Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym
May 28th, 2020
Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.
Hybrydyzacja in situ WISH zapewnia wysoką rozdzielczość i niski wynik tła w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Ponadto płytki U-slide poprawiają ostrość przy tej samej ogniskowej dzięki mniejszemu zużyciu WISH można nakładać na zarodki myszy, zarodki Drosophila i inne tkanki trudne w obróbce. Test tworzenia probówek można zastosować do komórek androgenowych zróżnicowanych komórkami macierzystymi.
WISH ułatwia zrozumienie funkcjonalnego znaczenia korekcji mutacji. Osobą, która zademonstruje procedurę, jest Yong Wang, asystent naukowy z mojego laboratorium. Pracując pod mikroskopem, użyj systemu FemtoJet, aby wstrzyknąć dwa nanogramy Morpholinos i 500 pikogramów MRNA do jednokomórkowych zarodków.
Ćwicz mikroiniekcję Morpholinos wiele razy, aż będziesz w stanie skutecznie wstrzyknąć go do komórek i zachować integralność jaj. Wysiaduj zygoty, aż zostaną zdechorionowane i osiągną stan rozwoju odpowiadający zamierzonemu eksperymentowi. Zgodnie z opisem w tabeli pierwszej manuskryptu.
Następnie za pomocą plastikowej pipety przenieś od 20 do 40 zarodków do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego 4% roztworu PFA w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu, umyciu i odwodnieniu zarodków zgodnie z opisem w rękopisie, należy umieścić zarodki na sicie z nylonową siatką na dole.
Nawodnij zarodki, myjąc je sekwencyjnie w 75%50% i 25% metanolu przez pięć minut każdy. Po umyciu zarodków PBST dodaj 50 mikrolitrów proteinazy K do probówki z zarodkami. Po strawieniu usuń proteinazę K i przemyj zarodki PBST trzy razy przez pięć minut za każdym razem.
Dodaj od 50 do 100 mikrolitrów zmieszanych sond docelowych do każdej probówki z zarodkami. Inkubuj zarodki przez noc w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po umyciu zarodków zgodnie z opisem w manuskrypcie, użyj 4% paraformaldehydu, aby utrwalić zarodki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj zarodki w 2x roztworze SSCT trzy razy przez 15 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór SSCT i zastąp go 50 mikrolitrami Amp 1. Następnie inkubuj zarodki w temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Po 30 minutach umyj zarodki w 2x roztworze SSCT trzy razy przez 15 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór SSCT i dodaj 50 mikrolitrów Amp 2. Po inkubacji przez 15 minut i umyciu zarodka, jak to miało miejsce wcześniej, dodaj 50 mikrolitrów Amp 3 i delikatnie postukaj w probówkę.
Inkubuj zarodki w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Po 30 minutach umyj zarodki zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie dodaj kroplami 50 mikrolitrów Amp 4 i ostrożnie postukaj w rurkę.
Następnie inkubuj zarodki w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 15 minut i umyj je trzykrotnie SSCT. Po przygotowaniu zarodków do obrazowania zgodnie z opisem w manuskrypcie, należy użyć zestawu substratów peroksydazy DAB do barwienia próbki. Dodaj po 50 mikrolitrów odczynników barwiących A, B i C do jednego mililitra wody destylowanej.
I dobrze wymieszaj, aby uzyskać kompletny płyn roboczy DAB. Dodaj płyn do próbki i przykryj na dziesięć minut. Po dokładnym umyciu próbek należy je zobrazować za pomocą mikroskopu optycznego.
Aby rozpocząć hodowlę i kontrolę iPSC HHT, dodaj matrycę błony podstawnej do sześciu płytek do hodowli komórek dołka, aby pokryć dno studzienek. Inkubuj płytki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie usuń zużyty roztwór matrycy membrany podstawnej ze studzienek i dodaj dwa mililitry pożywki mTeSR 1 do każdej studzienki.
Następnie należy poszczepić iPSC zebrane z ostatniego pasażu w przybliżeniu jeden razy dziesięć do sześciu komórek na studzienkę. Po wyhodowaniu iPSC przez około cztery dni należy wymienić pożywkę do hodowli komórkowej na uzupełnioną pożywkę BEL. Hoduj komórki przez trzy dni, aby wygenerować komórki mezodermy.
Aby rozszerzyć komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, zastąp pożywkę uzupełnioną pożywką BEL na cztery dni. A następnie potraktuj komórki tym samym podłożem i hodowlą przez kolejne trzy do czterech dni. Oczyść dojrzałe komórki śródbłonka naczyń krwionośnych za pomocą CD31 Dynabeads zgodnie z instrukcją zestawu.
Następnie zbierz komórki CD31 dodatnie za pomocą buforu elucyjnego. Utrzymuj i rozwijaj oczyszczone komórki śródbłonka w pożywce EC-SFM zawierającej VEGF165, bFGF i FBS. Aby pokryć płytki komórek śródbłonka, zacznij od dodania 10 mikrolitrów macierzy błony podstawnej na studzienkę do płytek angiogenezy.
Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pobrać komórki śródbłonka i ponownie zawiesić je w pożywce wzrostowej śródbłonka 2 poprzez wielokrotne pipetowanie. Dodaj 50 mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej do zestalonej matrycy w każdym dołku, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po trzech do pięciu godzinach inkubacji użyj mikroskopu o wysokiej rozdzielczości, aby ocenić tworzenie się rurki śródbłonka. Zrób obrazy co najmniej dziesięciu obszarów dla każdej grupy. Sprawdź całkowitą długość rury, numer rury i punkty rozgałęzień.
Testy CISH i WISH przeprowadzono w celu określenia ekspresji endoglinu w zarodkach po 24 godzinach od zapłodnienia. Do zbadania wpływu wyciszenia endoglinu wykorzystano hemogenny marker śródbłonka i marker progenitorowy śródbłonka. Czerwone strzałki wskazują obszary, w których ekspresja tych markerów, aplnrna i npr1a, znacznie się zmniejszyła.
Test tworzenia rurki śródbłonkowej przeprowadzono na zmutowanych i kontrolnych komórkach śródbłonka pochodzących z iPSC z mutacji endoglinu. Formowanie się rurki oceniono i sfotografowano po trzech godzinach. Długość rury, liczbę rurek i rozgałęzienia określono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.
Zmutowane komórki śródbłonka tworzyły mniej gałęzi niż komórki kontrolne. A rozgałęzienia w zmutowanych komórkach śródbłonka znacznie wzrosły po stymulacji czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego. Metoda ta może być również stosowana do generowania iPS z krwi obwodowej.
A dzięki tej metodzie wyjaśnia rolę endokrynologicznej w tworzeniu naczyń krwionośnych in vitro i in vivo. Wiedząc, że skorygowanie mutacji może mieć wpływ na angiogenezę, możliwe jest przeszczepienie komórek z powrotem pacjentom w celu potencjalnej terapii komórkami macierzystymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół analizy hybrydyzacji in situ RNA w całym zarodka ryby zebrafish oraz test formowania rurek w komórkach endoteliowalnych pochodzących od komórek macierzystych pluripotencjalnych indukowanych u pacjentów. Badanie koncentruje się na zrozumieniu roli endogliny w formowaniu naczyń.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia naczyniowa
Tło
- Hybrydyzacja in situ w całym zarodka (WISH) zapewnia wysoką rozdzielczość wyników.
- WISH może być zastosowany do różnych zarodków i trudnych tkanek.
- Test formowania rurek jest przydatny do badania różnicowania komórek macierzystych.
- Zrozumienie korekty mutacji jest ułatwione przez WISH.
Cel badania
- Zbadać rolę endogliny w formowaniu naczyń.
- Przedstawić zastosowanie WISH u ryby zebrafish.
- Wykorzystać testy formowania rurek w komórkach pochodzących od pacjentów.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie Morpholinos i mRNA do zarodków jednokomórkowych za pomocą systemu FemtoJet.
- Zastosowanie technik hybrydyzacji in situ w całym zarodka.
- Testy formowania rurek w komórkach endoteliowalnych pochodzących od komórek macierzystych pluripotencjalnych indukowanych.
- Analiza mikroskopowa wyników.
Główne wyniki
- Wysokorozdzielcze obrazowanie lokalizacji RNA u ryby zebrafish.
- Udana formacja rurek w komórkach endoteliowalnych pochodzących od pacjentów.
- Wgląd w funkcjonalne implikacje endogliny w rozwoju naczyń.
- Demonstracja skuteczności WISH w różnych zastosowaniach.
Wnioski
- Badanie podkreśla znaczenie endogliny w formowaniu naczyń.
- WISH jest cennym narzędziem do badania ekspresji genów w biologii rozwojowej.
- Testy formowania rurek mogą dostarczyć wglądu w różnicowanie komórek macierzystych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of vascular targets by combining in vivo gene expression analysis in zebrafish with in vitro functional validation in patient-derived endothelial cells. It supports target confidence assessment for angiogenic pathways relevant to hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT) and related vascular disorders. The integrated approach enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbation to phenotypic outcomes across species and cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by linking endoglin knockdown to reduced endothelial progenitor marker expression in zebrafish embryos.
- Operational Value: Enables spatial gene expression analysis with high resolution and low background using amplified WISH and DAB staining.
- Scientific Value: Validates functional role of endoglin in angiogenesis through quantification of tube length, branch points, and network formation in iPSC-ECs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, disease-relevant endothelial cell models from HHT patient iPSCs for compound or genetic screening.
- Operational Value: Establishes reproducible tube formation assay with quantifiable morphometric outputs (tube number, length, branching) using ImageJ analysis.
- Scientific Value: Supports assay standardization across laboratories via defined endothelial maturation and matrix coating steps.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity by showing conserved endoglin function in zebrafish embryogenesis and human iPSC-derived endothelial cells.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by confirming phenotype rescue via VEGF stimulation in mutant cells.
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into endoglin’s role in vascular development through dual-model validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, supporting hypothesis-driven progression from genetic hit to functional confirmation in vascular models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by analyzing endoglin and downstream markers (aplnrna, npr1a) in embryonic vasculature.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized endothelial cell differentiation and tube formation quantification.
- Analytics: Enables comparative condition analysis via quantitative morphometrics (tube length, branch points) and spatial gene expression mapping.
- Translational Research: Connects zebrafish findings to human disease models via iPSC-ECs with HHT-associated endoglin mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying angiogenic targets across genetic and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating genetic loss-of-function with vascular phenotypes in two complementary systems.
- Operational Value: Promotes standardization through detailed fixation, hybridization, and amplification steps in WISH and defined endothelial assay timing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-layered validation of target involvement in angiogenesis.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of vascular targets based on cross-species phenotypic conservation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection, and whole-mount hybridization techniques.
- Dependent on access to FemtoJet system, proteinase K, amplification reagents, and DAB substrate kits for WISH.
- Necessitates standardized iPSC differentiation and endothelial purification protocols using CD31 selection and VEGF/bFGF supplementation.
- Involves adaptation considerations when transferring WISH protocols between species or tissue types.
- Limited by the sensitivity of colorimetric detection versus fluorescent alternatives in certain embryonic contexts.
