Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Protokół ten ułatwia izolację i odtwarzalną długoterminową hodowlę hepatocytów myszy w środowisku kanapkowym 3D kolagenu w celu zbadania tworzenia struktury kanonicznej i jej odpowiedzi na leczenie in vitro. Po opanowaniu techniki jest to szybka metoda uzyskiwania dużych ilości wysoce żywotnej i czystej populacji hepatocytów myszy do badań in vitro. Procedurę zademonstruje Lenka Sarnova, technik z naszego laboratorium.

Dzień przed pierwotną izolacją hepatocytów dodaj 100 mikrolitrów 10X DMEM, 485 mikrolitrów wody destylowanej i 15 mikrolitrów jednego molowego wodorotlenku sodu w 500 mikrolitrach do kolagenu szczurzego ogona. Sprawdź pH zneutralizowanego kolagenu. Powinno to być około 7,5.

Używając wstępnie schłodzonej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, rozprowadź 100 mikrolitrów zneutralizowanego roztworu kolagenu na każdej z plastikowych naczyń hodowlanych o średnicy 3,5 centymetra na lodzie i umieść szalki w standardowych warunkach hodowli na noc. Następnego ranka nawodnij warstwy kolagenu jednym mililitrem PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza na naczynie przez co najmniej trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby odizolować wątrobę, po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca u nogi, umieść znieczuloną mysz na macie preparacyjnej w pozycji leżącej na plecach i przyklej dolną i górną kończynę do maty.

Przetrzyj brzuch 70% etanolem i wykonaj nacięcie w kształcie litery V od okolicy łonowej do każdej kończyny przedniej. Zawiń skórę na klatce piersiowej, aby odsłonić jamę brzuszną i umieść matę pod mikroskopem preparacyjnym. Przesuń jelito cienkie i okrężnicę w kierunku ogonowym, aby odsłonić IVC i załaduj dwumililitrową strzykawkę 2,5 mililitra roztworu C o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podłącz strzykawkę do kaniuli i użyj bawełnianego wacika nasączonego PBS, aby docisnąć wątrobę do przepony.

Umieść nasączony szew wokół IVC tuż pod wątrobą. Następnie za pomocą strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 wygiętą pod kątem 45 stopni, wstrzyknij 10 mikrolitrów po 5 000 jednostek na mililitr heparyny do żyły wrotnej. Aby kanniulować wątrobę, użyj nożyczek mikrochirurgicznych, aby wykonać małe nacięcie w IVC bezpośrednio obok wątroby i wprowadzić kaniulę do nacięcia.

Zabezpiecz kaniulę na miejscu za pomocą szwów i dwóch węzłów chirurgicznych i przetnij żyłę wrotną, aby umożliwić odpływ perfuzyjnych z wątroby. Następnie powoli wciskać tłok strzykawki, aby przetworzyć wątrobę dwoma mililitrami roztworu przez okres około 15 sekund. Po dostarczeniu całego roztworu należy wstępnie napełnić pompę perystaltyczną świeżym roztworem C o temperaturze 37 stopni Celsjusza i sprawdzić aparat perfuzyjny, aby upewnić się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.

Ostrożnie odłączyć kaniulę od strzykawki i szybko, ale ostrożnie podłączyć rurkę pracującej pompy perystaltycznej do kaniuli. Natychmiast rozpocznij perfuzję przy natężeniu przepływu 2,5 mililitra na minutę. Po dwóch minutach przejdź do roztworu D i kontynuuj perfuzję przez dodatkowe 10 minut.

Pod koniec perfuzji ostrożnie zbierz wątrobę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej 20 mililitrów roztworu o temperaturze 37 stopni Celsjusza E.To wyizoluj pierwotne hepatocyty, trzymając wątrobę za kaniulę, pocieraj tkankę wokół ścianki rurki, aby wbić hepatocyty do buforu. Gdy cała tkanka zostanie zmiażdżona, przenieś zawiesinę tkanki do nylonowego sitka o porach 70 mikrometrów, aby przefiltrować izolowane komórki do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Osadzaj komórki wątroby przez wirowanie i ponownie zawieś osad w 20 mililitrach 40% Percoll w DMEM.

Oddziel żywe i martwe komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 20 mililitrach roztworu E. Po ponownym odwirowaniu komórek, ponownie zawieś osad w 10 mililitrach świeżego roztworu E do liczenia. Po zliczeniu dostosuj liczbę pierwotnych hepatocytów do 3,75 razy 10 do pięciu żywotnych komórek na mililitr pożywki do hodowli hepatocytów. Aby wyhodować izolowane pierwotne hepatocyty w kanapkach z kolagenem 3D, użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby równomiernie rozprowadzić dwa mililitry komórek na każdym pokrytym kolagenem naczyniu o średnicy 3,5 centymetra.

Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy godziny. Podczas inkubacji przygotuj 100 mikrolitrów zneutralizowanego kolagenu ze szczurzego ogona, po jednym roztworze na naczynie, jak pokazano. Pod koniec inkubacji ostrożnie zastąp pożywkę i nieprzyłączone komórki 100 mikrolitrami zneutralizowanego kolagenu na miskę i włóż płytki z powrotem do inkubatora kultur komórkowych na godzinę.

Gdy kolagen stężeje, ostrożnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki do hodowli hepatocytów do każdego naczynia i włóż kultury do inkubatora na trzy do ośmiu dni, codziennie sprawdzając kultury pod mikroskopem. W celu znakowania immunologicznego pierwotnych hepatocytów w kanapkach z kolagenem 3D, dokładnie umyj każdą kanapkę PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i utrwal kultury jednym mililitrem 4% paraformaldehydu w PBS na naczynie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec utrwalania umyj naczynia trzy razy przez 10 minut w dwóch mililitrach PBS uzupełnionych 0,1%Tween 20 na mycie.

Po ostatnim praniu przepuszczaj komórki jednym mililitrem 0,1 molowej glicyny i 0,2% Triton X-100 w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie trzy płukania w PBS plus Tween 20, jak właśnie pokazano. Następnie użyj końcówki o pojemności 10 mikrolitrów podłączonej do próżni, aby delikatnie naruszyć górną warstwę kolagenu i zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania jednym mililitrem 5% albuminy surowicy bydlęcej w PBS Tween przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji dodaj do każdej płytki pierwszorzędowe przeciwciała rozcieńczone w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka umyj naczynia trzema 15-minutowymi myciami w PBS Tween, a następnie znakuj odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Pod koniec inkubacji przemyć kultury dwa razy PBS Tween i jeden raz wodą destylowaną, jak pokazano przed zamontowaniem naczynia z pożywką do mocowania zapobiegającą blaknięciu do mikroskopii. W ciągu jednego dnia od wysiewu w kanapkach z kolagenem 3D, pierwotne hepatocyty myszy utworzyły klastry i samoorganizowały się w mniej więcej regularną sieć kanałów żółciowych.

W ciągu trzech do sześciu dni zwykle obserwuje się skupiska od pięciu do 10 komórek z w pełni spolaryzowanymi hepatocytami tworzącymi sieć kanałową. Leczenie toksyną lub lekami zmieniającymi cytoszkielet powoduje zmiany w szerokości, kształcie i liczbie cytoszkieletu hepatocytów i kanalików żółciowych. Chociaż leczenie etanolem wykazuje tylko łagodny wpływ na organizację keratyny 8, zwiększa krętość i rozkład szerokości kanałów żółciowych.

Intensywność sygnału barwienia ZO-1 jest zmniejszona w kanalikach żółciowych traktowanych etanolem w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, co sugeruje utratę połączeń typu po leczeniu etanolem. Hamowanie kurczliwości aktomiozyny przez Blebbistatynę indukuje tworzenie nieuporządkowanych, grubych, zaokrąglonych kanałów żółciowych. Dodatkowo leczenie kwasem okadaikowym hamuje fosfatazy, silnie wpływając na właściwości fizyczne keratyny i powodując powstawanie kanalików żółciowych, które są znacznie zwężone w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną.

Co więcej, leczenie etanolem znacznie podnosi poziom aminotransferaz alaninowych i asparaginianowych, co sugeruje poważne uszkodzenie komórek wątrobowych, podczas gdy leczenie blebbistatyną nie prowadzi do żadnych zmian w poziomach aminotransferaz, a leczenie kwasem okadaic wywołuje łagodne zmiany biochemiczne w aminotransferazie alaniny, ale nie zmienia ekspresji aminotransferazy asparaginianowej. Ważne jest, aby pracować stosunkowo szybko podczas kaniulacji i na początku perfuzji oraz unikać przedostawania się pęcherzyków do systemu perfuzyjnego. Lizaty komórkowe można zbierać w zduplikowanych studzienkach dla białek będących przedmiotem zainteresowania w celu określenia, czy podczas leczenia zachodzą zmiany w ekspresji białek i/lub etapach aktywacji.