Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

Protokół ten jest przydatny do izolacji enteroidów w hodowli, a także do badania proliferacji komórek i przeżywalności w enteroidach. Naukowcy mogą zastosować tę technikę do hodowli enteroidów oraz do badania wpływu leków i cytokin zapalnych na komórki nabłonka jelitowego in vitro. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię wodną nieswoistych zapaleń jelit.

Stosujemy tę metodę, aby znaleźć niektóre cytokiny terapeutyczne. Metoda ta zapewnia wgląd w proliferację i przeżycie nabłonka jelitowego; Ponadto może być również stosowany w organoidach, hodowanych wokół tkanek innych niż jelito. Aby wyizolować krypty jelitowe i przeprowadzić hodowlę enteroidów, użyj kleszczy tkankowych i znajdź nożyczki do tęczówki, aby wyciąć około ośmiu centymetrów jelita krętego od poddanej eutanazji ośmiotygodniowej myszy typu dzikiego.

Użyj strzykawki z igłą do karmienia przez zgłębnik, aby przepłukać jelito kręte około 40 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco, a następnie przeciąć wzdłuż nożyczkami i otworzyć jelito kręte. Pokrój jelito kręte na małe kawałki i umieść je w pięciu mililitrach sterylnego, lodowatego DPBS w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie kołysz próbką przez pięć minut na lodzie.

Użyj kontrolera pipet, aby zassać DPBS i zastąp go 10 mililitrami zimnego bufora. Po 30 minutach bujania na lodzie użyj kontrolera pipet, aby zassać bufor pierwszy i zastąpić 10 mililitrami zimnego buforu drugiego. Następnie potrząsaj ręcznie przez dwie do trzech minut z prędkością około 80 wstrząsów na minutę.

Po wstrząśnięciu sprawdź pod mikroskopem dwudziestomikrolitrową kroplę buforu drugiego, aby upewnić się, że znajdują się krypty z ziarnistymi komórkami Panetha. Przefiltrować bufor dwóch zawartości za pomocą sterylnego sitka komórkowego o średnicy 70 mikronów i zebrać przefiltrowany bufor do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Odpipetować 20 mikrolitrów filtratu na szkiełko, aby policzyć krypty.

Przenieś wystarczającą objętość przefiltrowanego buforu o dwie zawartości, aby upewnić się, że w każdym dołku znajduje się około 500 krypt. Wirować w dół z prędkością 150 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza, a następnie ostrożnie zassać supernatant. Ponownie zawiesić krypty w 50 mikrolitrach matrycy membrany podstawnej na 500 krypt.

Pipetuj w górę i w dół, uważając, aby nie powstały pęcherzyki. Umieść 50-mikrolitrową kroplę matrycy membrany podstawnej i mieszanki krypty na środku jednej studzienki 24-dołkowej płytki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu polimeryzacji macierzystej matrycy błony podstawnej.

Po 30 minutach polimeryzacji ostrożnie dodaj 600 mikrolitrów podłoża minijelitowego do każdej studzienki. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i obserwuj pod mikroskopem każdego dnia, zmieniając pożywkę co dwa do trzech dni. Aby przejść przez enteroidy, umieść płytkę do hodowli tkankowej na lodzie, odessaj pożywkę i dodaj jeden mililitr zimnego DPBS do każdej studzienki.

Użyj końcówki P1000 do pipetowania w górę i w dół, aż nie pozostaną żadne kawałki matrycy. Przełóż próbkę w górę przez jednomililitrową strzykawkę insulinową i w dół do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 150 razy G i czterech stopniach Celsjusza, użyj pipety, aby usunąć DPBS.

Ponownie zawiesić enteroidy w 50 mikrolitrach macierzy błony podstawnej na studzienkę. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację matrycy błony podstawnej. Następnie pokryj każdą studzienkę 600 mikrolitrami pożywki ENR i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Hoduj enteroidy przez pięć do siedmiu dni przed przeniesieniem ich do nowej 24-dołkowej płytki, stosując współczynnik podziału od jednego do dwóch. Dodaj 600 mikrolitrów pożywki ENR do każdej studzienki, a następnie inkubuj enteroidy przez cztery do pięciu dni w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ustaw grupę kontrolną nieleczonych enteroidów i eksperymentalną grupę enteroidów traktowanych pięcioma nanogramami na mililitr interleukiny-22.

Przygotuj co najmniej trzy powtórzenia dla każdej grupy. Dodaj 600 mikrolitrów pożywki EdU do każdej studzienki enteroidów, z wyjątkiem jednej studzienki, która ma być używana jako kontrola ujemna do odejmowania tła. Inkubuj płytkę przez dwie godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby pobrać enteroidy z macierzy błony podstawnej, należy użyć kontrolera pipet do zasysania pożywki EdU i przemyć ją raz DPBS. Następnie dodaj jeden mililitr DPBS. Użyj końcówki do pipet P1000, aby pipetować w górę i w dół, aż nie pozostaną żadne stałe kawałki matrycy membrany podstawnej.

Przenieść próbkę do probówki o pojemności 15 mililitrów i wirować z prędkością 300 razy G przez pięć minut przed wyrzuceniem supernatantu. Dodaj 500 mikrolitrów enzymów dysocjacji komórek i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj końcówki do pipety P200, aby pipetować w górę i w dół i rozbijać enteroidy na pojedyncze komórki.

Następnie dodaj trzy mililitry zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i kilkakrotnie pipetuj końcówką do pipety P1000. Po odwirowaniu w temperaturze 300 razy G przez pięć minut i zasysaniu supernatantu, zawieszamy komórki w jednym mililitrze DPBS. Aby przeprowadzić utrwalanie i przepuszczalność komórek, najpierw przenieś zawiesinę komórek do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki, wiruj w dół z prędkością 300 razy G przez pięć minut i wyrzuć supernatant.

Zawieszamy komórki w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu i utrwalamy na 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu w temperaturze 300 razy G przez pięć minut, odessać supernatant za pomocą końcówki pipety. Umyj komórki raz za pomocą DPBS i ponownie odwiruj, aby usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić komórki jednym mililitrem 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed umyciem komórek DPBS jak poprzednio. Aby wykryć EdU, dodaj 100 mikrolitrów koktajlu reakcyjnego do każdej 1,5 mililitrowej probówki. Ponownie zawiesić komórki i chroniąc je przed światłem, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu w temperaturze 300 razy G przez pięć minut, delikatnie zassać roztwór reakcyjny końcówką pipety Dodaj 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego do każdej probówki, aby przemyć raz w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu, jak poprzednio, zawieszamy komórki w jednym mililitrze DPBS. Przefiltruj zawieszone komórki za pomocą sitka o wielkości 40 mikronów i zbierz przefiltrowane komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.

Przeprowadzaj jak najszybsze pobieranie danych dotyczących wykrywania maszyny. Wybierz odpowiedni kanał i napięcie do analizy cytometrii przepływowej. W przypadku strategii bramkowania narysuj wykres pseudokolorowy FSC-A i SSC-A i rozmieść większość komórek do widocznego zakresu mapy punktowej, dostosowując napięcie.

Wybierz populację komórek jako R1 i wyklucz resztki komórek w lewym dolnym rogu. Na podstawie populacji komórek R1 ustal wykres pseudokolorów FSC-A i FSC-H. Ustaw bramkę tak, aby wybierała pojedyncze komórki oznaczone jako R2 i wykluczała skupiska komórek.

Z populacji komórek R2 ustal wykres intensywności fluorescencji w funkcji liczby komórek i użyj kontroli ujemnej, aby ustawić bramkę. Obszar sygnału fluorescencyjnego jest dodatnim regionem komórki oznaczonym jako R3. Porównaj stosunek tych komórek EdU dodatnich między grupą eksperymentalną i kontrolną. Krypty jelita cienkiego wyizolowano i wyhodowano jako enteroidy w macierzy błony podstawnej.

Enteroidy zaczęły tworzyć pąki dwa dni po izolacji. Szóstego dnia enteroidy miały wiele pąków z dużą ilością zanieczyszczeń w świetle. Enteroidy były gotowe do przejścia na tym etapie.

Enteroidy leczono IL-22 przez 3 dni, po czym syntetyczne DNA znakowano EdU na czerwono, aby wskazać proliferację komórek. Enteroidy leczone IL-22 wykazywały zwiększoną liczbę komórek EdU dodatnich. IL-22 zwiększyła liczbę proliferujących komórek z 40,1% do 83,5%, jak analizowano za pomocą cytometrii przepływowej.

Leczenie IL-22 zwiększało również śmierć komórek w enteroidach, na co wskazuje barwienie jodkiem propidyny na czerwono. IL-22 zwiększyła liczbę martwych komórek z 4,9% do 16,2%, jak analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Podczas postępu izolacji krypt po dodaniu bufora potrzebne jest uczciwe potrząsanie, aby upewnić się, że wystarczająca liczba krypt została wstrząśnięta.

Zalecamy sprawdzenie zawartości pod mikroskopem. Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy również określić ilościowo zróżnicowane typy nabłonków i enteroidów za pomocą specyficznych Ta metoda pomoże naukowcom zbadać różnicowanie nabłonka jelitowego w enteroidach. Po jego opracowaniu pytanie to toruje drogę naukowcom w dziedzinie gastroenterologii do zbadania kwestii rozwojowych lub patologicznych w tym cięciu.