Name: Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj metodę izolacji enteroidów z jelita myszy i analizę cytometryczną komórek proliferacyjnych oraz martwych. Technika ta umożliwia badanie wpływu leków i cytokin na komórki nabłonkowe jelita.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31971062, 31900326 i 31601022), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20190043, BK20180838), Fundusz Badawczy Państwowego Kluczowego Laboratorium Biotechnologii Farmaceutycznej, Uniwersytet w Nankinie (KF-GN-202004). Fundacja Nauk Przyrodniczych Chińskich Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (19KJB320003), Program Źródeł Utrzymania i Technologii miasta Suzhou (SYS2019030) oraz Program Innowacji Badawczych dla Absolwentów Szkół Wyższych w prowincji Jiangsu (KYCX19-1981). Praca ta jest również wspierana przez Tang Scholar z Uniwersytetu Soochow.

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) na Uniwersytecie Soochow.
1. Izolacja i hodowla organoidów jelitowych
<ol>
	<li>Izolacja krypt jelitowych i hodowla enteroidów
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji 8-tygodniową mysz typu dzikiego za pomocą wdychania CO2 . Użyj kleszczyków do tkanek i cienkich nożyczek do tęczówki, aby wyciąć około 8 cm jelita krętego.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki z igłą do karmienia przez zgłębnik wypłukać około 40 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, a następnie przeciąć wzdłuż nożyczkami i otworzyć jelito kręte.</li>
		<li>Pokrój jelito kręte na małe (0,5−1,0 cm) kawałki. Umieść kawałki w 5 ml sterylnego, lodowatego DPBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, a następnie kołysz się przez 5 minut na lodzie.</li>
		<li>Użyj kontrolera pipet, aby zassać DPBS i zastąp go 10 ml zimnego buforu 1 (2 mM EDTA w DPBS). Kołysz się przez 30 minut na lodzie.</li>
		<li>Za pomocą kontrolera pipet odessać bufor 1 i zastąpić go 10 ml zimnego buforu 2 (54,9 mM D-sorbitolu, 43,4 mM sacharozy w DPBS). Wstrząsaj ręcznie przez 2-3 minuty (~80 wstrząsów/min).</li>
		<li>Pobrać 20 μl kropli zawartości buforu 2 po wstrząśnięciu i sprawdzić pod mikroskopem.</li>
		<li>Przefiltrować zawartość buforu 2 za pomocą sterylnego sitka komórkowego o pojemności 70 μm, a następnie zebrać przefiltrowany bufor za pomocą stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odpipetować 20 μl filtratu na szkiełko, aby policzyć krypty. Przenieś wystarczającą ilość bufora 2 z kroku 1.1.7, aby upewnić się, że jest ~500 krypt/studnię.</li>
		<li>Wirować przy 150 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania ostrożnie odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić krypty w 50 μl matrycy błony podstawnej (np. Matrigel) na 500 krypt, pipetować w górę i w dół (uważając, aby uniknąć pęcherzyków), a następnie umieścić 50 μl kropli mieszaniny matrycy błony podstawnej/krypty w środku jednej studzienki w 24-dołkowej płytce. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu polimeryzacji matrycy błony podstawnej.</li>
		<li>Po 30 minutach polimeryzacji ostrożnie dodać 600 μL pożywki dla minijelit (zaawansowane zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco [DMEM]/F12, 2 mM L-alanino-L-glutamina, długopis/paciorkowiec [100 jednostek/ml], 10 mM Hepes, suplement N2 [1:100], suplement B27 [1:50] z naskórkowym czynnikiem wzrostu [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondyna [500 ng/mL] i Y27632 [10 μM]), następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Obserwuj pod mikroskopem każdego dnia i zmieniaj pożywkę co 2-3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie jelit 
	UWAGA: W przypadku długich kultur enteroidy należy dzielić mniej więcej co tydzień.
	<ol>
		<li>Aby przejść przez enteroidy, umieść płytkę do hodowli tkankowej na lodzie. Odessać pożywkę i dodać 1 ml zimnego DPBS do każdej studzienki. Użyj końcówki P1000 do pipetowania w górę i w dół, aż nie pozostaną żadne stałe kawałki matrycy membrany podstawnej.</li>
		<li>Przepuścić raz w górę i w dół przez strzykawkę insulinową o pojemności 1 ml (27 g) i do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 150 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Użyj pipety, aby usunąć DPBS. Zawiesić w 50 μl matrycy/studzienki membrany podstawnej.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację macierzystej matrycy membranowej. Pokryj każdą studzienkę 600 μl pożywki ENR (pożywka dla minijelita, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondyny), a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek EdU-dodatnich w enteroidach
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje przebieg analizy metodą cytometrii przepływowej komórek EdU-dodatnich w enteroidach.
<ol>
	<li>Inkubacja enteroidów z EdU
	<ol>
		<li>Hoduj enteroidy z kroku 1.2.4 przez 5–7 dni. Enteroidy pasażowe do nowej płytki 24-dołkowej w stosunku podziału 1:2. Dodać 600 μl pożywki ENR do każdej studzienki. Inkubować enteroidy przez 4-5 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Ustawić grupę kontrolną (enteroidy nieleczone) i grupę eksperymentalną (enteroidy leczone interleukiną 22 5 ng / ml [IL-22]). Przygotuj co najmniej trzy powtórzenia dla każdej grupy.</li>
		<li>Dodać EdU do pożywki ENR, aby przygotować pożywkę EdU o stężeniu 50 μM. Dodać 600 μl pożywki EdU do każdej studzienki i inkubować przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Ustaw jedną studzienkę enteroidów bez leczenia EdU jako negatywną kontrolę dla odejmowania tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie enteroidów z macierzy błony podstawnej
	<ol>
		<li>Użyj kontrolera pipet, aby zassać pożywkę EdU i przemyć 1x DPBS. Dodać 1 ml DPBS.</li>
		<li>Użyj końcówki pipety P1000 i pipety w górę iw dół, aż nie pozostaną żadne stałe kawałki matrycy membrany podstawnej. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 500 μl enzymów dysocjacji komórek (tabela materiałów) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Użyć końcówki pipety P200 i pipety w górę i w dół, aby rozbić enteroidy na pojedyncze komórki.</li>
		<li>Dodać 3 ml pożywki DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i kilkakrotnie pipetować końcówką do pipety P1000.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut i odsysać pożywkę sklarowaną nad osadem. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie i przenikanie komórek
	<ol>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml, wirować w tempie 300 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki z 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA), utrwalić na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant za pomocą końcówki pipety, przemyć 1x DPBS i odwirować w dół, aby usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawieś komórki za pomocą 1 ml 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Przemyć 1x DPBS i odwirować, aby usunąć supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie EdU
	<ol>
		<li>Przygotuj wcześniej roztwory podstawowe dla każdego składnika: 1) roztwór roboczy azydku Alexa Fluor, 2) roztwór roboczy 1x buforu reakcyjnego EdU i 3) 10x roztwór podstawowy dodatku buforowego EdU.</li>
		<li>Przygotować 1x dodatek buforowy EdU, rozcieńczając 10x roztwór 1:10 w wodzie dejonizowanej. Przygotuj ten roztwór na świeżo.</li>
		<li>Przygotować koktajl reakcyjny zgodnie z tabelą 1. 
		UWAGA: Dodaj składniki w kolejności podanej w tabeli. Koktajl reakcyjny należy zużyć w ciągu 15 minut od przygotowania.</li>
		<li>Dodaj 100 μl koktajli reakcyjnych do każdej probówki o pojemności 1,5 ml. Ponownie zawiesić komórki, chronić przed światłem, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i delikatnie zasysać roztwór reakcyjny końcówką pipety.</li>
		<li>Dodaj 0,5% niejonowego penetrantu środka powierzchniowo czynnego do każdej probówki, aby przepłukać 1x w temperaturze pokojowej. Odwirować przy 300 x g przez 5 minut, delikatnie zassać supernatant końcówką pipety i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza komórek za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Przefiltrować zawieszone komórki za pomocą sitka o wielkości 40 μm, a następnie zebrać przefiltrowane komórki za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wykonaj wykrywanie FACS na maszynie tak szybko, jak to możliwe. 
		UWAGA: Jeśli warunki są ograniczone, próbki barwione komórkami należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i poddać próbie przepływu w ciągu 3 dni.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni kanał (w zależności od typu azydku Alexa Fluor w zestawie EdU; tutaj kanał czerwony) i napięcie (tutaj ~150–350 V) do analizy cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Strategia bramkowania
		<ol>
			<li>Narysuj wykres pseudokolorów FSC-A (oś x) i SSC-A (oś y) i rozmieść większość komórek do widocznego zakresu mapy punktowej, dostosowując napięcie. Wybierz populację komórek (R1) i wyklucz resztki komórek w lewym dolnym rogu.</li>
			<li>Na podstawie populacji komórek R1 ustal FSC-A (oś x) vs. Wykres pseudokolorów FSC-H (oś y) i ustaw bramkę tak, aby wybierała pojedyncze komórki (R2), aby wykluczyć skupiska komórek.</li>
			<li>Na podstawie populacji komórek R2 ustal wykres intensywności fluorescencji (oś x) w funkcji liczby komórek (oś y) i użyj kontroli ujemnej, aby ustawić bramkę. Obszar sygnału fluorescencyjnego jest dodatnim regionem komórki (R3). Porównaj stosunek komórek EdU-dodatnich (R3) między grupą eksperymentalną i kontrolną.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek PI-dodatnich w enteroidach
UWAGA: Rysunek 2 pokazuje przebieg analizy metodą cytometrii przepływowej komórek PI-dodatnich w enteroidach.
<ol>
	<li>Inkubacja komórek enteroidalnych z PI
	<ol>
		<li>Hoduj enteroidy z kroku 1.2.4 przez 5–7 dni. Enteroidy pasażowe do nowej płytki 24-dołkowej w stosunku podziału 1:2. Dodać 600 μl pożywki ENR do każdej studzienki. Inkubować enteroidy przez 4-5 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Ustaw grupę kontrolną (nieleczoną) i eksperymentalną (leczoną IL-22), używając co najmniej trzech powtórzeń dla każdej grupy.</li>
		<li>Dodać PI do pożywki ENR, aby przygotować pożywkę PI o stężeniu 3 μM.</li>
		<li>Dodać 600 μl pożywki PI do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Ustaw jedną studzienkę enteroidów bez leczenia PI jako kontrolę ujemną dla odejmowania tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać enteroidy z macierzy błony podstawnej, wykonując kroki 2.2.1−2.2.5.</li>
	<li>Analiza komórek za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Przefiltrować zawieszone komórki za pomocą sitka o wielkości 40 μm i zebrać przefiltrowane komórki za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wykonaj wykrywanie FACS na maszynie tak szybko, jak to możliwe. 
		UWAGA: Jeśli warunki są ograniczone, próbki barwione komórkami należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C i poddać próbie przepływu w ciągu 3 dni.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni kanał (tutaj kanał czerwony) i napięcie (tutaj ~150–350 V) do analizy cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Należy zastosować tę samą strategię bramkowania, jak opisano w sekcji 2.5.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten szczegółowo opisuje etapy niezbędne do hodowli enteroidów in vitro i kwantyfikacji komórek EdU- i PI-dodatnich w enteroidach za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia ta ma kilka zalet. Po pierwsze, znakowanie EdU służy do wykrywania proliferujących komórek w enteroidach. W porównaniu z tradycyjnym testem BrdU, metoda znakowania EdU jest szybsza, bardziej czuła i dokładniejsza. EdU jest bardzo podobny do tyminy (T), która zastępuje tyminę w syntezie DNA podczas podziału komórki. W porównaniu z przeciwciał...

Podstawową funkcją komórek nabłonka jelitowego jest ochrona przed przedostawaniem się zawartości światła, takiej jak chorobotwórcze bakterie i toksyny1,2. Aby pełnić taką funkcję, jelitowe komórki macierzyste stale namnażają się i różnicują w różne komórki nabłonkowe, w tym enterocyty i komórki wydzielnicze, które tworzą barierę, tworząc ścisłe połączenia3. Szybka odnowa komórek nabłonka jelitowego wymaga ścisłej koordynacji proliferacji komórek, różnicowania komórek i śmierci komórki4,5. Zmniejszona proliferacja komórek lub nadmierna śmierć komórek prowadzi do uszkodzenia nabłonka i upośledzenia funkcji bariery1,6. Dysfunkcja bariery jelitowej jest związana z chorobami zapalnymi jelit7,8.
Metoda hodowli krypt jelitowych została już wcześniej opracowana. Korzystając z tej techniki, izolowane krypty myszy wyrastają na organoidy jelitowe (enteroidy), które mają struktury przypominające kosmki kryptowe i zawierają całą linię komórek nabłonka jelitowego9,10. 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) jest analogiem tymidyny, który jest zdolny do zastąpienia tyminy (T) w DNA przechodzącym replikację podczas proliferacji komórek. Komórki proliferacyjne można szybko i dokładnie oznaczyć za pomocą barwienia EdU. Jodek propidyny (PI) jest analogiem bromku etydyny, który uwalnia czerwoną fluorescencję po wprowadzeniu do dwuniciowego DNA. PI specyficznie wykrywa martwe komórki, ponieważ przechodzi tylko przez uszkodzoną błonę komórkową.
W tym protokole najpierw opisujemy, jak wyizolować krypty z mysiego jelita cienkiego, a następnie hodować je jako enteroidy in vitro. Następnie opisujemy, jak analizować komórki proliferacyjne i martwe w enteroidach za pomocą inkorporacji EdU i PI oraz cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 G igła do zgłębników</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek sterylnych 40 mm</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek sterylnych 70 mm</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Akustyczny cytometr ogniskujący</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bufor 1</td><td></td><td></td><td>2 mM EDTA w DPBS</td></tr><tr><td>Bufor 2</td><td></td><td></td><td>54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mM sacharoza w myszach</td></tr> <tr><td></td><td>DPBS C57/B6Instytut Badań Biomedycznych Uniwersytetu</td><td></td><td></td>w Nankinie</tr><tr><td>Enzymy dysocjacji komórek (TrypLE)</td><td>Technologie życia</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Zestaw do obrazowania</td><td>Żywotność technologie</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-sorbitol</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR pożywka</td><td></td><td></td><td>Pożywka Minigut, 50 ng / ml EGF, 100 ng / ml Noggin, 500 ng / ml R-spondyna</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki</td><td></td> Mikroskop fluorescencyjny <td>Tansoole</td> 2037454 <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplement</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica Technologie</td><td>życia</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon HDMEM</td><td></td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut media</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 jednostek/ml), 10 mM Hepes, suplement N2 (1:100), suplement B27 (1:50)</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>R& D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny (Triton X)</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne (12,5 cm)</td><td>Tansool</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek</td><td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Nabłonek jelitowy działa jak bariera, która zapobiega przedostawaniu się do reszty ciała zawartości światła, takiej jak patogenna mikrobiota i toksyny. Funkcja bariery nabłonkowej wymaga integralności komórek nabłonka jelitowego. Podczas gdy proliferacja komórek nabłonkowych utrzymuje ciągłą warstwę komórek, która tworzy barierę, uszkodzenie nabłonka prowadzi do dysfunkcji bariery. W rezultacie, zawartość światła może przenikać przez barierę jelitową przez nieograniczoną drogę. Dysfunkcja bariery jelitowej jest związana z wieloma chorobami jelit, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit. Izolowane krypty jelitowe myszy mogą być hodowane i utrzymywane jako struktury przypominające kosmki kryptowe, które są nazywane organoidami jelitowymi lub "enteroidami". Enteroidy są idealne do badania proliferacji i śmierci komórek nabłonka jelitowego in vitro. W tym protokole opisujemy prostą metodę ilościowego określania liczby komórek proliferacyjnych i martwych w hodowanych enteroidach. 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) i jodek propidyny są używane do znakowania proliferujących i martwych komórek w enteroidach, a proporcja proliferujących i martwych komórek jest następnie analizowana za pomocą cytometrii przepływowej. Jest to przydatne narzędzie do testowania wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację komórek nabłonka jelitowego i przeżycie komórek.

Krypty jelita cienkiego zostały wyizolowane i hodowane jako enteroidy w macierzy błony podstawnej. Enteroidy zaczęły tworzyć pączki 2 dni po izolacji. W 6. dniu enteroidy posiadały wiele pączków z dużą ilością debris (martwych komórek) w świetle. Na tym etapie enteroidy były gotowe do pasażowania (Rysunek 3).
Liczne badania wykazały, że cytokiny prozapalne są niezbędne dla utrzymania homeostazy nabłonka jelitowego. Nieprawidłowa ekspresja cytokin prozapalnych jest...

Prezentowany protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określenia liczby proliferujących i martwych komórek w hodowanych enteroidach myszy. Metoda ta jest pomocna w ocenie wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację organoidów i przeżycie.

Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Protokół ten jest przydatny do izolacji enteroidów w hodowli, a także do badania proliferacji komórek i przeżywalności w enteroidach. Naukowcy mogą zastosować tę technikę do hodowli enteroidów oraz do badania wpływu leków i cytokin zapalnych na komórki nabłonka jelitowego in vitro. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię wodną nieswoistych zapaleń jelit.Stosujemy tę metodę, aby znaleźć niektóre cytokiny terapeutyczne. Metoda ta zapewnia wgląd w proliferację i przeżycie nabłonka jelitowego; Ponadto może być również stosowany w organoidach, hodowanych wokół tkanek innych niż jelito. Aby wyizolować krypty jelitowe i przeprowadzić hodowlę enteroidów, użyj kleszczy tkankowych i znajdź nożyczki do tęczówki, aby wyciąć około ośmiu centymetrów jelita krętego od poddanej eutanazji ośmiotygodniowej myszy typu dzikiego.Użyj strzykawki z igłą do karmienia przez zgłębnik, aby przepłukać jelito kręte około 40 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco, a następnie przeciąć wzdłuż nożyczkami i otworzyć jelito kręte. Pokrój jelito kręte na małe kawałki i umieść je w pięciu mililitrach sterylnego, lodowatego DPBS w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Następ

quantification-of-proliferative-and-dead-cells-in-enteroids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Enteroidy wyłaniają się jako nowy model w badaniach nad chorobami ludzkimi. Protokół opisuje, w jaki sposób symulować enteroidalny model ludzkiego martwiczego zapalenia jelit za pomocą leczenia lipopolisacharydami (LPS) enteroidów generowanych z tkanki noworodka. Pobrane enteroidy wykazują zmiany zapalne podobne do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit.

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie enteroidów, trójwymiarowego modelu jelitowego, z tkanki jelitowej płodu. Do charakterystyki modelu wykorzystano obrazowanie immunofluorescencyjne biomarkerów nabłonkowych. Wierzchołkowa ekspozycja lipopolisacharydów, endotoksyny bakteryjnej, przy użyciu techniki mikroiniekcji indukowała przepuszczalność nabłonka w sposób zależny od dawki, mierzoną przez wyciek dekstranu fluorescencyjnego.

Badanie przepuszczalności nabłonka w enteroidach pochodzących z tkanek płodowych

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Ten protokół opisuje prostą i opłacalną metodę badania i ilościowego określania śmierci komórek w organoidach ludzkiego jelita grubego w odpowiedzi na cytotoksyczne zaburzenia, takie jak cytokiny. Podejście to wykorzystuje fluorescencyjny barwnik śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopię fluorescencyjną na żywo i oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym w celu ilościowego określenia odpowiedzi pojedynczych organoidów na bodźce cytotoksyczne.

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów wierzchołkowych z jelit ze standardowych kultur organoidów osadzonych w matrycy. Przedstawiono również późniejsze włączenie EdU do aktywnie proliferujących komórek i półautomatyczną kwantyfikację komórek EdU-dodatnich.

Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU

Poznaj metodę izolacji enteroidów z jelita myszy i analizę cytometryczną komórek proliferacyjnych oraz martwych. Technika ta umożliwia badanie wpływu leków i cytokin na komórki nabłonkowe jelita.

Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

Przeglądaj więcej filmów