Integracja podejść bioinformatycznych i walidacji eksperymentalnych w celu zrozumienia roli sygnalizacji Notch w raku jajnika
January 12th, 2020
Bioinformatyka to użyteczny sposób na przetwarzanie dużych zbiorów danych. Dzięki wdrożeniu podejść bioinformatycznych naukowcy mogą szybko, niezawodnie i skutecznie uzyskiwać wnikliwe aplikacje i odkrycia naukowe. W artykule przedstawiono wykorzystanie bioinformatyki w badaniach nad rakiem jajnika. Z powodzeniem weryfikuje również wyniki badań bioinformatycznych poprzez eksperymenty.
Bioinformatyka to użyteczny sposób wydobywania informacji ze zbiorów danych. Eksperymentowanie jest równie ważne dla walidacji. Łączymy oba podejścia, aby zbadać rolę sygnalizacji notch w raku jajnika.
Główną zaletą tej techniki jest to, że naukowcy mogą wykorzystać informacje z bioinformatycznych baz danych do zaplanowania kierunku badań przed przeprowadzeniem eksperymentu. Dzięki zgromadzonym danym bioinformatycznym dotyczącym chorób człowieka, naukowcy nie mają już zawiązanych oczu. Można przeprowadzić eksperymenty w celu zweryfikowania konkretnych wyników, co może prowadzić do lepszych terapii lub diagnozowania chorób.
W celu analizy meta-A związku interesującego genu z określonym typem nowotworu, utwórz konto z adresem e-mail powiązanym z nauką, aby uzyskać dostęp do bazy danych PRECOG i wprowadź adres e-mail i hasło powiązane z kontem do terminala logowania. Kliknij Wyświetl szczegóły i wprowadź interesujący Cię gen w pasku wyszukiwania. Następnie użyj paska przewijania, aby uzyskać wskaźnik Z-score przeżycia dla określonego rodzaju nowotworu.
Aby zbadać związek między poziomem ekspresji genów a stopniami zaawansowania raka jajnika, przejdź do strony internetowej CSIOVDB i wprowadź nazwę interesującego genu w pasku wyszukiwania. Następnie proszę kliknąć na zakładkę Przetrwanie. Aby ocenić dane dotyczące ekspresji genów w tkankach różnorodnych, prawidłowych i nowotworowych, przejdź do portalu GENT i kliknij kartę Szukaj.
W sekcji słowa kluczowego wybierz symbol genu dla terminów z menu rozwijanego, wprowadź symbol genu interesującego Cię genu i wybierz opcję Tkanka jako opcję typu. Kliknij przycisk Szukaj. Zostaną wyświetlone wykresy podsumowujące ekspresję genów w tkankach prawidłowych i nowotworowych różnych typów nowotworów, w oparciu o platformy U133A i U122 Plus 2.
Następnie kliknij łącze Pobierz dane wynikowe, aby uzyskać dostęp do szczegółowych informacji o wartościach ekspresji genów, typach tkanek i źródłach danych. Aby wyszukać zmiany genetyczne i sieci sygnalizacyjne, otwórz stronę internetową portalu CBIO i korzystając z zapytania na stronie docelowej, kliknij interesujące narządy lub tkanki w sekcji Wybierz badania, wybierz konkretne badanie, które Cię interesuje, a następnie kliknij Zapytanie według genu. W sekcji Wybierz profile genomowe wybierz mutacje, przypuszczalne zmiany liczby kopii z GISTIC lub opcję ekspresji mRNA.
Wybierz odpowiednie dane z menu Wybierz pacjenta/zestaw przypadków i wprowadź symbole genów docelowych w polu zapytania Wprowadź geny. Kliknij przycisk Prześlij zapytanie i otwórz kartę Sieć, aby pobrać żądaną sieć genów. Następnie kliknij kartę Plik i wybierz opcję Zapisz jako obraz PNG w celu pobrania obrazu sieciowego.
Aby stworzyć muchy z nadekspresją NICD lub NICD i mam, przygotuj odpowiednie stada much i zastosuj technikę celowania w czasową i regionalną ekspresję genów w celu kontrolowania czasoprzestrzennej ekspresji genów, zgodnie ze standardowymi protokołami. Wyhoduj muchy w temperaturze 18 stopni Celsjusza do osiągnięcia dorosłości, a następnie przełącz się na 29 stopni Celsjusza z drożdżami na 48 godzin. Pod koniec inkubacji w temperaturze 29 stopni Celsjusza dodaj trzy mililitry PBS do naczynia do pobierania zarodków i znieczul kulturę much za pomocą podkładki z dwutlenkiem węgla.
Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby zidentyfikować znieczuloną samicę muchy i użyj pary kleszczy preparacyjnych, aby ostrożnie chwycić dolną część klatki piersiowej muchy. Zanurz muchę w PBS w naczyniu do pobierania zarodków i użyj drugiej pary kleszczy, aby uszczypnąć dolną część brzucha, delikatnie pociągając, aby uwolnić narządy wewnętrzne. Zlokalizuj i odłącz parę jajników od ciała muchy i przerwij osłonkę mięśniową, znajdującą się na tylnym końcu jajników, aby oddzielić jajniki.
Następnie umieść izolowane jajniki w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej, zawierającej 500 mikrolitrów PBS na lodzie. Po pobraniu wszystkich jajników zastąp PBS 500 mikrolitrami 4% formaldehydu i umieść probówkę na nutatorze na 10 minut. Pod koniec inkubacji wyrzuć utrwalacz i umyj jajniki trzema 15-minutowymi płukaniami w jednym mililitrze PBT na przemycie.
Po ostatnim płukaniu oznacz jajniki 150 mikrolitrami po 10 mikrogramów na mililitr DAPI przez 10-15 minut na nutatorze. Pod koniec inkubacji przemyć jajniki jeden raz przez 10 minut jednym mililitrem PBT, a następnie dwa 10-minutowe płukania w PBS. Po drugim płukaniu usuń wszystkie oprócz ostatnich 300 mikrolitrów PBS i użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby kilkakrotnie strytekować jajniki, aby uwolnić komory jajowe.
Następnie delikatnie osadź tkankę jajnika poprzez szybkie wirowanie w mikrowirówce i usuń jak najwięcej PBS, nie naruszając osadu jajnika. Używając końcówki do pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, przenieś około trzech kropli roztworu montażowego do probówki i użyj końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów z około 0,33 milimetra przyciętym od końca, aby przenieść całe 120 mikrolitrów roztworu mocującego zawierającego jajnik na szklane szkiełko mikroskopowe. Delikatnie umieść szkło nakrywkowe na roztworze montażowym i uszczelnij krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci.
Następnie użyj mikroskopu konfokalnego przy 10-krotnym powiększeniu z aperturą 0,8, aby uzyskać obrazy barwionych i zamontowanych jajników. Korzystając z portalu PRECOG, jak pokazano, można uzyskać Z-score NOTCH2, NOTCH3 i MAML1 w raku jajnika. Ujemne wartości Z-score wskazują na słabe całkowite przeżycie pacjentów z wysokim poziomem ekspresji trzech genów.
Wykorzystanie bazy danych CSIOVD do potwierdzenia tych ustaleń wskazuje ponadto, że wysoka ekspresja NOTCH2, NOTCH3 i MAML1 koreluje ze słabym ogólnym i wolnym od choroby przeżyciem. Dalsze testy permutacji sugerują, że NOTCH2, NOTCH3 i MAML1 są silnie eksprymowane w tkankach nowotworowych. Na podstawie tych trzech podstawowych genów można stworzyć sieć sygnalizacyjną, aby zapewnić 50 najczęściej zmienianych sąsiednich genów, które również znajdują się w tym samym szlaku o najwyższych wskaźnikach mutacji.
Co ciekawe, nadekspresja genu NOTCH równoważnego z Drosophila, NICD, sama w sobie nie indukuje nowotworów u Drosophila. Natomiast nadekspresja NICD i mam razem indukuje nowotwory u muszek owocowych, o czym świadczy obecność wielu warstw nabłonka i nagromadzonych komórek. Dalsza walidacja eksperymentów może utorować drogę do identyfikacji potencjalnych nowych celów terapii lekowej, biomarkerów choroby i spersonalizowanych metod leczenia.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł bada integrację bioinformatyki i eksperymentacji w celu zbadania sygnalizacji notch w raku jajnika. Wykorzystując bazy danych bioinformatycznych, naukowcy mogą strategicznie planować swoje eksperymenty, co prowadzi do bardziej pouczających odkryć naukowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bioinformatyka
- Badania nad rakiem jajnika
- Walidacja eksperymentalna
Tło
- Bioinformatyka pomaga w przetwarzaniu dużych zestawów danych.
- Łączenie bioinformatyki z eksperymentacją poprawia wyniki badań.
- Sygnalizacja notch odgrywa istotną rolę w raku jajnika.
- Wykorzystanie istniejących danych bioinformatycznych może kierować projektem eksperymentu.
Cel badania
- Zbadanie roli sygnalizacji notch w raku jajnika.
- Walidacja wyników bioinformatycznych za pomocą podejść eksperymentalnych.
- Poprawa terapii i diagnostyki raka jajnika.
Stosowane metody
- Analiza bioinformatyczna szlaków sygnalizacyjnych notch.
- Walidacja eksperymentalna przewidywań bioinformatycznych.
- Integracja danych z baz danych bioinformatycznych.
- Planowanie kierunku badań na podstawie wnikliwości bioinformatycznych.
Główne wyniki
- Sukcesywne identyfikowanie kluczowych komponentów sygnalizacji notch.
- Walidacja wyników bioinformatycznych poprzez eksperymentację.
- Wgląd w potencjalne cele terapeutyczne w raku jajnika.
- Demonstracja skuteczności łączenia bioinformatyki z metodami eksperymentalnymi.
Wnioski
- Bioinformatyka jest potężnym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Walidacja eksperymentalna jest kluczowa dla potwierdzenia przewidywań bioinformatycznych.
- Łączenie tych podejść może prowadzić do znaczących postępów w zrozumieniu raka jajnika.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Integrating bioinformatics with experimental validation enables biopharma teams to de-risk target hypotheses in ovarian cancer by leveraging large-scale datasets for target prioritization before costly wet-lab efforts. This combined approach improves predictive confidence in Notch signaling components as potential therapeutic targets or biomarkers, supporting informed go/no-go decisions in early discovery. The methodology supports translational continuity from target identification through preclinical validation by aligning computational findings with functional evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Notch2, Notch3, and MAML1 as putative drivers in ovarian cancer through bioinformatics analysis of survival Z-scores and gene expression correlations.
- Operational Value: Supports functional target validation by guiding experimental design using PRECOG, CSIOVDB, GENT, and CBIO portals to identify differentially expressed genes and altered signaling networks.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying genetic alterations and signaling networks associated with poor survival, informing target selection for further validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (e.g., Drosophila ovaries with NICD/mam overexpression) for downstream compound screening by establishing phenotype-genotype links in Notch pathway modulation.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through defined spatiotemporal gene expression controls and standardized ovarian tissue isolation, fixation, and imaging protocols.
- Scalability Value: Enables platform reuse across cancer types by demonstrating a transferable workflow for integrating database mining with experimental validation in genetically tractable models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking Notch pathway activation in Drosophila ovaries to tumorigenic phenotypes, providing a mechanistic basis for therapeutic targeting.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by requiring combinatorial overexpression (NICD + mam) to induce tumors, highlighting context-dependent pathway activity critical for target validation.
- Translational Biomarker Alignment: Connects bioinformatics-derived survival correlations (NOTCH2/3/MAML1 Z-scores) with experimental tumor phenotypes, supporting biomarker qualification efforts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, where bioinformatics informs hypothesis generation and experimental validation confirms target druggability and pathway relevance in ovarian cancer.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mining survival and expression databases to prioritize Notch signaling components for functional interrogation.
- Screening: Describes assay readiness through standardized ovarian tissue preparation and confocal imaging, enabling quantitative readouts of Notch pathway activation phenotypes.
- Analytics: Highlights survival Z-scores, gene expression correlations, and permutation test outputs that allow cross-functional teams to compare target relevance and pathway alteration frequencies.
- Translational Research: Connects computational target prioritization to preclinical continuity by validating Notch-driven tumorigenicity in a genetic model, supporting de-risked advancement.
- Enterprise Reuse: Frames the workflow as a reusable capability for target validation across oncology indications by demonstrating a repeatable process of database interrogation followed by experimental confirmation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target selection, reduction of mechanistic ambiguity in Notch pathway involvement, and improved target hypothesis quality.
- Operational Value: Standardization of bioinformatics-to-experiment workflows, reproducibility of ovarian tissue isolation and imaging, and scalability of database mining approaches.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through dual-evidence target validation, capital efficiency by focusing experiments on bioinformatics-prioritized targets, and reduced late-stage biological risk via mechanistic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of Notch2/3/MAML1 or network neighbors for investment, and data-driven advancement decisions based on concordant computational and experimental evidence.
Implementation Considerations
- Required expertise in bioinformatics database navigation (PRECOG, CSIOVDB, GENT, CBIO) and interpretation of survival Z-scores, gene expression profiles, and mutation data.
- Instrumentation needs include access to academic-affiliated bioinformatics portals, standard molecular biology tools for fly handling, dissection microscopes, centrifuges, and confocal microscopes for tissue imaging.
- Cross-team standardization requires alignment between computational biologists and experimentalists on target selection criteria, gene symbols, and validation endpoints such as tumor phenotype scoring.
- Adaptation considerations include modifying gene targets, cancer types in database queries, and overexpression constructs while maintaining the core workflow of in silico prediction followed by in vivo/in vitro validation.
- Practical limitations include dependency on database annotation quality, potential species-specific differences in Notch signaling between Drosophila and humans, and the need for orthogonal validation in mammalian models to confirm translational relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Prediction of Clinical Outcomes from Genomic Profiles (PRECOG)
1:22
Cancer Science Institute of Singapore Database (CSIOVDB) and Gene Expression Across Normal and Tumor Tissue (GENT)
2:30
cBioPortal
3:30
Drosophila Dissection and Staining
7:23
Results: Representative Bioinformatic Approaches to Understanding the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer
8:42
Conclusion
