Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Niejednorodność struktur szkieletowych jest jedną z przeszkód w badaniu ekspresji genów w rozwoju chrząstki i kości. Protokół ten zapewnia metodę precyzyjnej izolacji sąsiednich, ale różnych tkanek. Optymalizujemy mikrodysekcję chrząstki i kości wychwytu laserowego za pomocą barwienia fioletem krezylowym, aby uwidocznić te tkanki w celu precyzyjnego pobrania, zachowując wysoką integralność RNA do późniejszej analizy.

Inne tkanki można wyizolować, jeśli fiolet krezylowy zapewnia wystarczające rozróżnienie tkanki docelowej, a jakość RNA pozostaje wysoka po naszej metodzie przetwarzania. Do takich tkanek należą szwy twarzoczaszki i mózgu. Kriosekcja jest najbardziej wymagającą umiejętnością w tym protokole.

Upewnij się, że tkanka jest szybko preparowana i osadzona, aby zachować najwyższą integralność RNA. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyciąć zarodek lub tkankę, która Cię interesuje. Osadź próbkę w jednorazowej formie do zatapiania ze związkiem o optymalnej temperaturze cięcia i dostosuj orientację próbki za pomocą końcówki lub igły.

Szybko zamrozić próbki w kąpieli suchego lodu i metylo-2-butenu. Następnie przygotuj pojemnik z pokrywką z suchym lodem, umieszczając arkusz folii aluminiowej na suchym lodzie w celu tymczasowego przechowywania szkiełek do pobierania próbek podczas kriosekcji. Przenieś świeżo zamrożoną próbkę do wiadra z suchym lodem.

Umieść warstwę związku o optymalnej temperaturze cięcia na uchwycie próbki kriostatu i natychmiast umieść próbkę na wierzchu środka o optymalnej temperaturze cięcia, delikatnie dociskając. Gdy związek o optymalnej temperaturze cięcia jest całkowicie zamrożony, przymocuj uchwyt z próbką do ramienia tnącego kriostatu. Pozostawić próbkę w kriostacie na 15 minut, aby zrównoważyć ją do temperatury cięcia.

Następnie należy przeciąć tkankę na grubość 12 mikrometrów i zebrać plastry na szkiełkach z membraną PEN. Wyrównaj kolejne sekcje na membranie. Po zakończeniu szkiełka pozostaw sekcje do wyschnięcia na kilka minut, a następnie przenieś szkiełko na folię w pojemniku na suchy lód, aż wszystkie wymagane szkiełka zostaną zebrane.

Przechowuj szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w pudełku na slajdy. Na początek przygotuj trzy oznakowane 15-mililitrowe probówki wirówkowe. Dodaj 45 mililitrów 80% etanolu do każdej tubki.

Umieść trzy rurki na lodzie. Umieść probówkę zawierającą 45 mililitrów 95% etanolu i probówkę zawierającą 100% etanolu na lodzie. Następnie dodaj 45 mililitrów ksylenu do 50-mililitrowej probówki wirówkowej w temperaturze pokojowej.

Rozmrozić na krótko szkiełko z membraną PEN, przykładając je do dłoni w rękawiczce, a następnie umyć je dwukrotnie przez 30 sekund w każdej z probówek zawierających 80% etanolu z mieszaniem, aby usunąć związek o optymalnej temperaturze cięcia. Następnie połóż szkiełko na arkuszu folii aluminiowej. Odpipetować 8 mililitrów 1% fioletu krezylowego i 50% etanolu na szkiełko i barwić przez 30 sekund.

Myj szkiełko w trzeciej probówce zawierającej 80% etanolu przez 30 sekund. Odwodnić szkiełko, przepuszczając je przez probówkę zawierającą 95% etanolu przez 30 sekund, probówkę zawierającą 100% etanol przez 30 sekund, a na koniec probówkę zawierającą ksylen przez 30 sekund. Następnie umieść szkiełka na delikatnej wycieraczce roboczej na pięć minut, aby ksylen spłynął i pozostawił sekcje do wyschnięcia.

Najpierw włącz mikroskop mikrodyparacyjny przechwytywania laserowego, laser i komputer. Zaloguj się do komputera i uruchom oprogramowanie. Gdy świeci się zielone światło, naciśnij czerwony przycisk, aby aktywować laser.

Gdy światło zmieni kolor na czerwony, laser jest gotowy do użycia. Włóż nakrętkę 5-mililitrowej probówki PCR do kolektora. Odpipetować 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do nasadki i włożyć urządzenie zbierające do mikroskopu.

W oknie urządzenia kolektora zmian kliknij przycisk przenieś do punktu odniesienia, aby przesunąć kolektor do punktu odniesienia. Dostosuj ostrość, aby wyraźnie view punkt odniesienia. Następnie kliknij lewy przycisk rozładowywania na pasku narzędzi, aby opuścić uchwyt suwaka.

Umieść szkiełko w uchwycie z częścią tkanki skierowaną w dół i włóż uchwyt z powrotem do stolika. Kliknij przycisk Kontynuuj w oknie zmiany próbki. Aby ustawić parametry lasera, wybierz opcję sterowania w menu lasera lub kliknij ikonę lasera.

Dostosuj następujące parametry zgodnie z potrzebami: moc, która jest mocą lasera, apertura, czyli szerokość lasera oraz prędkość, czyli prędkość cięcia w trybie rysowania i cięcia. Zacznij od celu 5X, aby znaleźć obszary zainteresowania, i przełącz się na cel, który najlepiej pokazuje obszar zainteresowania. Wybierz tubę do pobrania, klikając znacznik przy kolektorze, a następnie wybierz opcję Przenieś i wytnij lub Narysuj i wytnij.

Po zakończeniu cięcia tkanka docelowa z membraną PEN wpadnie grawitacyjnie do nasadki rurki zbiorczej. Powtórz ten proces zaznaczania i cięcia, aby w razie potrzeby wyciągnąć wiele obszarów zainteresowania. Następnie rozładuj kolektor i ostrożnie zamknij probówkę PCR.

Umieść wypreparowane tkanki na suchym lodzie. Rozmrozić mikrowypreparowane tkanki w temperaturze pokojowej, następnie krótko odwirować i inkubować próbki w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwiruj bufor do lizy w dół do 5-mililitrowej probówki PCR.

Wykonaj obróbkę DNazy i ekstrakcję RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. W tym badaniu przeprowadza się zoptymalizowaną mikrodysekcję chrząstki i kości wychwytu laserowego, podkreślając zastosowanie barwienia fioletem krezylu w szybkiej procedurze w celu wizualizacji chrząstki i kości w celu precyzyjnego pobrania tkanek przy zachowaniu wysokiej integralności RNA do późniejszej analizy. Z obserwacji preparatów wynika, że wszystkie badane chrząstki są zabarwione na kolor purpurowy, a wszystkie zmineralizowane tkanki są zabarwione na brązowo lub czarno.

Zarówno chrząstka, jak i kość są łatwe do odróżnienia od innych tkanek w wielu miejscach anatomicznych. Chrząstka Meckla, chrząstka kłykciowa i obszary kości żuchwy są wybierane i izolowane za pomocą mikrodysekcji laserowej. Aby uzyskać wystarczającą ilość RNA do sekwencjonowania, należy pobrać 10 regionów chrząstki Meckela, 10 regionów chrząstki kłykciowej lub cztery obszary kości żuchwy odpowiednio do trzech pojedynczych probówek zbiorczych.

RNA jest następnie ekstrahowane, a całkowite RNA jest analizowane za pomocą bioanalizatora. Ten protokół mikrodysekcji laserowej jest stosowany na różnych tkankach na różnych etapach rozwoju, a pomiary liczby integralności RNA wskazują na wysoką jakość RNA. Następnie przeprowadzana jest różnicowa analiza ekspresji genów.

Istnieje 4 006 genów o istotnej i różnej ekspresji między kością żuchwy a chrząstką Meckla. Geny specyficzne dla osteoblastów lub osteocytów są bardziej eksprymowane w kości żuchwy, podczas gdy geny specyficzne dla chondrocytów są bardziej wyrażane w chrząstce Meckela. Ponadto markery osteoklastów są silniej eksprymowane w kości żuchwy, co wskazuje na pomyślną izolację docelowych tkanek.

Po tej procedurze można przeprowadzić analizę ekspresji genów, w tym qPCR i sekwencjonowanie RNA. Metody te mogą analizować ekspresję genów transkryptomu w określonych tkankach lub regionach zainteresowania w tkankach heterogenicznych.