Name: Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżyciową mięśnia Cremaster u myszy do badania nacieków leukocytów w zapaleniu i sepsie. Ta metoda umożliwia wizualizację interakcji leukocytów z śródbłonkiem in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (BMBF) 01GL1746E jako część konsorcjum PRIMAL. Autorzy dziękują Brittie Heckmann i Silvii Pezer za umiejętną pomoc techniczną.

Zwierzęta były utrzymywane w kontrolowanych warunkach, wolnych od specyficznych patogenów, w IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung) w Heidelbergu. Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez lokalną komisję IRB oraz Regierungspraesidium Karlsruhe, Badenia-Wirtembergia, Niemcy.
1. Podanie znieczulenia
<ol>
	<li>Zanurz mysz w narkozie poprzez dostrykalny (i.p.) bolusowy wtrysk 125 mg/kg ketaminy i 12,5 mg/kg ksylazyny.</li>
	<li>Umieść i unieruchom mysz w pozycji grzbietowej na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia (36,5-38 °C). Użyj niewchłonnialnej sterylnej nici chirurgicznej (6/0), aby zawiązać prostą pętlę wokół zębów przednich, a końce nici przyklej taśmą do podkładki grzewczej. Taka stabilizacja ma na celu utrzymanie otwartego pyska, aby uniknąć zaburzeń oddychania.</li>
	<li>Sprawdź głębokość znieczulenia myszy poprzez ucisk przestrzeni między palcami łapy (nie powinno wystąpić wycofanie).</li>
	<li>Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia przystąp do przygotowania chirurgicznego. Powtarzaj kontrolę znieczulenia co 30 min w trakcie trwania eksperymentu. W razie potrzeby podaj leki ponownie zgodnie z opisem powyżej.</li>
	<li>Nasyć fizjologiczny roztwór soli (PSS, skład: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) mieszaniną 5% CO2/95% N2 przez 15 minut. Przez cały czas trwania eksperymentu stale przepuszczaj 5% CO2/95% N2 przez PSS i utrzymuj temperaturę 37 °C.</li>
</ol>
2. Chirurgiczne przygotowanie tchawicy i tętnicy szyjnej (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Wypreparuj skórę z okolic szyi, delikatnie odciągając ją pęsetą w linii środkowej. Użyj nożyczek, aby wykonać cięcie okrężne o średnicy 1-2 cm, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń do przygotowania chirurgicznego.</li>
	<li>Starannie wypreparuj otaczające mięśnie, tkankę tłuszczową i tkankę łączną za pomocą pęsety.</li>
	<li>Wykonaj cięcie poprzeczne (~ 1,3 mm) w tchawicy za pomocą małych nożyczek chirurgicznych i wprowadź rurkę polietylenową (I.D x O.D. 0.034" x 0.050") do końcowego odcinka tchawicy, aby zabezpieczyć górne drogi oddechowe.</li>
	<li>Zabeziecz rurkę znajdującą się w tchawicy za pomocą pojedynczego szwu węzłem okrężnym (6/0 USP).</li>
	<li>Zlokalizuj tętnicę szyjną wzdłuż prawej strony tchawicy i wypreparuj otaczającą tkankę ze ściany tętnicy szyjnej. Alternatywnie, do dostępu dożylnego (i.v.) można wykorzystać żyłę szyjną lub żyłę ogonową. Staraj się uniknąć uszkodzenia nerwu błędnego, ponieważ znajduje się on w bliskim sąsiedztwie.</li>
	<li>Przełóż dwa fragmenty nici chirurgicznej (6/0) pod tętnicę szyjną. Pierwszy szew proksymalny umieść po stronie kranialnej, blisko rozwidlenia tętnic szyjnych i zawiąż go na stałe. Drugi szew zostanie umieszczony około 5-8 mm dystalnie od pierwszego i zostanie później wykorzystany do zabezpieczenia rurki w tętnicy szyjnej. Nie zawiązuj go jeszcze.</li>
	<li>Przygotuj rurkę polietylenową (I.D x O.D. 0.01" x 0.024") o długości 30 cm, przytwierdzając jej końcową część do igły strzykawki o objętości 1 mL wypełnionej solą fizjologiczną (0,9% NaCl). Dokładne przepłukanie jest istotne, aby zapobiec embolii powietrznej podczas przygotowania.</li>
	<li>Użyj zacisku naczyniowego 7 mm, aby zacisnąć tętnicę szyjną dystalnie od drugiego szwu.</li>
	<li>Wykonaj niewielkie cięcie poprzeczne (~0,5 mm) w tętnicy szyjnej i wprowadź sterylną rurkę polietylenową. Zabeziecz rurkę w tętnicy, używając drugiego szwu przygotowanego wcześniej.</li>
	<li>Zdejmij zacisk naczyniowy i delikatnie wywrzyj niewielki nacisk za pomocą strzykawki podłączonej do rurki polietylenowej. Ten cewnik tętnicy szyjnej może teraz służyć do podawania leków lub pobierania próbek krwi w razie potrzeby; możliwe jest również monitorowanie ciśnienia krwi lub tętna przy użyciu odpowiednich urządzeń.</li>
</ol>
3. Chirurgiczne przygotowanie mięśnia kremaster
<ol>
	<li>Przenieś mysz na podkładce grzewczej (wraz z podkładką) do specjalnie wykonanej plastikowej ramy utrzymującej stolik do późniejszej mikroskopii. Ustaw mysz tak, aby moszna była skierowana w stronę stolika mikroskopu.
	<ol>
		<li>Przed kontynuacją ponownie oceń głębokość znieczulenia; w razie potrzeby podaj od jednej czwartej do połowy dawki środka znieczulającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlokalizuj mosznę, chwyć ją pęsetą w najbardziej dystalnej części, delikatnie odciągnij i wytnij okrągły fragment skóry moszny o średnicy około 5 mm. Upewnij się, że nie uszkodziłeś struktur leżących głębiej, takich jak mięsień opuszkowy. Pamiętaj o utrzymaniu nawilżenia odsłoniętej tkanki roztworem soli fizjologicznej.</li>
	<li>Odseparuj luźną tkankę łączną za pomocą dwóch pęset i zlokalizuj oba jądra.</li>
	<li>Chwyć jedno jądro w części dystalnej i zacznij delikatnie je wyciągać, stopniowo usuwając otaczającą tkankę łączną.</li>
	<li>Po zewnętrznieniu jądra przymocuj jego koniec dystalny szpilką do gumowego pierścienia otaczającego stolik. Po zewnętrznieniu nawilżaj tkankę roztworem soli fizjologicznej przez cały czas trwania procedury.</li>
	<li>Krok krytyczny: Ostrożnie usuń tkankę łączną, nie uszkadzając leżącego pod nią mięśnia opuszkowego. Nadmiar tkanki łącznej może ograniczyć widoczność podczas późniejszej mikroskopii i spowodować rozmycie obrazów.</li>
	<li>Przymocuj dystalną część jądra szpilką i otwórz mięsień opuszkowy, wykonując małe cięcie poprzeczne (około 1 mm), a następnie nacięcie podłużne od samego końca dystalnego do proksymalnego. W wyniku tego mięsień opuszkowy powinien rozwinąć się sferycznie. Należy uważać, aby nie przeciąć makroskopowo widocznych naczyń, ponieważ może to wpłynąć na hemodynamiczną sytuację.</li>
	<li>Ostrożnie rozprostuj mięsień na szklanym stoliku i przymocuj go szpilkami do gumowego pierścienia. Upewnij się, że nie dotykasz ani nie uszkadzasz regionu centralnego, ponieważ w tym miejscu będzie przeprowadzana mikroskopia. 
	Uwaga: Zbyt mocne rozciągnięcie może utrudnić przepływ krwi.</li>
	<li>Odsuń pozostałe jądro i przymocuj je szpilką, aby uzyskać dostęp do obszaru zainteresowania. Pamiętaj o wielokrotnym nawilżaniu PSS, aby zapobiec wysychaniu. Tak zamocowany mięsień jest teraz gotowy do mikroskopii.</li>
</ol>
4. Mikroskopia intravitalna
<ol>
	<li>Umieścić zamocowany mięsień kremaster w mikroskopie pionowym i przeprowadzić badanie mikroskopowe przy użyciu obiektywu 40x.</li>
	<li>Pozyskać dane i wyeksportować je, korzystając z wysokoprzepustowej spektrografii obrazowej.</li>
	<li>Wykonywać pomiary przy ciągłej superfuzyjnej perfuzji podgrzanym (35-37 °C) PSS17. Superfuzję przeprowadzić za pomocą niewielkiej rurki przymocowanej taśmą do obiektywu pionowego mikroskopu, aby umożliwić ciągłe ściekanie PSS wzdłuż obiektywu na tkankę mięśniową.</li>
	<li>Zidentyfikować żyłki poprzewłośkowate (miejsce zbiegu dwóch mniejszych naczyń) i zmierzyć mikrokrążenie w żyłkach o średnicy 20-40 μm.</li>
	<li>Przechwycić obrazy mikrokrążenia w mięśniu kremaster o wysokiej rozdzielczości w przedziale czasowym 30 s. Ponieważ podczas rejestracji może dochodzić do lekkich skurczów i rozkurczów tkanki mięśniowej, należy stale korygować ostrość. Zazwyczaj u myszy obserwuje się stabilne krążenie przez około 2 godziny. Możliwe jest wykonanie kilku pomiarów z różnych naczyń w różnych obszarach. Następnie można wykorzystać jeden lub oba jądra. 
	UWAGA: Ponieważ jest to model stanu zapalnego, powszechnymi metodami indukcji są: systemiczne podanie lub miejscowy wstrzykiwanie do moszny mediatorów pro zapalnych, a także superfuzja np. N-formylmetionylu-leucylo-fenyloalaniną (fMLP). Miejscowa stymulacja TNF-α jest powszechnie stosowana w celu wywołania rekrutacji leukocytów; endotoksemia indukowana LPS jest modelem SIRS – ciężkiego systemowego stanu zapalnego.</li>
</ol>
5. Wizualizacja leukocytów
UWAGA: Leukocyty przylegające i toczące są łatwo widoczne bez dodatkowej wizualizacji. Aby określić prędkość leukocytów poruszających się swobodnie w linii środkowej, należy przeprowadzić barwienie różnicowe.
<ol>
	<li>W przypadku użycia myszy znakowanych eGFP, należy poddać je bezpośredniej analizie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Dla szczepów myszy nieznakowanych eGFP należy zastosować barwienie rhodaminą.
	<ol>
		<li>Podać rhodaminę 6G w dawce 0,2 mg/kg masy ciała. W celu uzyskania odpowiedniego natężenia barwienia mogą być wymagane powtórzone dawki. Należy zachować małe objętości, ponieważ większe objętości mogą wpływać na parametry hemodynamiczne.</li>
		<li>W celu natychmiastowego barwienia leukocytów barwnik należy podać przez tętnicę szyjną. Jeśli nie przeprowadzono preparacji tętnicy szyjnej, odpowiednie barwienie można uzyskać poprzez aplikację d.o. (dosytingalnie) przy zastosowaniu tej samej dawki18. Alternatywnie do kaniulacji tętnicy szyjnej można przeprowadzić kaniulację dowolnej innej żyły. 
		UWAGA: Należy pamiętać, że barwienie rhodaminą, w przeciwieństwie do znakowania eGFP, wykazuje spadek natężenia fluorescencji w czasie, a maksymalne ogólne barwienie przy wyższych stężeniach wynosi około 80% leukocytów.</li>
		<li>Wizualizować swobodnie poruszające się leukocyty zabarwione rhodaminą za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Zakończenie eksperymentu
UWAGA: Całkowity szacowany czas wykonania tego protokołu wynosi od 90 do 150 minut.
<ol>
	<li>Zakończyć eksperyment poprzez eutanazję metodą zwichnięcia karku.</li>
	<li>Do dalszych analiz, takich jak badanie transmigracji, utrwalić mięsień kremaster w PFA, gdy jest on wciąż rozciągnięty na stole, a następnie zabarwić zgodnie z wymogami badania histologicznego.</li>
</ol>
7. Analiza offline
<ol>
	<li>Analizuj następujące parametry jako proste zliczenia podczas odtwarzania wideo.
	<ol>
		<li>Oblicz strumień toczenia [liczba/min]: liczba komórek toczących się przez linię wyimaginowaną/min</li>
		<li>Oblicz adhezję [liczba/mm]2]: liczba komórek przylegających do ścianki naczynia w polu widzenia ≥ 30 s/powierzchnia naczyniowa [mm2].</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poniższe parametry hemodynamiczne i mikronaczyniowe mierzy się przy użyciu programu ImageJ.
	<ol>
		<li>Oblicz średnicę naczynia [µm] jako średnicę wewnętrzną ścianki.</li>
		<li>Oblicz długość naczynia [µm] jako długość linii środkowej naczynia.</li>
		<li>Oblicz prędkość w linii środkowej <img alt="Symbol jednostki mikrometrów na sekundę w wyrażeniu matematycznym dla pomiaru prędkości" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> uzyskane z analizy wideo klatka po klatce swobodnie poruszających się leukocytów w linii środkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy wykorzystać poniższe równania w celu wykonania szacunków.
	<ol>
		<li>Oblicz powierzchnię naczyniową w [mm²]2]: długość naczynia [µm] x średnica naczynia [µm] x π x 10-6.</li>
		<li>Obliczenie szybkości ścinania przy ściankach <img alt="Symbol jednostki sekund odwrotnych, często stosowany w stałych szybkości lub równaniach kinetyki reakcji." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">4,9 x (8 x prędkość na linii środkowej) <img alt="Symbol jednostki mikrometrów na sekundę w wyrażeniu matematycznym dla pomiaru prędkości" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> x 0,625/średnica naczynia [µm]).</li>
		<li>Oblicz średnią prędkość przepływu krwi <img alt="Symbol jednostki mikrometrów na sekundę w wyrażeniu matematycznym dla pomiaru prędkości" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">prędkość na osi strumienia <img alt="Symbol jednostki mikrometrów na sekundę w wyrażeniu matematycznym dla pomiaru prędkości" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> x 0,625.</li>
		<li>Oblicz całkowity przepływ leukocytów <img alt="Symbol równania dla szybkości w jednostkach liczby na minutę, istotny dla badań kinetycznych." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4">systemiczna liczba leukocytów <img alt="Wzór na stężenie komórek [liczba/μL], stosowany w liczeniu komórek i pomiarze stężenia." src="/files/ftp_upload/60509/60509eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> x (średnia prędkość przepływu krwi <img alt="Symbol jednostki mikrometrów na sekundę w wyrażeniu matematycznym dla pomiaru prędkości" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> x 60/100) x π x <img alt="Równanie średnicy naczynia do badania hemodynamiki, wzór: (średnica naczynia [μm]/2x10)^2" src="/files/ftp_upload/60509/60509eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6">.</li>
		<li>Oblicz ułamkową frakcję toczenia [%]: strumień toczenia/całkowity strumień leukocytów x 10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zanardo, R. C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+down-regulatable+E-selectin+ligand+is+functionally+important+for+PSGL-1-independent+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions.</a> Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1-expressing+neutrophils+exhibit+enhanced+effector+functions+in+murine+models+of+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia.</a> Blood. 127 (7), 898-907 (2016).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+cooperate+in+mediating+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo.</a> Blood. 116 (5), 841-849 (2010).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+controls+activation+and+anti-inflammatory+signalling+of+protein+C%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C.</a> PloS One. 9 (2), 89422(2014).</li>
<li>Frommhold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+and+ICAM-1+differentially+control+leukocyte+recruitment+during+acute+inflammation+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner.</a> BMC Immunology. 12 (1), 56(2011).</li>
<li>Braach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+functions+of+protein+C+require+RAGE+and+ICAM-1+in+a+stimulus-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner.</a> Mediators of Inflammation. 2014, 743678(2014).</li>
<li>Girbl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Compartmentalization+of+the+Chemokines+CXCL1+and+CXCL2+and+the+Atypical+Receptor+ACKR1+Determine+Discrete+Stages+of+Neutrophil+Diapedesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis.</a> Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).</li>
<li>Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2-+and+E-selectin-induced+neutrophil+arrest+during+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).</li>
<li>Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neutrophils+and+Monocytes+in+Mesenteric+Veins+by+Intravital+Microscopy+on+Anaesthetized+Mice+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).</li>
<li>von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avon+Andrian%2C+UH+%22Microcirculation%22">Microcirculation</a>. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).</li>
<li>Hudalla, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS-induced+maternal+inflammation+promotes+fetal+leukocyte+recruitment+and+prenatal+organ+infiltration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice.</a> Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).</li>
<li>Grant, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+ok+skeletal+muscle+blood+vessels+%28rat+cremaster%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster).</a> The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).</li>
<li>Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+digital+imaging+of+leukocyte-endothelial+interaction+in+ischemia-reperfusion+injury+%28IRI%29+of+the+rat+cremaster+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3973(2012).</li>
<li>Kranig, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+deficiency+promotes+leukocyte+recruitment+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice.</a> Pediatric Research. 11, 4457(2019).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2874(2011).</li>
<li>Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IV+and+IP+administration+of+rhodamine+in+visualization+of+WBC-BBB+interactions+in+cerebral+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels.</a> Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Nussbaum, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+and+endothelial+adhesive+function+during+human+fetal+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny.</a> Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

IVM jako metoda jest szeroko stosowana do badania różnych typów komórek w różnych narządach i została szeroko opisana i omówiona19. Głównym celem tego badania jest zapewnienie skutecznego podejścia do ustawiania i wykonywania IVM w mięśniu cremaster. Praktykowanie tej metody przyniesie wiarygodne i powtarzalne wyniki. Dlatego planowanie i standaryzacja są kluczowymi czynnikami do opanowania tej techniki. Przede wszystkim technika ta jest w dużym stopniu zależna od parametrów hemodynamicznych i mik...

Mikroskopia przyżyciowa (IVM) jest powszechnie stosowanym narzędziem w dziedzinie biologii leukocytów. Rekrutacja leukocytów następuje po kaskadzie dobrze zdefiniowanych zdarzeń zainicjowanych przez wychwyt, zwijanie i przyleganie leukocytów do ściany śródbłonka, a na końcu transmigrację i wynaczynienie leukocytów do właściwego miejsca zapalenia1. Każdy etap jest pośredniczony i kontrolowany przez różne chemokiny (np. IL-8/CXCL8), receptory (np. LFA-1, Mac-1) i odpowiadające im cząsteczki adhezyjne komórek śródbłonka (np. ICAM-1, VCAM-1 i E-Selectin)2,3. Interakcja różnych miejsc regulacyjnych, czynników kontrolujących i mediatorów kaskady rekrutacji leukocytów, takich jak receptor końcowych produktów zaawansowanej glikacji (RAGE), międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1 (ICAM-1), ligand motywu C-X-C (CXCL)1/2 i ich receptor CXCR2 zostały odkryte za pomocą IVM4,5,6,7,8,Rozdział 9.
Metoda IVM została opisana dla wielu różnych narządów i tkanek, takich jak jelito10, skin11, węzły chłonne12, embrionalny worek z żółtkiem13 i inne. Jednak najszerzej badaną metodą IVM jest model cremaster, po raz pierwszy opisany w rats14. Chociaż metoda ta jest nadal stosowana u szczurów15, obecnie stosowana głównie u myszy ze względu na dużą obfitość różnych linii transgenicznych. Nasza grupa niedawno podkreśliła potencjalną rolę cremaster IVM w dziedzinie zapalnych muskopatii, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), badając myszy mdx z niedoborem dystrofiny16. Ze względu na cienką przeplataną i łatwo dostępną kompozycję włókien, mięsień cremaster stanowi idealny mięsień kandydujący do badania jako całość za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej. Rekrutacja i wynaczynienie leukocytów odbywa się głównie w żyłkach pozakapilarnych, które można łatwo zidentyfikować na ciągłej warstwie mięśniowej w mięśniu cremaster.
Zaletą obrazowania in vivo w porównaniu z innymi testami in vitro jest jego biologiczny kontekst w żywym organizmie. Jednocześnie określenie specyficznego dla komórki wkładu w zmienioną rekrutację leukocytów może wymagać dodatkowych modeli in vitro, takich jak komory przepływowe lub testy śródbłonka. Połączenie wielu metod przyniesie najbardziej przekonujące dane. Naukowcy powinni zdawać sobie sprawę z ograniczeń modelu cremaster, ponieważ każda manipulacja chirurgiczna doprowadzi do zwiększonego transportu i rekrutacji leukocytów. W związku z tym rekrutacja wyjściowa jest trudna do oszacowania tą metodą. Pomimo szerokiego zastosowania, IVM cremastera może być wyzwaniem, a stworzenie nowatorskiej konfiguracji może wymagać czasu i zasobów. Teraz udostępniamy prosty protokół, który pomoże uniknąć niektórych typowych błędów w IVM. Omówione zostaną również ograniczenia, a w stosownych przypadkach zostaną podkreślone metody uzupełniające.
IVM cremastera reprezentuje idealne podejście do wdrożenia w dziedzinie badań nad stanami zapalnymi i zakaźnymi. Mówiąc dokładniej, model cremaster może być bardzo interesujący dla naukowców zajmujących się biologią mięśni szkieletowych w kontekście chorób zapalnych.

<table><tbody><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketanest S</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>PZN: 08509909</td><td>znieczulenia. Nazwa rodzajowa / IUPAC: ketamina</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CP-Pharma GmbH</td><td>Nr artykułu: 1205&nbsp;</td><td>znieczulenie. Nazwa ogólna / IUPAC: ksylazyna (jako chlorek hidrochlorku)</td></tr><tr><td>Roztwór soli</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>PZN 02737756</td><td>przygotowanie chirurgiczne. Ogólny / IUPAC Nazwa: chlorek sodu</td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa Omnican F</td><td>B. Braun Melsungen&nbsp;</td><td>REF 9161502</td><td>przygotowanie chirurgiczne&nbsp;</td></tr><tr><td>Szew 6/0 USP</td><td>Resorba</td><td>REF 4217</td><td>przygotowanie chirurgiczne&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa #10&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>Dostawca nr 427401</td><td>przygotowanie chirurgiczne&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa #90&nbsp;</td><td>BD GmbH</td><td>Dostawca nr 427421</td><td>przygotowanie chirurgiczne&nbsp;</td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>Numer CAS 989-38-8&nbsp;</td><td>barwienie leukocytów. Nazwa ogólna / IUPAC: 2-[3-(etyloamino)-6-etylomino-2,7-dimetyloksanten-9-ylo]benzoesan etylu</td></tr><tr><td>Setup Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td>Mikroskopia BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>40-krotny obiektyw&nbsp;</td><td>Mikroskopia Zeiss</td><td>Achroplan 40 & razy; /0,80 W</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImSpector</td><td>Oprogramowanie Lavision Biotec GmbH</td><td>wersja 4.0.469</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institute of Health, USA</td><td>ver. 1.51j8</td><td></td></tr></tbody></table>

naciek leukocytów mięśnia cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Mikroskopia przyżyciowa (IVM) jest szeroko stosowana do monitorowania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych w kaskadzie rekrutacji leukocytów in vivo. Obecny protokół stanowi praktyczną i powtarzalną metodę wizualizacji interakcji śródbłonka leukocytów prowadzącej do rekrutacji leukocytów w tkance pochodzącej z mięśni szkieletowych w nienaruszonym organizmie myszy. Model ma zastosowanie we wszystkich dziedzinach badań, które koncentrują się na aktywacji granulocytów i ich roli w chorobie.
Udostępniamy protokół krok po kroku, aby przeprowadzić przez metodę i wskazać potencjalne pułapki i trudności techniczne. Protokół obejmuje następujące aspekty: warunki eksperymentalne i wymagany materiał, znieczulenie myszy, rozwarstwienie mięśnia cremaster oraz kaniulacja tchawicy i tętnicy szyjnej, zapisy IVM i analiza offline. Szczegółowo wyjaśniono formaty danych, takie jak przylegające leukocyty, strumień toczny (RF) i frakcja strumienia tocznego (RFF) oraz omówiono odpowiednie zastosowania. Reprezentatywne wyniki dotyczące myszy mdx z niedoborem dystrofiny znajdują się w sekcji wyników.
IVM jest potężnym narzędziem do oceny rekrutacji leukocytów w warunkach in vivo; jednak określenie na przykład funkcji śródbłonka i leukocytów może wymagać połączenia z układami ex vivo, takimi jak eksperymenty w komorze przepływowej. Co więcej, pochodzenie genetyczne zwierząt będących przedmiotem zainteresowania może mieć duży wpływ na rekrutację wyjściową, co wymaga indywidualnego dopracowania dostarczonego protokołu. Pomimo swoich ograniczeń, IVM może służyć jako platforma do łatwego przekładania wyników badań in vitro na żywy organizm kręgowca.

IVM przeprowadzone zgodnie z dostarczonym protokołem pozwoli na uzyskanie unikalnych informacji na temat kaskady rekrutacji leukocytów w mięśniach szkieletowych. Sekcja wyników skupi się na typowych rezultatach uzyskiwanych za pomocą IVM oraz zwróci uwagę na potencjalne problemy, które mogą wystąpić.
Układ eksperymentalny do mikroskopii intravitalnej przedstawiono w Rysunek 1Przygotowanie mięśnia opuszkowego oraz usunięcie tkanki łącznej są kluczowe dla uzyskania ...

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Ta praktyczna i powtarzalna metoda może być wykorzystana do wizualizacji interakcji leukocytów śródbłonka, które prowadzą do rekrutacji leukocytów w nienaruszonej myszy. Technika ta stanowi również potężne narzędzie do monitorowania procesów fizjologicznych i patofizjologicznych w kaskadzie rekrutacji leukocytów in vivo. Metoda może być stosowana w różnych modelach zapalnych i septycznych.Na przykład niedawno podkreśliliśmy jego znaczenie w badaniu muskulopatii obejmujących nadmierny naciek leukocytów mięśniowych. Nasza sugestia dla kolegów naukowców, którzy rozważają zastosowanie tej techniki, to zdobycie jak największego praktycznego doświadczenia, ponieważ metoda jest bardzo podatna na drobne odchylenia. Procedurę zademonstruje Simon Kranig, klinicysta i starszy naukowiec z mojego laboratorium.Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego zwierzęcia doświadczalnego, przymocuj mysz w grzbietowej pozycji leżącej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i użyj niewchłanialnego sterylnego szwu 6-0, aby owinąć prostą pętlę wokół przednich zębów. Przyklej łączące się końce szwu do poduszki grzewczej i za pomocą pęsety delikatnie unieś skórę w linii środkowej. Następnie wykonaj okrągłe nacięcie o średnicy od jednego do dwóch centymetrów nad szyją i górną częścią klatki piersiowej i za pomocą pęsety dokładnie wypreparuj otaczające mięśnie, tłuszcz i tkanki łączne.Umieść szew pod tchawicą. Użyj małych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać około 1,3 milimetra poprzecznego nacięcia w tchawicy i wprowadzić rurkę polietylenową do ogonowego końca tchawicy, aby zabezpieczyć górne drogi oddechowe. Zamocuj rurkę znajdującą się za pomocą pojedynczego okrągłego szwu węzłowego i zlokalizuj tętnicę szyjną wzdłuż prawej strony tchawicy.Wypreparuj otaczającą tkankę ze ściany tętnicy szyjnej i przełóż dwa kawałki szwu pod tętnicą. Zawiąż pierwszy szew czaszkowy proksymalnie do rozwidlenia tętnic szyjnych i umieść drugi szew około pięć do ośmiu milimetrów dystalnie od pierwszego szwu bez wiązania. Następnie przymocuj 30-centymetrowy kawałek rurki polietylenowej do jednomililitrowej igły strzykawkowej wypełnionej solą fizjologiczną i użyj siedmiomilimetrowego klipsa do naczynia, aby zacisnąć tętnicę szyjną dystalnie do drugiego szwu.Wykonaj około 0,5 milimetra poprzecznego nacięcia w tętnicy szyjnej i wprowadź sterylną rurkę polietylenową do tętnicy. Zabezpiecz rurkę drugim szwem i zdejmij zacisk naczynia. Następnie delikatnie wcisnąć tłok strzykawki, aby spłukać sól fizjologiczną do naczynia.Aby przygotować mięsień cremaster, przenieś mysz do wykonanej na zamówienie plastikowej ramy mikroskopu z moszną skierowaną w stronę stolika mikroskopu i ostrożnie chwyć mosznę na jej najbardziej dystalnym końcu pęsetą. Delikatnie pociągając za mosznę, usuń okrągły odcinek skóry moszny o średnicy około pięciu milimetrów, utrzymując otwartą tkankę dobrze nawilżoną solą fizjologiczną. Użyj dwóch pęset, aby wypreparować luźną tkankę łączną i zlokalizować oba jądra.Chwyć jedno jądro dystalnie i delikatnie zacznij wyciągać tkankę rozrodczą, krok po kroku usuwając otaczające tkanki łączne. Gdy jądro zostanie wyeksterioryzowane, przypnij dystalny koniec tkanki do gumowego pierścienia otaczającego etap i nawodnij tkankę solą fizjologiczną. Następnie ostrożnie usuń tkankę łączną, nie uszkadzając leżącego pod nią mięśnia cremaster.Bardzo ważne jest, aby usunąć całą tkankę łączną, co skutkowałoby rozmytymi obrazami bez uszkadzania leżącego poniżej mięśnia cremaster. Po usunięciu całej tkanki wykonaj jednomilimetrowe nacięcie poprzeczne, aby otworzyć mięsień cremaster przed wykonaniem podłużnego nacięcia od bardzo dystalnego do bliższego końca tkanki. Mięsień powinien otwierać się kulisto.Ostrożnie rozłóż mięsień na szklanym etapie i przypnij mięsień do gumowego pierścienia, uważając, aby nie dotknąć ani nie uszkodzić centralnego obszaru tkanki. Następnie przypnij pozostałe jądro z boku, aby dać dostęp do obszaru zainteresowania i nawodnij tkankę za pomocą PSS. W celu przyżyciowej wizualizacji układu naczyniowego mięśni, umieść zamontowany mięsień cremaster w pionowym mikroskopie i wybierz obiektyw 40X.Wykonuj nagrania w ciągłym superfuzji z PSS o temperaturze od 35 do 37 stopni Celsjusza przez kawałek małej rurki, która została przyklejona do pionowego obiektywu mikroskopu, aby umożliwić ciągłe kapanie PSS wzdłuż obiektywu w dół na mięśnie i tkanki. Zidentyfikuj żyłki zakapilarne. Zmierz mikrokrążenie na żyłkach o średnicy od 20 do 40 mikrometrów.Następnie nagrywaj obrazy mikrokrążenia w wysokiej rozdzielczości z mięśnia cremaster przez 30 sekund, stale dostosowując ostrość z powodu niewielkich zmian w skurczu i rozluźnieniu tkanki mięśniowej. Nadmiar tkanki łącznej może prowadzić do rozmytych obrazów mikroskopowych. Na tym reprezentatywnym obrazie mikroskopowym żyłki zakapilarne, które powinny mieć średnicę od 20 do 40 mikrometrów, można zidentyfikować na podstawie zbiegu dwóch mniejszych naczyń.Przylegające i toczące się leukocyty można wizualizować, podczas gdy krążące leukocyty można śledzić tylko w odtwarzaniu nagranych filmów w zwolnionym tempie. Na rekrutację leukocytów in vivo może wpływać wiele parametrów, w tym rzut serca, średnica naczynia, prędkość środkowa, szybkość ścinania ścian i liczba krążących leukocytów. Należy pamiętać, że na prędkość linii środkowej ma wpływ rzut serca, obwodowy opór naczyniowy i objętość wewnątrznaczyniowa.Na przykład duża objętość rodaminy lub innej substancji doświadczalnej podawana przez cewnik do tętnicy szyjnej zwiększa prędkość środkowej linii krwi po kapilarce i hamuje wychwytywanie i zwijanie leukocytów. Wręcz przeciwnie, niewydolność serca, głębokie znieczulenie lub hipotermia mogą zmniejszyć przepływ pokapilarny. Aby określić prędkość linii środkowej, można użyć swobodnie krążących leukocytów fluorescencyjnych lub leukocyty muszą być barwione odczynnikami fluorescencyjnymi, takimi jak rodamina.Należy pamiętać, że szczepy typu dzikiego mogą wykazywać wariancję fizjologiczną. Na przykład myszy C57BL/6 wykazują wyraźnie zwiększone zwijanie, adhezję i transmigrację leukocytów w porównaniu ze zwierzętami C57BL/10ScSn. Etapy planowania i standaryzacji są ważne dla opanowania techniki, zwłaszcza podczas przygotowania mięśnia cremaster do mikroskopii.Inne metody wizualizacji rekrutacji leukocytów można przeprowadzić, aby uzyskać dodatkowe informacje i pomóc w analizie indywidualnego wkładu leukocytów i komórek śródbłonka w kaskadę rekrutacyjną. Technika ta stanowi platformę do przedklinicznej oceny farmakologicznych środków medytacyjnych i nowych substancji immunomodulujących.

leukocyte-infiltration-cremaster-muscle-mice-assessed-intravital

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano przygotowanie tkanki do wizualizacji i manipulacji eksperymentalnej żywego mikrokrążenia. U znieczulonych samców myszy przygotowano cienki, silnie unaczyniony mięsień kremaster do mikroskopii przyżyciowej w celu badania sieci mikronaczyniowych, w tym tętniczek, kapilar i żyłek. Metoda ta może być łatwo dostosowana do szczurów i chomików.

Przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Cyfrowa intravitalna mikroskopia epifluorescencyjna żyłek posutniczych w mikrokrążeniu mięśnia dźwigacza jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w interakcje leukocytowo-śródbłonkowe in vivo w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) prążkowanej tkanki mięśniowej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół bezpiecznego wykonania tej techniki oraz omawiamy jej zastosowania i ograniczenia.

Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Obrazowanie stawów in vivo to cenna technika wykrywająca migracyjne zachowania leukocytów oraz dynamikę molekularną w obrębie zapalonych stawów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu myszego zapalenia stawów wywołanego kolagenem II (CIA).

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Poznaj mikroskopię przyżyciową mięśnia Cremaster u myszy do badania nacieków leukocytów w zapaleniu i sepsie. Ta metoda umożliwia wizualizację interakcji leukocytów z śródbłonkiem in vivo.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Przeglądaj więcej filmów