Name: Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metody oceny komórek Tfh i odpowiedzi centrum rozrodczego u myszy zakażonych wirusem grypy A. Protokoły obejmują inokulację wirusem PR8 i analizę cytometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy personelowi zakładu cytometrii przepływowej, zakładu ABSL2 i zakładu SPF dla zwierząt Instytutu Pasteura w Szanghaju za ich pomoc techniczną i porady. Prace te były wspierane przez następujące granty: Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDB29030103), Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFA0502202), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (31570886).

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na wyspecjalizowane role w zapewnianiu pomocy limfocytów B w wytwarzaniu przeciwciał o wysokim powinowactwie, komórki Tfh zostały szeroko przebadane w mechanizmach różnicowania i manipulacji, aby zapewnić nowe strategie projektowania szczepionek. Zakażenie wirusem grypy indukuje silne odpowiedzi komórek B Tfh i GC, dzięki czemu jest odpowiednim modelem dla tej dziedziny badań. W niniejszej pracy opisano protokoły zakażenia wirusem grypy przez inokulację donosową, ocenę odpowiedzi związanej z Tfh za pomocą cyto...

W ostatnim dziesięcioleciu, liczne badania koncentrowały się na nowo zidentyfikowanym podzbiorze limfocytów T CD4+, podzbiorze komórek Tfh, ze względu na jego kluczowe role w rozwoju centrum zarodkowego (GC) B. Chłoniak z komórek B 6 (Bcl6), który jest głównie uważany za represor genów, jest czynnikiem definiującym linię komórek Tfh dla dowodu, że ektopowa ekspresja Bcl6 jest wystarczająca do napędzania różnicowania Tfh, podczas gdy niedobór Bcl6 powoduje zanik różnicowania Tfh1,2,3. W przeciwieństwie do innych podzbiorów pomocniczych T CD4 + pełniących swoją funkcję efektorową poprzez migrację do miejsc zapalenia, komórki Tfh zapewniają komórkom B pomoc głównie w strefie pęcherzykowej komórek B śledziony i węzła chłonnego. Cząsteczki kostymulujące ICOS i CD40L odgrywają znaczącą rolę w interakcji między komórkami B Tfh i GC. Podczas różnicowania Tfh ICOS przesyła niezbędne sygnały z pokrewnych komórek B, a także działa jako receptor odbierający sygnały migracji od komórek B osób postronnych w celu lokalizacji strefy komórek B4,5. CD40L jest mediatorem sygnałów z komórek Tfh dla proliferacji i przeżycia limfocytów B6. Innym czynnikiem pełniącym podobną rolę jak CD40L jest cytokina IL21, która jest wydzielana głównie przez komórki Tfh. IL21 bezpośrednio reguluje rozwój komórek GC B i produkcję przeciwciał o wysokim powinowactwie, ale jej rola w różnicowaniu Tfh jest nadal kontrowersyjna7,8. PD-1 i CXCR5, które są obecnie najczęściej używane do identyfikacji komórek Tfh w analizie cytometrii przepływowej, również odgrywają znaczącą rolę w różnicowaniu i funkcji tego podzbioru. CXCR5 jest receptorem chemokiny pęcherzykowej komórek B i pośredniczy w lokalizacji komórek Tfh w pęcherzykach komórek B9. PD-1 jest teraz identyfikowany, ponieważ nie tylko ma funkcję kierowania pęcherzykami, ale także przekazuje krytyczne sygnały w procesie dojrzewania powinowactwa komórek GC B10. Opierając się na tych odkryciach, ocena ekspresji tych cząsteczek może zasadniczo odzwierciedlać dojrzewanie i funkcję komórek Tfh.
GC jest indukowaną przejściową strukturą mikroanatomiczną w wtórnych narządach limfatycznych i wysoce zależną od komórek Tfh, dlatego jest doskonałym odczytem do oceny odpowiedzi Tfh. W GC, po otrzymaniu sygnałów, w których pośredniczą cytokiny i cząsteczki kostymulujące, limfocyty B podlegają zamianie klas i hipermutacji somatycznej w celu wytworzenia przeciwciał o wysokim powinowactwie11. Różnicowa zamiana klas przeciwciał zachodzi w niszy cytokin różnicowych, w której IL4 i IL21 indukują przełączanie klasy IgG1, podczas gdy IFNγ indukuje przełączanie klasy IgG212. Komórki plazmatyczne są producentami wydzielanych przeciwciał i są komórkami ostatecznie zróżnicowanymi. Podobnie jak w przypadku komórek Tfh, rozwój limfocytów B w GC wiąże się z dynamiczną ekspresją wielu istotnych cząsteczek. Na podstawie obecnego badania, komórki GC B można zidentyfikować jako komórki B220 + PNA + Fas + lub B220 + GL7 + Fas + i komórki plazmatyczne, w porównaniu z ich prekursorami, regulują w dół ekspresję B220 i zwiększają ekspresję CD138 13. Co więcej, obie te cechy mogą być wykryte w cytometrii przepływowej i analizie immunofluorescencyjnej, co stanowi właściwą ocenę odpowiedzi GC.
Silne odpowiedzi komórkowe i humoralne są indukowane w infekcji wirusem grypy, przy czym komórki Tfh i Th1 dominują nad odpowiedzią limfocytów T CD4+14, co czyni go idealnym modelem do badania różnicowania komórek Tfh. Grypa A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), która jest powszechnie stosowanym szczepem przystosowanym do myszy, jest często używana w tym badaniu14,15,16. Tutaj opisujemy kilka podstawowych protokołów testu istotnego dla badania Tfh w zakażeniu wirusem grypy: 1) donosowa inokulacja wirusa PR8; 2) swoiste dla antygenu komórki Tfh, GC B i komórki plazmatyczne oraz detekcja IL21 za pomocą cytometrii przepływowej; 3) wizualizacja histologiczna GKK; 4) wykrywanie miana przeciwciał swoistych dla antygenu w surowicy za pomocą testu ELISA. Protokoły te zapewniają niezbędne techniki dla nowych badaczy w badaniach związanych z Tfh.

<table><tbody><tr><td>Immunologiczne barwienie komórek Tfh, komórek Tfh swoistych dla NP i Bcl-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehydu</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 mysz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-sprzężony-IAbNP311-325 Tetramer MHC klasy II</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>klon:7D1</td></tr><tr><td>Biotyna-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>klon: SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>klon: GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>klon: IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>klon: IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>klon: MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>klon: 7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE / Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>klon: 29F.1A12</td></tr><tr><td>Streptawidyna BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td><silne>Barwienie wewnątrzkomórkowe IL21</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>ludzki receptor FCc IL-21</td><td>R& System D</td> jonomycyna <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy zestaw do barwienia Aqua Dead Cell</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC B i barwienie komórek plazmatycznych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-0452-81</td><td>klon: RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>klon: 281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE / Cy7</td><td>Klon 557653 Pharmingen</td><td></td><td>: Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48-5993-82</td><td>klon: 11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>Test miana przeciwciał swoistych dla HA za pomocą ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty mysie IgM (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł anty mysz IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty mysia IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł anty mysz IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>TMB Zestaw odczynników substratowych</td><td>BD Pharmingen</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowane laboratoria wektorowe PNA</td><td></td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>rozcieńczony Alexa Fluor 488-streptawidyna</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciw blaknięciu Pro-long gold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw blokujący STREPTAWIDYNĘ/BIOTYNĘ</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena komórek pomocniczych pęcherzyków t i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy a u myszy

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) to niezależny podzbiór limfocytów T CD4+, wyspecjalizowany w dostarczaniu pomocy w rozwoju centrum rozrodczego (GC) i wytwarzaniu przeciwciał o wysokim powinowactwie. W zakażeniu wirusem grypy indukowane są silne odpowiedzi komórek B Tfh i GC, aby ułatwić skuteczną eliminację wirusa, co zapewnia wykwalifikowany model myszy do badania związanego z Tfh. W tym artykule opisaliśmy protokoły wykrywania podstawowej odpowiedzi immunologicznej związanej z Tfh podczas infekcji wirusem grypy u myszy. Protokoły te obejmują: donosowe inokulowanie wirusa grypy; barwienie cytometrią przepływową i analiza poliklonalnych i swoistych antygenowo komórek Tfh, komórek GC B i komórek plazmatycznych; wykrywanie immunofluorescencji GCs; test immunoenzymatyczny (ELISA) przeciwciała swoistego dla wirusa grypy w surowicy. Testy te zasadniczo określają ilościowo różnicowanie i funkcję komórek Tfh w zakażeniu wirusem grypy, zapewniając w ten sposób pomoc w badaniach nad wyjaśnieniem mechanizmu różnicowania i strategii manipulacji.

Charakterystyka chorobowości myszy w zakażeniu wirusem grypy 
Po zakażeniu wirusem grypy myszy są mniej aktywne i doświadczają anoreksji z powodu choroby, co objawia się silną utratą masy ciała – powszechnie stosowanym objawem monitorowania chorobowości myszy19. Jak pokazano na Rysunku 1a, myszy zakażone wirusem PR8 zaczęły tracić na wadze w 6. dniu, osiągnęły największy poziom utraty w 8. dniu, a w 10. dniu wróciły do początkowej ...

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Pęcherzykowe komórki pomocnicze T to nowo zidentyfikowany podzbiór limfocytów T CD4, który zapewnia pomoc limfocytom B w produkcji zwierzęcej o wysokim powinowactwie. Demonstracja identyfikacji komórek Tfh w zakażeniu wirusem grypy pomoże nowym naukowcom zrozumieć, w jaki sposób wykonywać techniki niezbędne do badań związanych z Tfh. Ponieważ niewłaściwe miano wirusa może powodować śmiertelność lub zbyt słabą odpowiedź immunologiczną, zalecamy określenie miana przed przeprowadzeniem eksperymentu.Do inokulacji wirusem PR8 ośmiotygodniowego samca C57 czarnych myszy 6. W warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 rozmrozić na lodzie zapas wirusa PR8 przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wirować wirusa, aby uzyskać jednorodny roztwór.Rozcieńczyć wirusa do dwóch jednostek platformowych na mikrolitr PBS we wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 mililitra i potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonych zwierząt. Ponownie wywołaj wirusa. Załaduj końcówkę pipety o pojemności 20 mikrolitrów z 10 mikrolitrami wirusa.Ostrożnie dodaj krople wirusa do jednego naris składającego się z maksymalnie trzech uspokojonych zwierząt przed powtórzeniem inokulacji po drugiej stronie. Następnie umieść wszystkie myszy w pozycji leżącej mostka w ciepłych klatkach z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia i waż każdą mysz codziennie przez 10 dni. Pod koniec eksperymentu umieść myszy w okapie z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 i przymocuj pierwsze zwierzę do chłonnej, pokrytej papierem piankowej deski do preparacji.Użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej brzucha, rozciągając skórę pęsetą i przypinając skórę do deski preparcyjnej. Otwórz otrzewną, aby zebrać śledzionę i umieść śledzionę w filtrze 70 mikrometrów z 6-centymetrową naczynią zawierającą 5 mililitrów DMEM uzupełnionego 1% FBS. Podziel przeponę i żebra aż do grasicy i przymocuj żebro z boku, aby odsłonić klatkę piersiową.Przesuń płuco i serce, aby zlokalizować węzeł chłonny śródpiersia w pobliżu brzusznej strony tchawicy. Następnie umieść węzeł chłonny we własnym sitku w drugim 6-centymetrowym naczyniu zawierającym 5 mililitrów pożywki i użyj 3-mililitrowych tłoków strzykawki, aby delikatnie rozgnieść obie tkanki przez siatkę obu sit. Przepłucz każde sitko 1 mililitrem świeżego DMEM plus FBS i przenieś zawiesiny komórek do pojedynczych 15-mililitrowych probówek wirówkowych.Zbierz komórki przez odwirowanie i dokładnie zawieś granulki w 1 mililitrze świeżego DMEM plus FBS na probówkę. Następnie dodaj cztery dodatkowe mililitry pożywki do zawiesiny komórek śledziony i umieść obie probówki na lodzie. Aby wybarwić komórki pod kątem ekspresji CXCR5, należy kilkakrotnie odwrócić probówkę, aby wymieszać i przenieść 2 razy 10 do 6 komórek na próbkę do indywidualnych probówek FACS.Dodaj 2 mililitry buforu barwiącego do każdej probówki i wymieszaj komórki przez wirowanie. Osadzać komórki przez odwirowanie i wyrzucić supernatanty. Delikatnie postukaj dwukrotnie każdą probówką w bibułę chłonną i delikatnie przesuń dwa dna, aby ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.Zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą 0,2 mikrolitra bloku receptora Fc na probówkę i delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać przed umieszczeniem probówek na lodzie na 10 minut. Pod koniec inkubacji dodaj 0,3 mikrolitra biotyny anty-mysiej CXCR5 do każdej probówki i wymieszaj, delikatnie trzepiąc. Umieść probówki na lodzie na godzinę, delikatnie trzepiąc po 30 minutach.Pod koniec inkubacji dodać 2 mililitry buforu barwiącego do probówek i wirować do wymieszania przed sedymentacją komórek przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i przesunąć w celu ponownego zawieszenia komórek w buforze resztkowym. Następnie umieść probówki na lodzie i oznacz komórki przeciwciałami przeciwko markerowi powierzchniowemu będącemu przedmiotem zainteresowania, jak pokazano w tabeli, jak właśnie pokazano.Pod koniec inkubacji przemyć komórki 2 mililitrami buforu barwiącego i ponownie zawiesić każdą osadkę w 400 mikrolitrach świeżego buforu barwiącego do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Myszy zakażone wirusem PR8 zaczynają tracić na wadze w szóstym dniu, osiągając najwyższą utratę w ósmym dniu i powracając do początkowego poziomu masy ciała w 10 dniu. Zgodnie z oczekiwaniami nie obserwuje się utraty masy ciała u myszy kontrolnych leczonych PBS.Zakażenie wirusem prowadzi również do silnej ekspansji limfocytów w drenującym węźle chłonnym. Jak zaobserwowano w analizie cytometrii przepływowej, różnicowanie pęcherzykowych komórek pomocniczych T rozpoczyna się w piątym dniu i osiąga szczyt w 10 dniu po zakażeniu z dużą liczbą pęcherzykowych komórek pomocniczych T indukowanych u myszy zakażonych wirusem grypy w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Ponadto, zarówno w węzłach chłonnych śródpiersia, jak i śledzionie, liczba komórek T CD4-dodatnich specyficznych dla antygenu grypy jest znacznie indukowana w porównaniu z obserwowanymi u myszy kontrolnych ze zwiększoną populacją komórek CXCR5 dodatnich PD-1 u zwierząt PR8.Ponadto barwienie wewnątrzkomórkowe w kierunku IL-21 ujawnia, że zakażenie PR8 indukuje znacznie wyższą produkcję tej cytokiny w odpowiedzi na zakażenie wirusem. Barwienie immunofluorescencyjne wskazuje na obecność indukowanej reakcji centrum rozrodczego u myszy zakażonych PR8, a ELISA wykazuje wytwarzanie przeciwciał specyficznych dla wirusa grypy u zwierząt zakażonych wirusem. Ważne jest, aby barwienie CXCR5 na lodzie trwało godzinę, ponieważ na jakość plamy będzie miała wpływ temperatura i czas barwienia.Chociaż wykazaliśmy barwienie CXR5 i IL-21, inne markery powierzchniowe, czynniki transkrypcyjne i cytokiny można ocenić tą metodą, aby uzyskać wiele informacji na temat różnicowania i funkcji Tfh.

evaluation-t-follicular-helper-cells-germinal-center-response-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Metoda ta opisuje zastosowanie systemu obrazowania opartego na barwnikach w podczerwieni do wykrywania H1N1 w płyku z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) zakażonych myszy z wysoką czułością. Metodykę tę można przeprowadzić na płytce 96- lub 384-dołkowej, wymaga ona objętości materiału badawczego &lt;10 μl i umożliwia jednoczesny screening wielu patogenów.

Metoda wysokoprzepustowego wykrywania wirusa grypy

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Dwie metody oparte na cytometrii przepływowej - test in vitro na bazie limfocytów T i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin zostały wykorzystane do zmierzenia zdolności komórek dendrytycznych do prezentacji antygenu i odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu na infekcję mutantem wirusa Zachodniego Nilu u myszy.

In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.

Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Opisano protokół oceny odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w narządach immunouprzywilejowanych mysiego modelu Ifnar1-/- dla infekcji wirusem Zika (ZIKV). Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania komórkowych mechanizmów ochrony i immunopatogenezy szczepionek ZIKV, a także jest cenna dla oceny ich skuteczności.

Ocena odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla wirusa Zika w narządach z uprawnieniami immunologicznymi zakażonych myszy Ifnar1-/-

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące podawania IAV w ciągu nosa oraz dalszej analizy uszkodzeń płuc myszy i związanych z tym zmian transkrypcyjnych typów komórek płucnych.

Modelowanie dysplastycznej i funkcjonalnej naprawy płuc pęcherzyków płucnych po zakażeniu grypą

Poznaj metody oceny komórek Tfh i odpowiedzi centrum rozrodczego u myszy zakażonych wirusem grypy A. Protokoły obejmują inokulację wirusem PR8 i analizę cytometryczną.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Przeglądaj więcej filmów