaza z trzustki świni, typ VI-S</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#L0382</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H2O</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Cat#S233</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Cat#A661</td><td></td></tr><tr><td>Optymalne cięcie Związek temperatury (OCT)</td><td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, Wielka Brytania</td><td>Cat# AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Solution (ORO)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#O1391</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red-O Stain Kit</td><td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td><td>Cat#KTORO-G</td><td></td></tr><tr><td>Tetroxide osmu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#201030</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#93482</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowany fosforanem kaustycznym (PBS)</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA Stany Zjednoczone</td><td>Kat#SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza A z trzustki bydlęcej, typ III-A</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#R5125</td><td></td></tr><tr><td>RNAEasy Tkanka włóknista MiniKit</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>Cat#74704</td><td></td></tr><tr><td>Płyn scyntylacyjny</td><td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#SX18</td><td></td></tr><tr><td>Licznik</td><td></td><td></td><td></td>scyntylacyjny</tr><tr><td>Nożyczki, kleszcze, sterylny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bufor fosforanowy Sorensena</td><td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td><td>CAS #: 10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana T-150</td><td>VWR International LLC., Radnor, PA, Stany Zjednoczone</td><td>Cat#10062-864</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td><td>Cat#4369016</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td>orbitalna z kontrolowaną temperaturą</tr><tr><td>Homogenizator tkankowy, homogenizator mikroprobówek BeadBug</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Cat#D1030</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td><td>Cat#T3309</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania trójglicerydów</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#TR0100</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa, 0,4%</td> <td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td><td>Cat#10027-446</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td>Cat#17101015</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman Reeve Angel, klasa 201, 150mm</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td><td>Cat#WHA5201150</td><td></td></tr></tbody></table>

ludzki model 3d zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa kluczową rolę w regulacji homeostazy tkanek, prowadzeniu rozmów z komórkami i regulowaniu wielu aspektów funkcji komórkowych. ECM odgrywa szczególnie ważną rolę w funkcjonowaniu tkanki tłuszczowej w otyłości, a zmiany w odkładaniu i składzie tkanki tłuszczowej ECM są związane z chorobami metabolicznymi u myszy i ludzi. Wykonalne modele in vitro, które pozwalają na analizę ról ECM i komórek w przyczynianiu się do globalnego fenotypu tkankowego, są nieliczne. Opisujemy nowatorski model 3D in vitro ludzkiej hodowli adipocytów ECM, który pozwala na badanie specyficznych ról ECM i adipocytów w regulacji fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej. Ludzka tkanka tłuszczowa jest decelularyzacja w celu wyizolowania ECM, który jest następnie ponownie zasiedlany preadipocytami, które są następnie różnicowane w ECM w dojrzałe adipocyty. Metoda ta tworzy konstrukty ECM-adipocytów, które są aktywne metabolicznie i zachowują cechy tkanek i pacjentów, z których pochodzą. Wykorzystaliśmy ten system do zademonstrowania specyficznego dla choroby przesłuchu ECM-adipocytów w ludzkiej tkance tłuszczowej. Ten model hodowli dostarcza narzędzia do analizy ról ECM i adipocytów w przyczynianiu się do globalnego fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej i pozwala na badanie roli ECM w regulacji homeostazy tkanki tłuszczowej.

Przygotowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) tkanki tłuszczowej, wysiew preadipocytów oraz różnicowanie in vitro w dojrzałe adipocyty prowadzą do wyraźnych sekwencyjnych zmian morfologicznych w tkance, co umożliwia wizualną ocenę postępów w trakcie całego protokołu (Rycina 1). Preadipocyty wykorzystywane do wysiewu na ECM są izolowane poprzez trawienie kolagenazą z oddzielnych próbek VAT (Rycina 2). Skaningowa mikroskopia elek...

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Nasz protokół pokazuje, że ECM może promować różnicowanie adipogenne przy braku klasycznych mediatorów adipogennych i jest pierwszym, który wykazuje specyficzną dla choroby regulację metabolizmu komórkowego przez ECM. Nasza technika dostarcza narzędzia do analizy roli ECM i adipocytów w metabolizmie tkanki tłuszczowej i pozwala na badanie roli ECM w regulacji homeostazy tkanki tłuszczowej. W porównaniu ze standardową hodowlą komórkową 2D, nasz model 3D pozwala na dokładniejsze badanie i analizę wzajemnych oddziaływań między adipocytami a ECM tkanki tłuszczowej w kontekście cukrzycy typu 2.Zalecamy rozpoczęcie od mniejszych próbek, aby ocenić, jak dobrze jest komórkowy. Należy pamiętać, że istnieje zmienność między pacjentami w zakresie tego, jak dobrze komórki rosną i jak dobrze tkanka deceluloaryzuje. Ważne jest, aby obserwować tkankę przed i po każdym etapie, aby upewnić się, że tkanka ulega decelularyzacji i zrozumieć potencjalne różnice między próbkami.Po uzyskaniu trzewnej tkanki tłuszczowej lub VAT z zabiegu należy przygotować ją do przechowywania, dodając 5-10 gramów tkanki do 15-25 mililitrów roztworu buforowego do zamrażania w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Całkowicie

a-human-3d-extracellular-matrix-adipocyte-culture-model-for-studying

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Biała tkanka tłuszczowa (WAT) ma krytyczne braki w swoich obecnych pierwotnych modelach hodowli, co utrudnia rozwój farmakologiczny i badania metaboliczne. W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania układu mikrofizjologicznego tkanki tłuszczowej poprzez umieszczanie WAT między arkuszami komórek zrębu. Ta konstrukcja zapewnia stabilną i adaptowalną platformę dla podstawowej kultury WAT.

Platforma mikrofizjologiczna dla ludzkiego tłuszczu: warstwowa biała tkanka tłuszczowa

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Hodowla agregatów dojrzałych adipocytów błonowych (MAAC) to nowa metoda hodowli dojrzałych ludzkich adipocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wyizolować adipocyty z ludzkiej tkanki tłuszczowej i jak skonfigurować MAAC.

Izolacja i hodowla dojrzałych adipocytów ludzkich przy użyciu błonowych dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów (MAAC)

Przedstawiono tutaj protokół dostarczania oligonukleotydów, takich jak mało-interferujące RNA (siRNA), mimiki mikro-RNA (miRs) lub anty-mikro-RNA (anty-miR) do dojrzałych adipocytów w celu modulacji ekspresji białek i mikro-RNA.

Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Poznaj trójwymiarowy model hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej i adipocytów do badania metabolizmu tkanki tłuszczowej. Ta metoda pozwala badać interakcje między macierzą a komórkami tłuszczowymi w kontekście cukrzycy typu 2.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką (Wideo) | JoVE Journal

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Przeglądaj więcej filmów