Name: Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj hybrydyzację in situ w całości w zarodkach Danio rerio oraz test tworzenia rurek w komórkach iPSC-EC w celu badania roli endoglinu w rozwoju naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowego Programu Kluczowych Badań i Rozwoju Chińskich Komórek Macierzystych i Badań Translacyjnych [numer grantu 2016YFA0102300 (dla Jun Yanga)]; Chińska Fundacja Nauk o Przyrodzie [grant nr 81870051, 81670054 (dla Jun Yanga)]; Fundusz Innowacyjny CAMS dla Nauk Medycznych (CIFMS) [numer grantu 2016-I2M-4-003 (dla Jun Yanga)]; PUMC Youth Found oraz Fundusze na Badania Podstawowe dla Uniwersytetów Centralnych [grant nr 2017310013 (dla Fang Zhou)].

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych Szkoły Medycznej Uniwersytetu Zhejiang.
1. Hybrydyzacja in situ w całości
<ol>
	<li>Hodowla i rozmnażanie żyłki danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Nakarmić i wyhodować wszystkie dorosłe ryby-danio pręgowane w temperaturze 26–28 °C w recyrkulacyjnym systemie akwakultury z cyklem 14 godzin światła i 10 godzin ciemności każdego dnia. Do poniższych procedur należy użyć linek do danio pręgowanego AB (typu dzikiego).</li>
		<li>Umieść warstwę kamyków na dnie pudełka hodowlanego jako schronienie dla jaj. Grupuj ryby rodzicielskie w stosunku 2:1 (tj. dwie samice i jeden samiec) do każdej skrzynki. Pozwól samicy ryb na tarło przez 1 dzień. Pod koniec tarła należy natychmiast usunąć ryby rodzicielskie, aby uniemożliwić im zjedzenie jaj.</li>
		<li>Wstrzyknąć 2 ng morfolinosu i 500 pg mRNA do zarodków w stadium jednokomórkowym za pomocą systemu iniekcyjnego Femto Jet pod mikroskopem (sekwencja endoglin-MOs: 5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'; sekwencja MOs 5-mispair control: 5'-AAACAGACCACATCCTCTTCATCTC-3').</li>
		<li>Inkubować zygoty w kwaśnej wodzie morskiej w temperaturze 27 °C przez około 48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie i utrwalanie zarodków danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Użyj plastikowej pipety transferowej, aby zebrać 20-40 zarodków danio pręgowanego z wody w układzie krążenia (pH = 5,0) w probówce o pojemności 1,5 ml, gdy zostaną one zdekorionowane i osiągną określony okres rozwoju. Dodać 1 ml świeżo przygotowanego 4% roztworu PFA w temperaturze pokojowej (RT). 
		nuta: Okres, w którym wybrano zarodek, zależy od celu eksperymentu. Tabela 1 przedstawia czas utrwalenia wymagany dla różnych okresów embrionalnych.</li>
		<li>Usunąć roztwór utrwalający, przemyć zarodki roztworem buforowanym fosforanem za pomocą Tween-20 (PBST, rozcieńczyć 1 ml Tween w 1000 ml roztworu PBS) 3x przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwodnić zarodki poprzez inkubację w seriach 25%, 50% i 75% metanolu (rozcieńczonego w PBST) przez 5 minut każda. Przenieś zarodki do 100% metanolu na 5 minut i zastąp świeżym metanolem. Przechowywać zarodki w temperaturze -20 °C przez noc lub dłużej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nawodnienie i trawienie
	<ol>
		<li>Uwodnić zarodki, które zostały zakonserwowane w 100% metanolu, za pomocą sita z nylonową siatką na dole, aby sekwencyjnie umyć zarodki w dołkach 12-dołkowych płytek z serią 75%, 50% i 25% metanolu (rozcieńczonego w PBST) przez 5 minut każda. Płukać zarodki PBST 3x przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 50 μl proteinazy K (10 mg/ml) do probówki z zarodkami i postępować zgodnie z czasem trawienia w tabeli 2 w RT.</li>
		<li>Usunąć proteinazę K i przemyć zarodki PBST 3x przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja sondy i postfiksacja
	<ol>
		<li>Umieść sondy zaprojektowane zgodnie z sekwencjami mRNA każdego genu w systemie hybrydyzatynowym o temperaturze 40 °C, aż osad się rozpuści, co powinno zająć ~ 10 minut. Wymieszaj docelowe sondy np. (XM_007116.7) i dodatkowe dwa ważne geny zaangażowane we wczesne tworzenie progenitora śródbłonka mezodermy (tutaj, aplnr [NM_001075105.1] i nrp1a [NM_001040326.1]) w probówce o pojemności 1,5 ml w stosunku 50:1:1.</li>
		<li>Dodać 50-100 μl mieszanych sond docelowych do każdej probówki z zarodkami, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 40 °C. 
		UWAGA: Wstępnie zmieszane sondy muszą być wstępnie podgrzane do 40 °C i schłodzone do temperatury rzeczywistej przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować 0,2x roztwór cytrynianu sodu z solą fizjologiczną z Tween-20 (SSCT): rozpuścić 175,3 g NaCl i 88 g cytrynianu sodu w 1 l dH2O, aby otrzymać 20 x roztwór SSC. Następnie rozcieńczyć roztwór w stosunku 1:100 w dH2O, aby otrzymać 0,2 x roztwór SSCT. Rozcieńczyć Tween-20 w stosunku 1:1000 w 0,2x roztworze SSCT.</li>
		<li>Przenieś sondy z recyklingu do nowej probówki. Umyj zarodki w 0,2 x roztworze SSCT 3x po 15 minut w RT. Sondy z recyklingu mogą być ponownie użyte 5x-10x.</li>
		<li>Użyj 4% paraformaldehydu (PFA) do utrwalenia zarodków przez 30 minut w RT. Umyj zarodki w 0,2x roztworze SSCT 3x po 15 minut w RT. 
		UWAGA: Praca Grossa-Thebinga i in. sugeruje okres po utrwaleniu wynoszący 10 min14, ale rzeczywista ilość musi być odpowiednio dostosowana. Tutaj przetestowaliśmy 10-minutową fiksację 3x, a czułość umierania DAB jest znacząco wpłynięta. Po zbadaniu należy upewnić się, że 0,5-1,0 h fiksacji jest optymalnym warunkiem (krótszy okres fiksacji nie może wytworzyć wyraźnego sygnału z docelowego RNA, a odpowiednie wydłużenie czasu fiksacji pomaga wzmocnić sygnał i zapewnić mniej szumów tła).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja wzmacniacza sekwencyjnego i sondy etykietowej
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór SSCT i zastąpić go 50 μl Amp 1. Pozostawić zarodki do osadzenia się w amperze 1 w temperaturze 40 °C przez 30 minut. Następnie przemyj zarodki w 0,2x roztworze SSCT 3x przez 15 minut każdy w RT.</li>
		<li>Usunąć roztwór SSCT i dodać 50 μl Amp 2. Pozostawić zarodki do osiadania w temperaturze 40 °C przez 15 minut. Następnie przemyj zarodki w 0,2x roztworze SSCT 3x przez 15 minut każdy w RT.</li>
		<li>Usuń roztwór SSCT, dodaj 50 μl Amp 3 i delikatnie postukaj w rurkę. Następnie inkubować zarodki w temperaturze 40 °C przez 30 minut. Umyj zarodki w 0,2 x roztworze SSCT 3x po 15 minut w RT.</li>
		<li>Usuń roztwór SSCT, dodaj kroplami 50 μl Amp 4 i ostrożnie postukaj w rurkę. Następnie inkubować zarodki w temperaturze 40 °C przez 15 minut. Umyj zarodki w 0,2x SSCT 3x przez 15 minut każdy w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne i mikroskopia
	<ol>
		<li>Usunąć roztwór SSCT i dodać 50 μl DAPI do każdej probówki. Inkubować zarodki przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć zarodki PBST i przygotować je do obrazowania przy użyciu 1% roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) (1 g LMP rozpuszczony w 100 ml dH2O) na szalce Petriego wypełnionej PBST.</li>
		<li>Użyj zestawu substratu peroksydazy DAB, aby zabarwić próbkę. Dodaj odczynniki barwiące A, B i C (po 50 μl każdy) do 1 ml wody destylowanej i dobrze wymieszaj, aby uzyskać kompletny płyn roboczy DAB. Dodaj płyn do próbki i przykryj na 10 minut.</li>
		<li>Po zabarwieniu dokładnie umyj próbkę PBST.</li>
		<li>Do obrazowania próbek należy używać mikroskopu optycznego z funkcją fotograficzną. 
		UWAGA: W przypadku robienia zdjęć później, probówki należy zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test tworzenia probówek
UWAGA: Zmutowane i dzikie EC (kontrolne) zostały odróżnione od iPSC pochodzących od pacjenta z HHT (tutaj, 62-letnia pacjentka z nawracającym krwawieniem z nosa od 22 roku życia, krwawienie z przewodu pokarmowego, malformacje tętniczo-żylne płuc, niosąca mutację gen. błędnego sensu w pozycji c.88T>C eksonu 2) i zdrowego dawcy (bez eng mutacji), które zostały dostarczone przez Peking Union Medical College Hospital za zgodą komisji etycznej ds. badań naukowych uczelni.
<ol>
	<li>Hodowle komórkowe iPSC kontrolne i HHT
	<ol>
		<li>Dodać pewną objętość matrycy błony podstawnej (np. Matrigel) do 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w celu przykrycia dna studzienki i inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Przy pierwszym użyciu matrycy błony podstawnej przechowywanej w temperaturze -20 °C, inkubować na lodzie lub w bezszronowej lodówce o temperaturze 4 °C, aż do rozmrożenia. Następnie rozcieńczyć w stosunku 1:100 w DMEM/F12, a następnie rozprowadzić rozcieńczalnik w probówkach o pojemności 200 μl zawierających 100 μl każda. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C i unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Podczas dodawania rozcieńczonej matrycy błony podstawnej nie należy tworzyć pęcherzyków. Po dodaniu rozcieńczonej matrycy membrany podstawnej, delikatnie potrząśnij ręcznie płytką 6-dołkową, tak aby równomiernie pokryła dno.</li>
		<li>Po pokryciu płyty usuń zużyty roztwór matrycy membrany podstawnej ze studzienek. Następnie dodaj 2 ml pożywki mTeSR1 do każdej studzienki i płytkuj iPSC zebrane z ostatniego przejścia w przybliżeniu 1 x 106 na studzienkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie i ekspansja EC z iPSC
	<ol>
		<li>Po około 4 dniach hodowli iPSC należy wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę BEL uzupełnioną aktywiną A (25 ng/ml), BMP4 (30 ng/ml), VEGF165 (50 ng/ml) i CHIR99021 (1,5 μM). Hoduj komórki przez 3 dni, aby wytworzyć komórki mezodermy.</li>
		<li>Zastąp pożywkę opisaną w kroku 2.2.1 pożywką BEL uzupełnioną VEGF (50 ng/ml) i SB431542 (10 μM) przez 4 dni w celu rozszerzenia naczyniowych EC. Traktuj komórki tym samym podłożem i hodowlą przez kolejne 3-4 dni.</li>
		<li>Użyj CD31-dynabeads do oczyszczenia dojrzałych naczyniowych EC : zapoznaj się z instrukcjami w zestawie CD31-dynabeads, który łączy ludzkie przeciwciało CD31 z kulkami magnetycznymi w celu połączenia cząsteczek CD31 ulegających ekspresji na ECs, a następnie zbierz komórki CD31-dodatnie za pomocą buforu elucyjnego. Utrzymuj i rozprężaj oczyszczone EC w pożywce EC-SFM zawierającej VEGF165 (30 ng/ml), bFGF (30 ng/ml) i FBS (1%).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie komórek śródbłonka na płytkach pokrytych Matrigelem i mikroskopia
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl matrycy błony podstawnej do dołka, aby pokryć płytki angiogenezy (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Pobrać komórki śródbłonka po sprawdzeniu markerów śródbłonka CD31 i kadheryny VE za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i ponownie zawiesić je w pożywce wzrostowej śródbłonka 2 przez wielokrotne pipetowanie. Dodać 50 μl zawiesiny komórek (2 x 105 komórek/ml) na studzienkę na zestaloną matrycę i inkubować komórki przez 3-5 godzin w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Przed eksperymentem z tworzeniem rurki należy sprawdzić markery śródbłonka, aby upewnić się, że funkcjonalny fenotyp komórek śródbłonka jest prawidłowy. 1 x 104 komórki na studzienkę to idealna liczba do tworzenia rurek. Zbyt wiele lub zbyt mało komórek nie sprzyja tworzeniu się rurek. Dodaj komórki z boku naczynia i nie dotykaj matrycy błony podstawnej. Użyj mikroskopu świetlnego w polu o dużym powiększeniu, aby sprawdzić komórki i zrobić zdjęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowe wyniki tworzenia rurek
	<ol>
		<li>Obserwuj wyniki za pomocą mikroskopu o wysokiej rozdzielczości i rób zdjęcia co najmniej 10 obszarów dla każdej grupy, aby uzyskać wiarygodne statystyki danych.</li>
		<li>Zbadaj formację rurki śródbłonka: oszacuj zakres tworzenia się rurki, sprawdzając całkowitą długość rurki, liczbę rurek i punkty rozgałęzień. Oceń i policz liczbę i długość gałęzi za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li>
<li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li>
<li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li>
<li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).</li>
<li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li>
<li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin%2C+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li>
<li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+%28WISH%29+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li>
<li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787(2016).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li>
<li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2%2Fneu+status+in+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+Biology+Research%22%5BJournal%5D)">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li>
<li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55(2014).</li>
<li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXPRESS%3A+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li>
<li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li>
<li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li>
<li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+%26+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li>
<li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genomics+and+Precision+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043(2018).</li>
<li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apelin+attenuates+TGF-%CE%B21-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-%CE%B5+in+human+renal+tubular+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li>
<li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li>
<li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li>
<li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Cardiovascular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W protokole tym zastosowano ulepszoną platformę analizy RNA in situ do testów tworzenia danio pręgowanego i probówek na iPSC-EC pochodzących od pacjenta z HHT. Tradycyjna metoda ISH wymaga dłuższego cyklu eksperymentalnego z dodatkowymi etapami eksperymentalnymi. Protokół zawiera kilka ważnych ulepszeń, zastosowanie niezależnych sond z podwójnym Z i iPSC pochodzących od pacjenta z HHT, które zastosowano odpowiednio w testach WISH i tworzeniu probówek. Te udoskonalenia mają kluczowe znaczenie dla zwiększenia czułości wykr...

U pacjentów z HHT zgłoszono pojedynczą mutację na eng (CD105). Mutacja prowadzi do zwiększonej proliferacji EC i zmniejszonego wydłużenia EC za pośrednictwem przepływu1,2. Wcześniej donoszono również, że niedobór ENG zmniejsza ekspresję markerów śródbłonka (tj. kdrl, cdh5, hey2) u danio pręgowanego3. Endoglin, ulegający ekspresji głównie w komórkach śródbłonka, jest transbłonową glikoproteiną i pełni funkcję koreceptora dla członków rodziny przekształcających β czynnika wzrostu (TGF-β). Kieruje wiązaniem BMP9 na powierzchni komórki w celu regulacji dalszego genu, w tym ekspresji Id1, w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych w kierunku ECs4. Tak więc gen eng odgrywa ważną rolę w unaczynieniu i chorobach naczyniowych u ludzi5,6. Wcześniej zbadaliśmy wpływ knockdownu endoglinu na tworzenie naczyń w zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadziliśmy analizę EC pochodzących z iPSC uzyskanych od pacjenta z HHT z mutacją eng7. Protokół ten pokazuje wpływ niedoboru ENG na ekspresję markerów progenitorowych śródbłonka i tworzenie rurek, co jest wymierną metodą pomiaru angiogenezy in vitro.
Do badania ekspresji przestrzennej i czasowej języka angielskiego, WISH służy do wykrywania ekspresji genów in vivo8. Hybrydyzacja in situ (ISH) to metoda polegająca na wykorzystaniu znakowanych sond z sekwencjami dopełniacza docelowych kwasów nukleinowych (DNA lub mRNA) do wykrywania i wizualizacji docelowych hybryd kwasów nukleinowych w ustalonej próbce. Proces ten wzmacnia sygnały ekspresji genów in vivo i służy do wykrywania ekspresji genów za pomocą mikroskopii. WISH jest szeroko stosowany u różnych modeli zwierząt, szczególnie u danio pręgowanego9. Służy również do pozyskiwania następujących danych: 1) przestrzennych/czasowych wzorców ekspresji genów, które dostarczają informacji o funkcji i klasyfikacji genów; oraz 2) specyficznie wyrażone markery genetyczne, które są stosowane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków lub mutantów10.
Sondy chromogenne łatwo ulegają degradacji za pomocą tradycyjnej hybrydyzacji chromosomów in situ (CISH), co skutkuje wysokim szumem tła i niespecyficznymi sygnałami11,12. Metoda WISH wykorzystuje dwie niezależne sondy podwójne Z, które są przeznaczone do hybrydyzacji w celu uzyskania docelowych sekwencji RNA. Każda sonda zawiera sekwencję 18-25 komplementarną do docelowego RNA i sekwencję ogonową 14 zasad (konceptualizowaną jako Z). Sondy docelowe są używane w parze (podwójne Z). Dwie sekwencje ogonowe razem tworzą 28-zasadowe miejsce hybrydyzacji dla przedwzmacniacza, które zawiera 20 miejsc wiązania dla wzmacniacza. Wzmacniacz z kolei zawiera 20 miejsc wiązania dla sondy znakującej i może teoretycznie uzyskać do 8 000 znaczników dla każdej docelowej sekwencji RNA.
Ta zaawansowana technologia umożliwia jednoczesne wzmacnianie sygnału i tłumienie tła w celu uzyskania wizualizacji pojedynczej cząsteczki przy jednoczesnym zachowaniu morfologii tkanki13. Dalsza modyfikacja metod WISH opiera się na wcześniejszych badaniach14, w tym na dodatkowym utrwalaniu i barwieniu DAB. Pod warunkiem, że jest to ulepszony protokół WISH, który może działać nawet wtedy, gdy docelowe RNA jest częściowo zmniejszone lub zdegradowane. Zaletą jest to, że można go ukończyć w ciągu 24 godzin bez warunków wolnych od RNaz. Sygnały mogą być również jednocześnie wykrywane przez wiele kanałów z wielu celów, a wyniki są spójne i kompatybilne z wynikami z różnych wysokowydajnych platform automatyzacji.
Wyniki z modeli zwierzęcych niekoniecznie odzwierciedlają to samo zjawisko, które występuje u ludzi. ENG zawiera dwie pary konserwatywnych cystein, C30-C207 i C53-C182, które tworzą mostki dwusiarczkowe w regionach sierocych. W celu dalszego zbadania roli eng u pacjentów z HHT, przeprowadzono testy tworzenia probówek z iPSC pochodzącymi od pacjentów z HHT w komórkach bez/z mutacjami eng (Cys30Arg, C30R)15. Po tym, jak Kubota i in. po raz pierwszy opisali eksperyment z formacją probówek16, test został opracowany na kilka sposobów. Został wykorzystany do identyfikacji czynników angiogennych lub antyangiogennych, zdefiniowania szlaków sygnałowych w angiogenezie oraz identyfikacji genów regulujących angiogenezę17.
Przed udostępnieniem iPSC-EC pochodzących od pacjentów, badacze używali głównie hodowlanych EC do badania angiogenozy16. Jednak w przypadku komórek śródbłonka transdukcja egzogennych genów za pomocą wirusa jest wyzwaniem technicznym ze względu na ograniczoną liczbę pasaży, jaką mogą przejść EC. Dzieje się tak, ponieważ nie ma wystarczającej ilości materiału komórkowego do pobrania z ludzkich naczyń, zarówno z operacji, jak i od dopasowanych zatwierdzonych dawców. Dzięki wynalezieniu techniki generowania iPSC przez Shinya Yamanaka, ludzkie EC pochodzące z iPSC mogą być niezawodnie wykorzystywane w eksperymentach in vitro, jak donoszono wcześniej18.
Użycie transdukowanych wirusowo EC o ograniczonej liczbie i przejściach może być wystarczające do badań sygnalizacyjnych, ale do badań funkcjonalnych lepiej jest wygenerować zmutowane linie pluripotencjalnych komórek macierzystych (zarówno iPSC, jak i hESC ukierunkowane na CRISPER/Cas9), a następnie różnicować je w EC do badań angiogenezy, które wykorzystują testy tworzenia probówek19. Tworzenie rurki można wykorzystać do oceny funkcji komórek śródbłonka niosących mutacje. Protokół ten opisuje również tworzenie rurki na μ-szkiełkowej płytce angiogenezy, co jest łatwą, opłacalną i powtarzalną metodą.
Poniższy protokół dostarcza niezawodnej i systemowej metody badania roli określonych genów w tworzeniu naczyń krwionośnych, wraz ze szczegółami dotyczącymi wzorca ekspresji in vivo i funkcjonalnej kwantyfikacji in vitro do modelowania chorób ludzkich.

<table><tbody><tr><td>&mikro;-Slide Angiogeneza</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td>Wzmacniacz do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>1-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320852 <td>Wzmacniacz wzmocnienia sygnału</td></tr><tr><td>2-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320853 <td>Wzmacniacz wzmacniający sygnał</td></tr><tr><td>3-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320854 <td>Wzmacniacz sygnału</td></tr><tr><td>Amp 4 Alt B-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320856 <td>Wzmocnienie sygnału</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Obniżony czynnik wzrostu Matrigel</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Woda bez RNAaz</td></tr><tr><td>Ludzki śródbłonek Thermofisher</td><td>11111044</td><td>Hodowla komórkowa</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4</td><td>Utrwalone zarodki</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4</td><td>Stałe komórki</td></tr><tr><td>Proteaza K</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 322337 <td>Tkanka trawienna</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>6132-04-3</td><td>Roztwór SSCT: Bufor płuczący</td></tr><tr><td>VEGF-165</td><td>STEMCELL Technologie</td><td>78073</td><td>Czynnik wzrostu</td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w ipsc-ec w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Rozwój naczyń krwionośnych jest determinowany przez sekwencyjną ekspresję określonych genów, które mogą być badane poprzez przeprowadzanie testów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego podczas różnych etapów rozwoju. Aby zbadać rolę endoglinu(eng) w tworzeniu naczyń podczas rozwoju dziedzicznej teleangiektazji krwotocznej (HHT), do badania jego czasowej ekspresji i powiązanych funkcji stosuje się ukierunkowane nokautowanie eng za pośrednictwem morfoliny w celu zbadania jego czasowej ekspresji i powiązanych funkcji. W tym przypadku hybrydyzacja RNA in situ (WISH) w całości wykorzystuje się do analizy genów eng i jego dalszych genów w zarodkach danio pręgowanego. Testy tworzenia jajowodów przeprowadza się również w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka zróżnicowanych komórkami macierzystymi HHT (iPSC-EC; z mutacjami eng). Specyficzny system wzmacniania sygnału wykorzystujący całą ilość hybrydyzacji In Situ – WISH zapewnia wyższą rozdzielczość i niższe wyniki tła w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Aby uzyskać lepszy sygnał, czas po utrwaleniu jest dostosowywany do 30 minut po hybrydyzacji sondy. Ponieważ barwienie fluorescencyjne nie jest wrażliwe w zarodkach danio pręgowanego, zastępuje się je tutaj barwieniem diaminobezydyną (DAB). W tym protokole linie iPSC pochodzące od pacjenta HHT zawierające mutację eng są różnicowane w komórki śródbłonka. Po pokryciu płytki matrycą membrany podstawnej przez 30 minut w temperaturze 37 °C, iPSC-EC wysiewa się jako monowarstwę do studzienek i utrzymuje w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Następnie na podstawie obrazów mikroskopowych obliczana jest długość rurki i liczba odgałęzień. Tak więc, dzięki ulepszonemu protokołowi WISH, wykazano, że zmniejszona ekspresja eng wpływa na tworzenie się progenitorów śródbłonka w zarodkach danio pręgowanego. Jest to dodatkowo potwierdzone w testach tworzenia probówek przy użyciu iPSC-EC pochodzących od pacjenta z HHT. Testy te potwierdzają rolę eng we wczesnym rozwoju naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie opiera się na zasadzie podobnej do fluorescencyjnego transferu energii. Została ona zaprojektowana w celu zwiększenia zarówno czułości, jak i specyficzności ISH u danio pręgowanego, a także w celu wzmocnienia sygnałów specyficznych dla celu bez wpływu na sygnał tła.
W zarodkach danio pręgowanego w 24. godzinie po zapłodnieniu (hpf), endoglina wykazuje wysoką ekspresję w tylnej żyl...

Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Hybrydyzacja in situ WISH zapewnia wysoką rozdzielczość i niski wynik tła w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Ponadto płytki U-slide poprawiają ostrość przy tej samej ogniskowej dzięki mniejszemu zużyciu WISH można nakładać na zarodki myszy, zarodki Drosophila i inne tkanki trudne w obróbce. Test tworzenia probówek można zastosować do komórek androgenowych zróżnicowanych komórkami macierzystymi.WISH ułatwia zrozumienie funkcjonalnego znaczenia korekcji mutacji. Osobą, która zademonstruje procedurę, jest Yong Wang, asystent naukowy z mojego laboratorium. Pracując pod mikroskopem, użyj systemu FemtoJet, aby wstrzyknąć dwa nanogramy Morpholinos i 500 pikogramów MRNA do jednokomórkowych zarodków.Ćwicz mikroiniekcję Morpholinos wiele razy, aż będziesz w stanie skutecznie wstrzyknąć go do komórek i zachować integralność jaj. Wysiaduj zygoty, aż zostaną zdechorionowane i osiągną stan rozwoju odpowiadający zamierzonemu eksperymentowi. Zgodnie z opisem w tabeli pierwszej manuskryptu.Następnie za pomocą plastikowej pipety przenieś od 20 do 40 zarodków do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego 4% roztworu PFA w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu,

whole-mount-situ-hybridization-zebrafish-embryos-tube-formation-assay

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Tutaj prezentujemy prostą metodę ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) u embrionalnych danio pręgowanego. HSPC od zdysocjowanego danio pręgowanego są posiane w metylocelulozie z czynnikami podporowymi, różnicującymi się w dojrzałą krew. Pozwala to na wykrycie wad krwi i łatwe przeprowadzanie badań przesiewowych leków.

Opracowanie testu in vitro do ilościowego oznaczania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Poznaj hybrydyzację in situ w całości w zarodkach Danio rerio oraz test tworzenia rurek w komórkach iPSC-EC w celu badania roli endoglinu w rozwoju naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym (Wideo) | JoVE Journal

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Przeglądaj więcej filmów