Analiza złożonych cząsteczek i ich reakcji na powierzchniach za pomocą spektrometrii mas desorpcji/jonizacji indukowanej klastrami
1 marca 2020
Neutralne klastry SO2 o niskiej energii kinetycznej (< 0,8 eV/składnik) są używane do desorpcji złożonych cząsteczek powierzchniowych, takich jak peptydy lub lipidy, do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas przy użyciu spektrometru masowego z pułapką jonową. Nie jest wymagane specjalne przygotowanie próbki i możliwa jest obserwacja reakcji w czasie rzeczywistym.
Jonizacja desorpcyjna indukowana przez obojętne klastry SO2, które nazywamy w skrócie DINeC, jest miękką i wydajną metodą jonizacji desorpcyjnej. Wykorzystujemy go m.in. do spektrometrii mas biomolekuł, takich jak peptydy i białka. Ponieważ DINeC, cząsteczki desorpcyjne nienaruszone z powierzchni próbki, subtelne zmiany chemiczne w tych cząsteczkach są łatwo wykrywalne w widmach masowych.
Proces ten został zilustrowany w poniższej symulacji. Nadchodzące gromady rozpadają się w wyniku uderzenia w powierzchnię klastra. Dipeptyd izotopowy powierzchniowy rozpuszcza się w jednym z fragmentów klastra i ulega desorpcji w tym procesie.
W eksperymencie wiązka klastrów SO2 jest wytwarzana poprzez naddźwiękową ekspansję z dyszy pulsacyjnej. Cząsteczki, które są rozpuszczone i zjonizowane podczas uderzenia w powierzchnię klastra, są przenoszone do pułapki jonowej w celu spektrometrii mas. Typowe widma mas pokazują piki tylko przy ustawionych wartościach MO nienaruszonej cząsteczki.
Procedurę zademonstrują Karolin Bomhardt i Pascal Schneider, dwaj doktoranci w moim laboratorium. W przypadku próbek standardowych podłoża z płytek krzemowych o grubości około 0,5 do jednego milimetra należy pociąć na kawałki po centymetrze kwadratowym. Podłoża silikonowe należy oczyścić w kąpieli ultradźwiękowej z etanolu i acetonu przez 15 minut każde.
Wysuszyć podłoża w strumieniu suchego azotu gazowego. Następnie odleć od pięciu do 30 mikrolitrów roztworu próbki na podłoże. W zależności od prężności par rozpuszczalnika, pozostawić próbkę do wyschnięcia w warunkach otoczenia lub w eksykatorze, aż cały rozpuszczalnik zostanie odparowany i utworzy się suchy film.
Rozważ najprostszy schemat przygotowania. Na przykład, aby zbadać tusz do zakreślacza, wystarczy narysować kropkę na powierzchni podłoża. Zamontuj próbki na uchwycie próbki za pomocą taśmy klejącej lub zacisków dokręconych.
Dodatkowo zamontuj próbkę referencyjną, taką jak warstwa angiotensyny II o grubości mikrometra, na uchwycie próbki. Następnie naciśnij Vent load lock, aby odpowietrzyć system blokady obciążenia. Odczekaj pięć minut lub do momentu osiągnięcia ciśnienia atmosferycznego.
Otwórz blokadę obciążenia i zamontuj uchwyt na próbkę. Zamknij blokadę obciążenia i przepompuj komorę blokady ładunku do ciśnienia poniżej dwa razy 10 do minus pięciu milibarów. Otworzyć zawór do komory DINeC i przenieść uchwyt próbki wraz z prętem transferowym do głównego manipulatora.
Przymocuj uchwyt próbki do manipulatora. Cofnąć pręt przesyłowy i zamknąć zawór między blokadą obciążenia a komorą DINeC. Otwórz zawór między butlą gazową a dyszą.
Wyregulować ciśnienie mieszaniny dwutlenku siarki i helu gazowego na obrysie układu mieszania gazów do 15 barów. Ustawić pozycję manipulatora na pozycję próbki referencyjnej. Aby zmierzyć kationowe widma masowe, ustaw odchylenie próbki i siatki odpowiednio na plus 40 woltów i plus siedem woltów.
Aby sterować dyszą impulsową i spektrometrem masowym pułapki jonowej, ustaw zewnętrzny generator funkcyjny na dwa herce. Za pomocą generatora opóźnienia ustaw opóźnienie czasowe między wyraźnym sygnałem pułapki z pułapki jonowej a sygnałem wyzwalającym dla dyszy pulsacyjnej na pięć milisekund. W oprogramowaniu sterującym firmy Bruker, na stronie Tryb w głównym oknie dialogowym, wybierz opcję Enhanced Resolution (Rozszerzona rozdzielczość) dla opcji Scan mode (Tryb skanowania).
Wpisz M over Z 50 do 3000 dla zakresu, wpisz 0,1 milisekundy dla czasu akumulacji, wpisz 10 cykli dla średniej i dla polaryzacji, wybierz dodatni do pomiaru widm mas kationowych i ujemny do pomiaru widm anionowych. Po osiągnięciu ciśnienia poniżej trzech razy 10 do minus sześciu milibarów w komorze DINeC rozpocznij pomiar. Ustawić wartość M powyżej Z na odpowiednią masę, aby podążać za sygnałem chromatogramu zależnym od czasu.
Naciśnij przycisk Operate w oprogramowaniu sterującym. Rozpocznij rejestrowanie pomiarów, naciskając przycisk nagrywania. Mierz widmo testowe z próbki referencyjnej, takiej jak angiotensyna II, przez około 300 sekund.
Zoptymalizuj intensywność sygnału, dostosowując opóźnienie czasowe między sygnałem przezroczystej pułapki a sygnałem wyzwalającym dyszę impulsową. Po zoptymalizowaniu opóźnienia czasowego przesuń manipulator do pozycji mierzonej próbki. Kliknij przycisk Nagraj, aby uzyskać widma masy w interesującym Cię okresie.
Po zakończeniu pomiaru załaduj odpowiedni zestaw danych do programu do analizy danych, jak pokazano tutaj dla pomiaru referencyjnego. Wybierz interesujący nas przedział czasowy na chromatogramie prawym przyciskiem myszy. Średnie widmo jest wyświetlane w osobnym oknie.
Kliknij Eksportuj jako plik ASCII, aby wyeksportować widmo jako plik danych do dalszego przetwarzania w wybranym programie. Widmo masowe DINeC z próbki angiotensyny II zmieniało się z czasem, gdy próbka została podgrzana do około 140 stopni Celsjusza. Gdy temperatura osiągnęła wartość końcową, pik zaatakowanej cząsteczki protynowanej w M powyżej Z równy 1047 spadł i zaobserwowano nowe piki.
Proces ten jest podsumowany na tych trzech wykresach. Dodatkowe piki w zakresie od M do Z wynoszące 932, 1012 i 1029 były dobrze zaobserwowane. Analiza kinetyki reakcji wykazuje, że jednostka o M nad Z równym 1029 jest produktem pośrednim, który został następnie rozłożony na mniejsze fragmenty, gdy intensywność najpierw wzrosła, a następnie spadła.
Najważniejszymi cechami DINeC są miękki charakter procesu desorpcji, wydajność i wysoka czułość powierzchni. Wszystkie te czynniki wiążą się z niskimi wymaganiami dotyczącymi przygotowania próbek. DINeC może być zatem stosowany do wielu różnych próbek, począwszy od organicznych materiałów kory, a skończywszy na złożonych adsorbatach powierzchniowych w obszarze submonowarstwowym.
We wszystkich przypadkach pełne informacje chemiczne można uzyskać w czasie rzeczywistym.
Przegląd
To badanie przedstawia nową metodę jonizacji desorpcyjnej za pomocą neutralnych klastrów SO2, oznaczoną jako DINeC, do analizy spektrometrii masowej biocząsteczk. Technika ta umożliwia obserwację zmian chemicznych w peptydach i białkach w czasie rzeczywistym bez konieczności rozległej przygotowania próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektrometria masowa
- Analiza biocząsteczek
- Chemia powierzchni
Tło
- DINeC jest delikatną metodą jonizacji desorpcyjnej.
- Umożliwia analizę złożonych cząsteczek powierzchniowych.
- Możliwe jest monitorowanie reakcji w czasie rzeczywistym.
- Wymagana jest minimalna przygotowanie próbki.
Cel badania
- Aby wykazać skuteczność DINeC w spektrometrii masowej.
- Aby analizować subtelne zmiany chemiczne w biocząsteczkach.
- Aby przedstawić szczegółowy protokół przygotowania próbki i pomiaru.
Zastosowane metody
- Produkcja klastrów SO2 poprzez ekspansję naddźwiękową.
- Desorpcja cząsteczek poprzez uderzenie w powierzchnię klastra.
- Przenoszenie zjonizowanych cząsteczek do masspektrometru z pułapką jonów.
- Rejestrowanie danych i analiza widm masowych w czasie rzeczywistym.
Główne wyniki
- Widma masowe pokazują nienaruszone szczyty molekularne.
- Nowe szczyty pojawiają się wraz ze wzrostem temperatury podczas analizy.
- Kinetyka reakcji ujawnia powstawanie gatunków pośrednich.
- DINeC wykazuje wysoką wrażliwość i efektywność powierzchni.
Wnioski
- DINeC jest wszechstronną metodą stosowaną do różnych próbek.
- Dostarcza kompleksowych informacji chemicznych w czasie rzeczywistym.
- Niskie wymagania dotyczące przygotowania próbki zwiększają użyteczność metody.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
DINeC enables soft, matrix-free desorption/ionization of complex biomolecules from surfaces, supporting real-time monitoring of chemical modifications without extensive sample preparation. This capability enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, fragmentation-free mass spectra of peptides and proteins at sub-monolayer sensitivity. The method’s compatibility with ion trap MSn allows for detailed structural elucidation, improving predictive confidence in lead identification and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting intact molecular ions and subtle chemical changes in peptides and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking through soft desorption that preserves labile modifications, reducing false negatives in target engagement studies.
- Predictive Value: Provides quantitative surface coverage data down to 0.1% of a monolayer, aiding in portfolio triage based on target abundance and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers matrix-free, quantitative mass spectra that enable reliable detection of surface-bound analytes without ionization suppression.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cluster beam generation and ion trap transfer, minimizing run-to-run variability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse sample types, from organic extracts to engineered surfaces, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time observation of surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition, allowing kinetic analysis of biomolecular stability.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing continuous chemical information from surface adsorbates to bulk molecules under identical analytical conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by identifying degradation intermediates and reaction pathways that may impact drug candidate stability or efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
DINeC integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring surface-sensitive, real-time monitoring of biomolecular interactions or modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting post-translational modifications and ligand-induced conformational changes on surfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible desorption of intact molecules, providing quantitative outputs for hit confirmation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Delivers high-resolution mass spectra and MSn capabilities that allow teams to compare molecular states, modification sites, and fragmentation patterns across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by monitoring time-dependent chemical changes in peptides and proteins under controlled thermal or chemical stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across departments, reducing redundant method development and enabling cross-project data consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving molecular integrity and enabling detection of labile species that may be lost in harsher ionization methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized cluster beam parameters and minimal sample handling, reducing technical variance.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating matrix requirements and enabling direct analysis of native samples, lowering consumable costs and preparation time.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through real-time kinetic data on surface reactions, supporting early identification of liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cluster beam generation, ion trap operation, and surface science principles for optimal setup and data interpretation.
- Needs access to a pulsed nozzle system, sulfur dioxide and helium gas handling infrastructure, and a compatible ion trap mass spectrometer with MSn capabilities.
- Demands cross-team standardization of sample mounting, substrate cleaning, and drying protocols to ensure surface homogeneity and reproducible desorption efficiency.
- Involves adaptation considerations when transitioning from model peptides to complex native samples or heterogeneous surfaces, necessitating surface coverage optimization.
- Includes practical limitations such as the need for ultra-high vacuum conditions and potential cluster fragmentation effects at higher impact energies, which must be controlled to maintain soft desorption.
