Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Pęcherzykowe komórki pomocnicze T to nowo zidentyfikowany podzbiór limfocytów T CD4, który zapewnia pomoc limfocytom B w produkcji zwierzęcej o wysokim powinowactwie. Demonstracja identyfikacji komórek Tfh w zakażeniu wirusem grypy pomoże nowym naukowcom zrozumieć, w jaki sposób wykonywać techniki niezbędne do badań związanych z Tfh. Ponieważ niewłaściwe miano wirusa może powodować śmiertelność lub zbyt słabą odpowiedź immunologiczną, zalecamy określenie miana przed przeprowadzeniem eksperymentu.

Do inokulacji wirusem PR8 ośmiotygodniowego samca C57 czarnych myszy 6. W warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 rozmrozić na lodzie zapas wirusa PR8 przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wirować wirusa, aby uzyskać jednorodny roztwór.

Rozcieńczyć wirusa do dwóch jednostek platformowych na mikrolitr PBS we wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 mililitra i potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonych zwierząt. Ponownie wywołaj wirusa. Załaduj końcówkę pipety o pojemności 20 mikrolitrów z 10 mikrolitrami wirusa.

Ostrożnie dodaj krople wirusa do jednego naris składającego się z maksymalnie trzech uspokojonych zwierząt przed powtórzeniem inokulacji po drugiej stronie. Następnie umieść wszystkie myszy w pozycji leżącej mostka w ciepłych klatkach z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia i waż każdą mysz codziennie przez 10 dni. Pod koniec eksperymentu umieść myszy w okapie z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 i przymocuj pierwsze zwierzę do chłonnej, pokrytej papierem piankowej deski do preparacji.

Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej brzucha, rozciągając skórę pęsetą i przypinając skórę do deski preparcyjnej. Otwórz otrzewną, aby zebrać śledzionę i umieść śledzionę w filtrze 70 mikrometrów z 6-centymetrową naczynią zawierającą 5 mililitrów DMEM uzupełnionego 1% FBS. Podziel przeponę i żebra aż do grasicy i przymocuj żebro z boku, aby odsłonić klatkę piersiową.

Przesuń płuco i serce, aby zlokalizować węzeł chłonny śródpiersia w pobliżu brzusznej strony tchawicy. Następnie umieść węzeł chłonny we własnym sitku w drugim 6-centymetrowym naczyniu zawierającym 5 mililitrów pożywki i użyj 3-mililitrowych tłoków strzykawki, aby delikatnie rozgnieść obie tkanki przez siatkę obu sit. Przepłucz każde sitko 1 mililitrem świeżego DMEM plus FBS i przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych 15-mililitrowych probówek wirówkowych.

Zbierz komórki przez odwirowanie i dokładnie zawieś granulki w 1 mililitrze świeżego DMEM plus FBS na probówkę. Następnie dodaj cztery dodatkowe mililitry pożywki do zawiesiny komórek śledziony i umieść obie probówki na lodzie. Aby wybarwić komórki pod kątem ekspresji CXCR5, należy kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby wymieszać i przenieść 2 razy 10 do 6 komórek na próbkę do indywidualnych probówek FACS.

Dodaj 2 mililitry buforu barwiącego do każdej probówki i wymieszaj komórki przez wirowanie. Osadzać komórki przez odwirowanie i wyrzucić supernatanty. Delikatnie postukaj dwukrotnie każdą probówką w bibułę chłonną i delikatnie przesuń dwa dna, aby ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.

Zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą 0,2 mikrolitra bloku receptora Fc na probówkę i delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać przed umieszczeniem probówek na lodzie na 10 minut. Pod koniec inkubacji dodaj 0,3 mikrolitra biotyny anty-mysiej CXCR5 do każdej probówki i wymieszaj, delikatnie trzepiąc. Umieść probówki na lodzie na godzinę, delikatnie trzepiąc po 30 minutach.

Pod koniec inkubacji dodać 2 mililitry buforu barwiącego do probówek i wirować do wymieszania przed sedymentacją komórek przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i przesunąć w celu ponownego zawieszenia komórek w buforze resztkowym. Następnie umieść probówki na lodzie i oznacz komórki przeciwciałami przeciwko markerowi powierzchniowemu będącemu przedmiotem zainteresowania, jak pokazano w tabeli, jak właśnie pokazano.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki 2 mililitrami buforu barwiącego i ponownie zawiesić każdą osadkę w 400 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Myszy zakażone wirusem PR8 zaczynają tracić na wadze w szóstym dniu, osiągając najwyższą utratę w ósmym dniu i powracając do początkowego poziomu masy ciała w 10 dniu. Zgodnie z oczekiwaniami nie obserwuje się utraty masy ciała u myszy kontrolnych leczonych PBS.

Zakażenie wirusem prowadzi również do silnej ekspansji limfocytów w drenującym węźle chłonnym. Jak zaobserwowano w analizie cytometrii przepływowej, różnicowanie pęcherzykowych komórek pomocniczych T rozpoczyna się w piątym dniu i osiąga szczyt w 10 dniu po zakażeniu z dużą liczbą pęcherzykowych komórek pomocniczych T indukowanych u myszy zakażonych wirusem grypy w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Ponadto, zarówno w węzłach chłonnych śródpiersia, jak i śledzionie, liczba komórek T CD4-dodatnich specyficznych dla antygenu grypy jest znacznie indukowana w porównaniu z obserwowanymi u myszy kontrolnych ze zwiększoną populacją komórek CXCR5 dodatnich PD-1 u zwierząt PR8.

Ponadto barwienie wewnątrzkomórkowe w kierunku IL-21 ujawnia, że zakażenie PR8 indukuje znacznie wyższą produkcję tej cytokiny w odpowiedzi na zakażenie wirusem. Barwienie immunofluorescencyjne wskazuje na obecność indukowanej reakcji centrum rozrodczego u myszy zakażonych PR8, a ELISA wykazuje wytwarzanie przeciwciał specyficznych dla wirusa grypy u zwierząt zakażonych wirusem. Ważne jest, aby barwienie CXCR5 na lodzie trwało godzinę, ponieważ na jakość plamy będzie miała wpływ temperatura i czas barwienia.

Chociaż wykazaliśmy barwienie CXR5 i IL-21, inne markery powierzchniowe, czynniki transkrypcyjne i cytokiny można ocenić tą metodą, aby uzyskać wiele informacji na temat różnicowania i funkcji Tfh.