Bezprzewodowa elektrofizjologiczna rejestracja neuronów przez ruchome tetrody u swobodnie pływających ryb

Opracowaliśmy nowatorską metodę rejestrowania zewnątrzkomórkowego sygnału neuronalnego z mózgu swobodnie pływających ryb. Otwiera to drzwi do badania mechanizmów neuronalnych w zachowaniu ryb pod koniec dnia. Ta metoda jest ważna i wodoodporna, a zatem umożliwia nagrywanie, gdy ryby swobodnie pływają w zbiorniku wodnym.

Dodatkowo miejsce nagrywania może być kontrolowane przez wbudowany napęd micro drive. Tal Zoor-Novoplansky, nasz technik laboratoryjny, pomoże mi zademonstrować tę procedurę. Do budowy obudowy należy użyć mosiężnej płytki o wymiarach 19 milimetrów na 29 milimetrów na jeden milimetr.

Z dwoma 5,5 milimetrowymi szczelinami na dłuższych bokach, prostopadłymi do krawędzi. Szczeliny powinny znajdować się w odległości 6,5 milimetra od wąskiego boku. Za pomocą szczypiec złóż obszar między szczelinami na dłuższych bokach do wewnątrz.

Następnie złóż dolną część do środka, a górną stronę na zewnątrz, aby uzyskać obudowę. Następnie za pomocą trzymilimetrowego wiertła koperkowego wykonaj otwory w obudowie mikronapędu na i boki obudowy. Użyj cienkiego okrągłego pilnika, aby utworzyć małą półokrągłą szczelinę w dolnej części obudowy o promieniu 1,5 milimetra.

Za pomocą wiertła o długości jednego milimetra wykonaj otwór w tylnej części obudowy na tetrody. Najpierw użyj noża, aby odłamać trzypinowy kawałek z jednorzędowego męskiego paska nagłówka kołka. Za pomocą szczypiec wyciągnij środkowy kołek.

Następnie za pomocą noża przyciąć pozostałe szpilki do długości 10 milimetrów. Użyj wiertła numer 65, aby wywiercić otwór w środkowym otworze na kołek i użyj gwintownika z podwójnym zerem 99, aby wywiercić gwint. Zamontuj mikronapęd i mosiężne płytki.

Włóż przez pierwszą mosiężną płytkę, przez gwint kołka głównego, a następnie przez drugą mosiężną płytkę. Na koniec umieść nakrętkę na i delikatnie dokręć zmontowany mikronapęd. kołki razem z mosiężnymi płytkami i nakrętkę razem z końcówką.

Następnie mikronapęd do obudowy mikrodysku w czterech punktach po bokach mosiężnych płytek mikronapędu. Za pomocą kleju epoksydowego przyklej sześciomilimetrową rurkę ze stali nierdzewnej do małej półokrągłej szczeliny w dolnej części obudowy mikronapędu. Przyklej rurkę ze stali nierdzewnej o długości trzech milimetrów do główki sworznia, tak aby była wyrównana z rurką o długości sześciu milimetrów na obudowie.

Włóż przygotowane rurki silikonowe i poliimidowe do dwóch rurek ze stali nierdzewnej i użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przykleić je do rurki ze stali nierdzewnej przymocowanej do listwy kołkowej. Następnie przykręć mikronapęd do końca i odetnij nadmiar rurki od góry i od dołu dwóch stalowych rur. Następnie przytnij dwa gołe srebrne druty o średnicy 75 mikrometrów na długość 12 centymetrów i je zarówno do połączenia uziemiającego w płytce interfejsu elektrody, jak i do wszystkich nieużywanych kanałów.

Wciśnij jeden z przygotowanych drutów wolframowych do jednego z otworów 16-kanałowej płytki interfejsu elektrody. Umieść szpilkę w otworze i dociśnij ją szczypcami. Zmierz rezystancję między stykiem a niekodowaną stroną przewodu, aby sprawdzić połączenie.

Powtórz ten proces dla wszystkich przygotowanych drutów, w tym jednego drutu o długości 50 mikrometrów dla elektrody referencyjnej. Następnie zgrupuj druty elektrody w dwie grupy po cztery druty każda i sklej je ze sobą za pomocą taśmy klejącej na końcu każdego drutu, pozostawiając drut odniesienia w spokoju. Przytrzymaj płytkę interfejsu elektrody nad zmotoryzowanym urządzeniem obrotowym i umieść koniec taśmy klejącej z jednej grupy czterech przewodów na urządzeniu.

Wykonaj 130 rund zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 20 obrotów w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Następnie nałóż klej cyjanoakrylowy, aby pokryć tetrodę. Po utwardzeniu kleju przeciąć tetrodę blisko taśmy klejącej.

Powtórz ten proces obracania, klejenia i cięcia do drugiej tetrody. Najpierw przymocuj obudowę mikrodysku do skrzynki rejestratora za pomocą dwóch milimetrowych. Przeciągnij tetrody i elektrodę odniesienia przez otwór z tyłu obudowy mikronapędu.

Przeciągnij tetrody przez dwie silikonowe rurki i przeciągnij drut wolframowy o grubości 50 mikrometrów przez rurkę poliimidową. Przykręć mikro nurkowanie do końca i nałóż klej cyjanoakrylowy na górną część rurek, aby przykleić tetrody i druty do ich rurek i upewnić się, że ruch jest zgodny z mikronapędem. Przykręć mikronapęd do samej góry.

Nałóż miękką ropę naftową na odsłoniętą tetrodę i przewody wewnątrz obudowy mikronapędu, aby zapobiec ruchowi. Przymocuj wstępnie wycięte dolne okno szalki Petriego z przodu obudowy mikrodysku za pomocą żywicy epoksydowej, upewniając się, że przewody uziemiające znajdują się na zewnątrz okna. Następnie nałóż powłokę wulkanizacyjną w temperaturze pokojowej na odsłonięte tetrody i przewody między pokrywą rejestratora a obudową mikronapędu.

Użyj ostrych nożyczek, aby przyciąć tetrody i drut odniesienia do żądanej długości. Następnie przymocuj zaznaczoną, wydzielającą się piankę polistyrenową do pudełka. Dostosuj jego rozmiar tak, aby jego wyporność była zrównoważona po zanurzeniu w kąpieli wodnej.

Po znieczuleniu ryby wyjmij rybę z wody i umieść ją w uchwycie. Użyj sterylnej szpatułki, aby nałożyć pięcioprocentową pastę lidokainy na skórę powyżej wyznaczonego miejsca operacji przez 10 minut. Następnie usuń lidokainę.

Użyj sterylnego skalpela z ostrzem numer 15, aby usunąć skórę nad czaszką w obszarze przeznaczonym dla implantu. Następnie użyj wiertła dentystycznego z wiertłami o średnicy 0,7 milimetra, aby wywiercić cztery otwory w czaszce. Nałóż klej cyjanoakrylowy na jeden z otworów i natychmiast włóż o długości jednego milimetra.

Powtórz ten proces dla pozostałych wywierconych otworów. Następnie użyj wypalarki do zębów, aby nałożyć cement dentystyczny na i na obrzeża odsłoniętej czaszki. Za pomocą wiertła dentystycznego wykonaj otwór o średnicy pięciu milimetrów nad interesującym Cię obszarem mózgu.

Użyj cienkiej pęsety i miękkiej bibuły, aby usunąć tkankę tłuszczową między czaszką a mózgiem i odsłonić obszar mózgu, uważając, aby nie uszkodzić dużych naczyń krwionośnych pod czaszką. Najpierw opuść implant tak, aby elektrody zostały wprowadzone do mózgu, podczas gdy dolna część obudowy mikrodysku znajduje się w pobliżu czaszki. Rozpocznij mocowanie implantu do czaszki, nakładając niewielką ilość cementu dentystycznego między obudowę a najbliższą czaszki.

Po utwardzeniu pierwszej części cementu dentystycznego nałóż dodatkowy cement dentystyczny i zamknij otwór nad czaszką i całą odsłoniętą czaszkę. Po przepłukaniu skrzeli ryby świeżą wodą, aby ją obudzić, wyjmij rybę z uchwytu i umieść ją z powrotem w zbiorniku domowym. Upewnij się, że ryba jest w stanie swobodnie pływać z implantem.

Celem tych eksperymentów jest zbadanie, w jaki sposób aktywność neuronalna pojedynczych komórek koduje zachowanie ryb. Aby to osiągnąć, do kresomózgowia swobodnie pływającej złotej rybki wszczepia się matrycę tetrodową, która pozwala na rejestrację aktywności neuronalnej. Aktywność mózgu podczas rejestrowania jest digitalizowana z częstotliwością 31 250 Hz i filtrowana przez rejestrator danych z częstotliwością górnoprzepustową do 300 Hz.

Następnie w trybie offline do sygnałów stosowany jest filtr przejścia zakazu, a wstępnie posortowane surowe dane są rozdzielane na kanał każdej tetrody i kanał odniesienia. Kolejne popularne algorytmy sortowania szczytów są używane do charakteryzowania aktywności pojedynczej komórki. Najpierw każdy kanał jest ręcznie filtrowany według minimalnego progu amplitudy skoku.

Kolce, które pojawiły się w więcej niż jednej tetrodzie lub w kanale referencyjnym, są również filtrowane. Wykryte skoki są następnie ręcznie grupowane i filtrowane według kształtu, długości, interwału między spajkami i analizy głównych składowych. Ważne jest, aby przed zabiegiem sprawdzić integralność implantu.

Tetrodę można sprawdzić za pomocą standardowego miernika impedancji, a skrzynkę należy sprawdzić pod wodą pod wodą. Ta metoda może być zmodyfikowana tak, aby działała z wieloma zwierzętami wodnymi, o ile są wystarczająco duże, aby utrzymać system. Pozwala to na zbadanie mechanizmu neuronalnego, który leży u podstaw ich zachowania.