Name: Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj technikę laserowego wychwytywania mikrodysekcji do izolacji chrząstki i kości z zarodków myszy. Metoda z zastosowaniem barwienia krezyl fioletowym zapewnia wysoką jakość RNA do analizy transkryptomicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) oraz Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Autorzy dziękują Biorepository i Pathology Core za dostęp do platformy Leica LMD 6500 w Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

Tkanki od myszy zostały uzyskane zgodnie z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a protokoły badań zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Icahn School of Medicine na Górze Synaj.
1. Przygotowanie świeżo zamrożonej próbki
<ol>
	<li>Przeprowadź sekcję zarodka lub tkanki, która jest przedmiotem zainteresowania. Osadź próbkę w jednorazowej formie do zatapiania ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Dostosuj orientację próbki za pomocą końcówki lub igły.</li>
	<li>Szybko zamrozić próbki w kąpieli suchego lodu/metylo-2-butanu. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj w temperaturze -80 °C. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Kriosekcja do laserowego przechwytywania Mikrodysekcja
<ol>
	<li>Rozmrozić kriostat i oczyść powierzchnie wewnętrzne 70% etanolem. Potraktuj płytkę zabezpieczającą przed przewróceniem i parę kleszczyków środkiem odkażającym RNazy. Ustaw kriostat na żądaną temperaturę cięcia (-18 do -22 °C). Przygotuj pojemnik z pokrywką z suchym lodem, umieszczając arkusz folii aluminiowej na suchym lodzie w celu tymczasowego przechowywania pociętych szkiełek z próbkami podczas kriosekcji. 
	ostrożność: Suchy lód jest bardzo zimny. Zawsze ostrożnie obchodź się z suchym lodem i noś izolowane rękawice za każdym razem, gdy go dotykasz.</li>
	<li>Przenieś świeżo zamrożoną próbkę do wiadra z suchym lodem. Umieść warstwę związku OCT na uchwycie próbki kriostatu i natychmiast umieść próbkę na wierzchu OCT z delikatnym naciskiem. Gdy OCT jest całkowicie zamrożony, przymocuj uchwyt z próbką do ramienia tnącego kriostatu.</li>
	<li>Pozostawić próbkę w kriostacie na 15 minut, aby zrównoważyć się z temperaturą cięcia.</li>
	<li>Podzielić tkankę na sekcje i zebrać plastry na szkiełkach membranowych z naftalanu etylenu (PEN) o grubości 12 μm. Wyrównać kolejne sekcje na membranie. Po zakończeniu jednego szkiełka pozostaw sekcje do wyschnięcia na kilka minut i przenieś szkiełko na folię w pojemniku na suchy lód, aż wszystkie wymagane szkiełka zostaną zebrane.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C w pojemniku na szkiełka. 
	UWAGA: </mocna >Grubość przekroju jest dobierana tak, aby zmaksymalizować ilość pobranej tkanki, umożliwiając jednocześnie efektywne cięcie tkanki i może się różnić w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Szkiełka należy chronić przed zanieczyszczeniem RNazą. Unikaj zmian temperatury. Chociaż RIN RNA ze szkiełek przechowywanych do 6 miesięcy może nadal wskazywać na wysoką jakość RNA, zalecamy jak najszybsze użycie szkiełek.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki do mikrodysekcji laserowej
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory do barwienia i odwadniania.
	<ol>
		<li>Umieść 45 ml 80% etanolu w każdej z trzech probówek wirówkowych o pojemności 50 ml na lodzie. Oznacz je jako #1, #2 i #3. Rozcieńczyć etanol wodą wolną od RNaz/DNaz.</li>
		<li>Umieść 45 ml 95% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
		<li>Umieść 45 ml 100% etanolu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml na lodzie.</li>
		<li>Umieść 45 ml ksylenu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej. 
		ostrożność: Ksylen powinien być stosowany w dygestorium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić na krótko szkiełko z membraną PEN, przykładając je do dłoni w rękawiczce, a następnie umyć dwukrotnie przez 30 sekund w 45 ml 80% etanolu (#1 i #2) z mieszaniem w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml w celu usunięcia OCT. 
	nuta: Ważne jest, aby usunąć OCT przed barwieniem, aby zapobiec zasłanianiu skrawków przez OCT poluzowany podczas barwienia. Kleszcze mogą być używane w celu ułatwienia usuwania OCT, który nie jest zmywany przez mieszanie.</li>
	<li>Połóż szkiełko na arkuszu folii aluminiowej. Odpipetować 0,8 ml 0,1% fioletu krezylowego w 50% etanolu na szkiełko i barwić przez 30 s. Myć szkiełko w 45 ml 80% etanolu (#3) przez 30 s, a następnie odwadniać przez przejście przez 30 s przez 45 ml 95% etanolu, 100% etanolu i ksylenu w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Stojak przesuwa się na delikatnej wycieraczce zadaniowej przez 5 minut, aby opróżnić ksylen i suche sekcje. 
	nuta: Szkiełka muszą być całkowicie wysuszone przed LCM.</li>
</ol>
4. Mikrodysekcja przechwytywania laserowego
UWAGA: Noś bezpudrowe rękawice nitrylowe podczas wykonywania LCM.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop LCM, laser i komputer. Zaloguj się do komputera i uruchom oprogramowanie. Przekręć kluczyk do pozycji "On", aby uruchomić laser. Gdy świeci się zielone światło (Laser), naciśnij czerwony przycisk, aby aktywować laser, a następnie światło (Laser) zmieni kolor na czerwony, wskazując, że laser jest gotowy do użycia. 
	nuta: Laser potrzebuje około 10 minut na rozgrzanie.</li>
	<li>Ustaw probówki zbiorcze.
	<ol>
		<li>Włóż nakrętkę probówki z 0,5 ml polimerazy reakcji łańcuchowej (PCR) do kolektora. 
		nuta: Wybierz odpowiedni kolektor dla żądanych probówek PCR (0,2 lub 0,5 ml).</li>
		<li>Odpipetować 50 μl buforu ekstrakcyjnego (dostarczonego przez zestaw do izolacji RNA wymieniony w Tabeli Materiałów) do nasadki probówki zbiorczej o pojemności 0,5 ml.</li>
		<li>Włóż urządzenie zbierające do mikroskopu.</li>
		<li>W oknie Change Collector Device (Zmień urządzenie zbierające) kliknij przycisk Move to Reference Point (Przenieś do punktu odniesienia), aby przesunąć kolektor do punktu odniesienia (RP). Dostosuj ostrość, aby wyraźnie view RP. Kliknij strzałki, aby przesunąć RP do środka widoku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj szkiełka do próbek.
	<ol>
		<li>Kliknij lewy przycisk Rozładuj na pasku narzędzi, aby opuścić uchwyt suwaka.</li>
		<li>Umieść szkiełko w uchwycie, częścią tkanki skierowaną w dół. 
		nuta: Ta orientacja zapewnia, że wychwycone skrawki tkanek wpadają grawitacyjnie do nasadki probówki zbiorczej.</li>
		<li>Włóż uchwyt z powrotem do stolika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw parametry lasera.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję Sterowanie w menu Laser lub kliknij ikonę Laser.</li>
		<li>Dostosuj te parametry zgodnie z potrzebami: Moc, moc lasera; Przysłona, szerokość lasera; i Prędkość, prędkość cięcia w trybie rysowania i cięcia. 
		nuta: Przetestuj laser w obszarze nieinteresującym. Większa moc lub większa przysłona ułatwiają cięcie, ale powodują większe uszkodzenia komórek. Dostosuj kombinację mocy, przysłony i prędkości, aby uzyskać wydajne cięcie i minimalne uszkodzenie tkanki. Na przykład Moc = 40, Przysłona = 5 i Prędkość = 7 dla tkanki chrzęstnej na odcinku 12 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaznacz i wytnij obszary zainteresowania.
	<ol>
		<li>Zacznij od obiektywu 5x i znajdź obszary zainteresowania, a następnie przełącz się na obiektyw (5x, 10x lub 40x), który najlepiej pokazuje obszar zainteresowania. 
		nuta: Po barwieniu fioletem krezylowym chrząstki są barwione na kolor purpurowy, a zmineralizowane tkanki wydają się brązowe lub czarne, co odróżnia się od innych tkanek. Obrazy można zapisać za pomocą opcji Zapisz obraz jako z menu Plik.</li>
		<li>Wybierz tubę do odbioru (A, B, C, D), klikając znak na kolektorze.</li>
		<li>Wybierz opcję Przenieś i wytnij lub Rysuj i wytnij. W trybie Move and Cut próbka jest wycinana ręcznie, za pomocą myszy lub pióra na ekranie dotykowym do odręcznego rysowania kształtów. W trybie rysowania i wycinania kształty można rysować odręcznie za pomocą myszy lub pióra na ekranie dotykowym w celu późniejszego wycinania. Kliknij przycisk Rozpocznij cięcie, aby rozpocząć cięcie laserowe.</li>
		<li>Po zakończeniu cięcia tkanka docelowa z membraną PEN wpada grawitacyjnie do nasadki probówki zbiorczej. Powtórz czynności 4.5, aby w razie potrzeby połączyć wiele obszarów zainteresowania. 
		nuta: Powtarzanie cięć lub zwiększanie mocy lub apertury może być konieczne, jeśli tkanka nie wpadnie do nasadki probówki zbiorczej z powodu niepełnego cięcia. Zmineralizowana kość (brązowa lub) nie może być cięta bezpośrednio laserem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozładuj kolektor i ostrożnie zamknij probówkę do PCR. Umieść wypreparowane tkanki w suchym lodzie. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj w temperaturze -80 °C. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Powtórzyć czynności od 4.2 do 4.6 dla następnej próbki.</li>
</ol>
5. Liza mikrowypreparowanych tkanek i izolacja RNA
<ol>
	<li>Rozmrozić mikrowypreparowane tkanki w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze 42 °C.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować bufor do lizy do probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Przeprowadzić obróbkę DNazy i ekstrakcję RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

LCM umożliwia izolację wzbogaconych lub jednorodnych populacji komórek z heterogenicznych tkanek. Do jego zalet należy szybkie i precyzyjne przechwytywanie komórek w ich kontekście in vivo , podczas gdy do potencjalnych wad należy czasochłonność, koszty i ograniczenie koniecznością rozpoznawania przez użytkownika odrębnych subpopulacji w określonej próbce30. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat LCM chrząstki i kości embrionalnej myszy, podkreślając zastosowanie barwienia f...

Układ mięśniowo-szkieletowy to wieloskładnikowy układ złożony z mięśni, tkanki łącznej, ścięgien, więzadeł, chrząstki i kości, unerwiony przez nerwy i unaczyniony przez naczynia krwionośne1. Tkanki szkieletowe rozwijają się wraz ze wzrostem niejednorodności komórkowej i złożoności strukturalnej. Chrząstka i kość rozwijają się z tej samej linii osteochondroprogenitora i są silnie spokrewnione. Chrząstka i kość embrionalna rozwijają się w połączeniu z mięśniami, nerwami, naczyniami krwionośnymi i niezróżnicowaną mezenchymą. Chrząstka może być również otoczona kością, taką jak chrząstka Meckla i chrząstka kłykciowa w kości żuchwy. Tkanki te są anatomicznie powiązane i oddziałują ze sobą poprzez sygnały zewnątrzkomórkowe podczas rozwoju. W badaniach nad ekspresją genów w rozwoju chrząstki i kości jedną z przeszkód jest niejednorodność struktur szkieletowych złożonych z wielu typów tkanek. Precyzyjna izolacja konkretnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie dla udanej analizy transkrypcyjnej.
Mikrodysekcja laserowa (LCM) jest potężnym narzędziem do izolowania typów komórek lub obszarów zainteresowania w heterogenicznych tkankach, jest odtwarzalna i wrażliwa na poziom pojedynczej komórki2. Może precyzyjnie celować i przechwytywać interesujące komórki dla szerokiego zakresu dalszych testów w transkryptomice, genomice i proteomice3,4. Jakość wyizolowanego RNA, DNA lub białka można ocenić za pomocą bioanalizatora lub równoważnej platformy. Na przykład jakość RNA jest wskazywana przez numer integralności RNA (RIN)5.
Tutaj udostępniamy protokół szybkiego barwienia i izolacji chrząstki i kości za pomocą LCM ze świeżo zamrożonych tkanek. Używamy zarodka myszy, aby wykazać, że ten protokół daje wysokiej jakości RNA do późniejszej analizy transkryptomicznej, takiej jak sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA).

<table><tbody><tr><td>2-metylobutan</td><td>Bioanalizator ThermoFisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa</td><td></td><td>Agilent</td> G2939BA <td>ThermoFisher Scientific 339653 Stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu, 50 ml</td></tr><tr><td>octan fioletu krezylowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Kriostat Leica Biosystems CM3050 S <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Delikatna wycieraczka zadaniowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa forma do zatapiania</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1220</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td> Etanol <td>wolny od DNaz/RNaz</td></tr><tr><td>, absolutny (200 proof)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818</td><td>Klasa biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Szklana szkiełko</td> <td>membranowe PENSystem LCM 11505158</td><td></td><td></td>Leica</tr><tr><td></td><td>Microsystems Leica Microsystems</td><td>Szkło</td> pokrywy mikroskopu Leica LMD6500 <td></td></tr> Szkiełka mikroskopowe <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-545FP</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>OCT Mikroskopia</td><td>elektronowa Sciences</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do PCR z płaską nasadką, 0,5 ml</td><td>Probówki zbiorcze</td> <td>Axygen</td><td>PCR-05-C</td> LCM</tr><tr><td>Stałe medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td> Zestaw do izolacji RNA <td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Środek do dekontaminacji RNazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td>Środek odkażający RNaza do czyszczenia powierzchni</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr></tbody></table>

laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Mikrodysekcja laserowa (LCM) to potężne narzędzie do izolowania określonych typów komórek lub obszarów zainteresowania z heterogenicznych tkanek. Złożoność komórkowa i molekularna elementów szkieletowych wzrasta wraz z rozwojem. Niejednorodność tkanek, na przykład na granicy elementów chrzęstnych i kostnych ze sobą lub z otaczającymi tkankami, jest jedną z przeszkód w badaniu rozwoju chrząstki i kości. Nasz protokół zapewnia szybką metodę przetwarzania tkanek i izolacji chrząstki i kości, która daje wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów. Świeżo zamrożone tkanki zarodków myszy są cięte na sekcje, a krótkie barwienie fioletem krezylowym służy do wizualizacji chrząstki i kości o kolorach różniących się od otaczających tkanek. Szkiełka są następnie szybko odwadniane, a następnie chrząstki i kości są izolowane za pomocą LCM. Minimalizacja ekspozycji na roztwory wodne podczas tego procesu pozwala zachować integralność RNA. Chrząstka i kość żuchwy myszy Meckel w E16,5 zostały pomyślnie pobrane, a analiza ekspresji genów wykazała zróżnicowaną ekspresję genów markerowych dla osteoblastów, osteocytów, osteoklastów i chondrocytów. Wyizolowano również wysokiej jakości RNA z różnych tkanek i w różnym wieku embrionalnym. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie próbki do LCM, w tym krioemnację, cięcie, barwienie i odwadnianie świeżo zamrożonych tkanek oraz precyzyjną izolację chrząstki i kości za pomocą LCM, co skutkuje wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Przekroje wieńcowe świeżo zamrożonych tkanek mysich w stadium E16.5 zostały wykorzystane do zademonstrowania izolacji i pobierania chrząstki Mecla (MC), chrząstki kłykciowej oraz kości żuchwy za pomocą LCM. Zarodki mysie w stadium E16.5 wypreparowano i zatopiono w formach kriogenicznych z użyciem związku OCT. Próbki w formach zamrożono szybko w kąpieli z suchego lodu i metylo-2-butanu, a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C.
Aby zademonstrować barwienie chrząstki i kości fioletem krez...

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Niejednorodność struktur szkieletowych jest jedną z przeszkód w badaniu ekspresji genów w rozwoju chrząstki i kości. Protokół ten zapewnia metodę precyzyjnej izolacji sąsiednich, ale różnych tkanek. Optymalizujemy mikrodysekcję chrząstki i kości wychwytu laserowego za pomocą barwienia fioletem krezylowym, aby uwidocznić te tkanki w celu precyzyjnego pobrania, zachowując wysoką integralność RNA do późniejszej analizy.Inne tkanki można wyizolować, jeśli fiolet krezylowy zapewnia wystarczające rozróżnienie tkanki docelowej, a jakość RNA pozostaje wysoka po naszej metodzie przetwarzania. Do takich tkanek należą szwy twarzoczaszki i mózgu. Kriosekcja jest najbardziej wymagającą umiejętnością w tym protokole.Upewnij się, że tkanka jest szybko preparowana i osadzona, aby zachować najwyższą integralność RNA. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciąć zarodek lub tkankę, która Cię interesuje. Osadź próbkę w jednorazowej formie do zatapiania ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia i dostosuj orientację próbki za pomocą końcówki lub igły.Szybko zamrozić próbki w kąpieli suchego lodu i metylo-2-butenu. Następnie przygotuj pojemnik z pokrywką z suchym lodem, umieszczając arkusz folii aluminiowej na suchym lodzie w celu tymczasowego przechowywania szkiełek do pobierania próbek podczas kriosekcji. Przenieś świeżo zamrożoną próbkę do wiadra z suchym lodem.Umieść warstwę związku o optymalnej temperaturze cięcia na uchwycie próbki kriostatu i natychmiast umieść próbkę na wierzchu środka o optymalnej temperaturze cięcia, delikatnie dociskając. Gdy związek o optymalnej temperaturze cięcia jest całkowicie zamrożony, przymocuj uchwyt z próbką do ramienia tnącego kriostatu. Pozostawić próbkę w kriostacie na 15 minut, aby zrównoważyć ją do temperatury cięcia.Następnie należy przeciąć tkankę na grubość 12 mikrometrów i zebrać plastry na szkiełkach z membraną PEN. Wyrównaj kolejne sekcje na membranie. Po zakończeniu szkiełka pozostaw sekcje do wyschnięcia na kilka minut, a następnie przenieś szkiełko na folię w pojemniku na suchy lód, aż wszystkie wymagane szkiełka zostaną zebrane.Przechowuj szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w pudełku na slajdy. Na początek przygotuj trzy oznakowane 15-mililitrowe probówki wirówkowe. Dodaj 45 mililitrów 80% etanolu do każdej tubki.Umieść trzy rurki na lodzie. Umieść probówkę zawierającą 45 mililitrów 95% etanolu i probówkę zawierającą 100% etanolu na lodzie. Następnie dodaj 45 mililitrów ksylenu do 50-mililitrowej probówki wirówkowej w temperaturze pokojowej.Rozmrozić na krótko szkiełko z membraną PEN, przykładając je do dłoni w rękawiczce, a następnie umyć je dwukrotnie przez 30 sekund w każdej z probówek zawierających 80% etanolu z mieszaniem, aby usunąć związek o optymalnej temperaturze cięcia. Następnie połóż szkiełko na arkuszu folii aluminiowej. Odpipetować 8 mililitrów 1% fioletu krezylowego i 50% etanolu na szkiełko i barwić przez 30 sekund.Myj szkiełko w trzeciej probówce zawierającej 80% etanolu przez 30 sekund. Odwodnić szkiełko, przepuszczając je przez probówkę zawierającą 95% etanolu przez 30 sekund, probówkę zawierającą 100% etanol przez 30 sekund, a na koniec probówkę zawierającą ksylen przez 30 sekund. Następnie umieść szkiełka na delikatnej wycieraczce roboczej na pięć minut, aby ksylen spłynął i pozostawił sekcje do wyschnięcia.Najpierw włącz mikroskop mikrodyparacyjny przechwytywania laserowego, laser i komputer. Zaloguj się do komputera i uruchom oprogramowanie. Gdy świeci się zielone światło, naciśnij czerwony przycisk, aby aktywować laser.Gdy światło zmieni kolor na czerwony, laser jest gotowy do użycia. Włóż nakrętkę 5-mililitrowej probówki PCR do kolektora. Odpipetować 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do nasadki i włożyć urządzenie zbierające do mikroskopu.W oknie urządzenia kolektora zmian kliknij przycisk przenieś do punktu odniesienia, aby przesunąć kolektor do punktu odniesienia. Dostosuj ostrość, aby wyraźnie view punkt odniesienia. Następnie kliknij lewy przycisk rozładowywania na pasku narzędzi, aby opuścić uchwyt suwaka.Umieść szkiełko w uchwycie z częścią tkanki skierowaną w dół i włóż uchwyt z powrotem do stolika. Kliknij przycisk Kontynuuj w oknie zmiany próbki. Aby ustawić parametry lasera, wybierz opcję sterowania w menu lasera lub kliknij ikonę lasera.Dostosuj następujące parametry zgodnie z potrzebami: moc, która jest mocą lasera, apertura, czyli szerokość lasera oraz prędkość, czyli prędkość cięcia w trybie rysowania i cięcia. Zacznij od celu 5X, aby znaleźć obszary zainteresowania, i przełącz się na cel, który najlepiej pokazuje obszar zainteresowania. Wybierz tubę do pobrania, klikając znacznik przy kolektorze, a następnie wybierz opcję Przenieś i wytnij lub Narysuj i wytnij.Po zakończeniu cięcia tkanka docelowa z membraną PEN wpadnie grawitacyjnie do nasadki rurki zbiorczej. Powtórz ten proces zaznaczania i cięcia, aby w razie potrzeby wyciągnąć wiele obszarów zainteresowania. Następnie rozładuj kolektor i ostrożnie zamknij probówkę PCR.Umieść wypreparowane tkanki na suchym lodzie. Rozmrozić mikrowypreparowane tkanki w temperaturze pokojowej, następnie krótko odwirować i inkubować próbki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwiruj bufor do lizy w dół do 5-mililitrowej probówki PCR.Wykonaj obróbkę DNazy i ekstrakcję RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. W tym badaniu przeprowadza się zoptymalizowaną mikrodysekcję chrząstki i kości wychwytu laserowego, podkreślając zastosowanie barwienia fioletem krezylu w szybkiej procedurze w celu wizualizacji chrząstki i kości w celu precyzyjnego pobrania tkanek przy zachowaniu wysokiej integralności RNA do późniejszej analizy. Z obserwacji preparatów wynika, że wszystkie badane chrząstki są zabarwione na kolor purpurowy, a wszystkie zmineralizowane tkanki są zabarwione na brązowo lub czarno.Zarówno chrząstka, jak i kość są łatwe do odróżnienia od innych tkanek w wielu miejscach anatomicznych. Chrząstka Meckla, chrząstka kłykciowa i obszary kości żuchwy są wybierane i izolowane za pomocą mikrodysekcji laserowej. Aby uzyskać wystarczającą ilość RNA do sekwencjonowania, należy pobrać 10 regionów chrząstki Meckela, 10 regionów chrząstki kłykciowej lub cztery obszary kości żuchwy odpowiednio do trzech pojedynczych probówek zbiorczych.RNA jest następnie ekstrahowane, a całkowite RNA jest analizowane za pomocą bioanalizatora. Ten protokół mikrodysekcji laserowej jest stosowany na różnych tkankach na różnych etapach rozwoju, a pomiary liczby integralności RNA wskazują na wysoką jakość RNA. Następnie przeprowadzana jest różnicowa analiza ekspresji genów.Istnieje 4 006 genów o istotnej i różnej ekspresji między kością żuchwy a chrząstką Meckla. Geny specyficzne dla osteoblastów lub osteocytów są bardziej eksprymowane w kości żuchwy, podczas gdy geny specyficzne dla chondrocytów są bardziej wyrażane w chrząstce Meckela. Ponadto markery osteoklastów są silniej eksprymowane w kości żuchwy, co wskazuje na pomyślną izolację docelowych tkanek.Po tej procedurze można przeprowadzić analizę ekspresji genów, w tym qPCR i sekwencjonowanie RNA. Metody te mogą analizować ekspresję genów transkryptomu w określonych tkankach lub regionach zainteresowania w tkankach heterogenicznych.

laser-capture-microdissection-mouse-embryonic-cartilage-bone-for-gene

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Profilowanie ekspresji RNA w oddzielnych regionach mózgu myszy wymaga precyzyjnej i powtarzalnej strategii pobierania tkanek. W niniejszym opracowaniu opisano protokół wykorzystujący zarówno sekcjonowanie mózgu w płaszczyźnie czołowej, jak i mikrodysekcję wspomaganą wycinakiem do tkanek. Wydajność i jakość całkowitego RNA uzyskanego z otrzymanych próbek potwierdzają użyteczność przedstawionej metody.

Metoda mikroskopii bez użycia laserowej mikrodysekcji do mikrodysekcji dyskretnych obszarów mózgu myszy w celu izolacji całkowitego RNA oraz późniejszego sekwencjonowania następnej generacji i profilowania ekspresji genów

Opisujemy, jak korzystać z mikrodysekcji laserowej (LCM) w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów hipokampa lub pojedynczych neuronów z zamrożonych fragmentów uszkodzonego mózgu szczura do późniejszej analizy ekspresji genów przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i/lub mikromacierzy całego genomu.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji wzbogaconych populacji neuronów lub pojedynczych neuronów do analizy ekspresji genów po urazowym uszkodzeniu mózgu

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Protokół mikrodysekcji laserowej (LCM) został opracowany w celu uzyskania wystarczającej ilości wysokiej jakości RNA do analizy ekspresji genów w komórkach kostnych. Obecne badanie koncentruje się na mysich odcinkach kości udowej. Jednak opisany tutaj protokół LCM może być wykorzystany do badania ekspresji genów w komórkach dowolnej tkanki twardej.

Protokół mikrodysekcji z wychwytem laserowym, który zapewnia wysokiej jakości RNA ze świeżo zamrożonych kości myszy

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

Poznaj technikę laserowego wychwytywania mikrodysekcji do izolacji chrząstki i kości z zarodków myszy. Metoda z zastosowaniem barwienia krezyl fioletowym zapewnia wysoką jakość RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów