Name: Badanie adsorpcji krótkich peptydów na zdyspergowanych nanocząstkach nieorganicznych w roztworze metodą zubożenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę badania adsorpcji dipeptydów na dwutlenku tytanu w roztworze metodą zubożenia. Technika ta pozwala wyznaczyć stałe fizykochemiczne i izotermy adsorpcji dla badań w nanotechnologii i biotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta finansowo przez Rosyjską Fundację Badań Podstawowych (Grant nr 15-03-07834-a).

1. Przygotowanie roztworów podstawowych dipeptydów i rozcieńczeń
<ol>
	<li>Przygotowanie 16 mM roztworu dipeptydu
	<ol>
		<li>Umieścić 0,183 g dipeptydu (Ile-His) (patrz Tabela Materiałów) w sterylnej polimerowej probówce, rozcieńczyć do 35 ml wodą podwójnie destylowaną (DDW) i rozpuścić w temperaturze pokojowej (RT) pod energicznym mieszaniem. 
		UWAGA: Jeśli dipeptyd nie rozpuści się w DDW podczas mieszania, umieść roztwór dipeptydu w łaźni ultradźwiękowej i sonikuj przez kilka minut.</li>
		<li>Przygotować 50 mM roztwór buforu kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), rozpuszczając 0,533 g suchego kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego w 50 ml DDW w sterylnej probówce. Przygotować 50 mM roztwór wodorotlenku sodu, rozpuszczając 200 mg wodorotlenku sodu w 100 ml DDW.</li>
		<li>Dostosować pH wstępnie rozpuszczonego roztworu dipeptydu do 7,4, ostrożnie dodając (miareczkowanie mikrolitrowe) 50 mM MES lub 50 mM wodorotlenku sodu do 16 mM roztworu dipeptydu, mieszając w temperaturze pokojowej i monitorując pH za pomocą pH-metru. Po dostosowaniu pH wlej roztwór do cylindra miarowego, przepłucz probówkę i napełnij cylinder miarowy DDW do 40 ml, aby uzyskać końcowe stężenie 16 mM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie rozcieńczeń dipeptydów z 16 mM roztworu podstawowego
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory peptydów o stężeniach między 0,4 a 12,0 mM, rozcieńczając 16 mM roztwór dipeptydu DDW. Na przykład, aby przygotować roztwór dipeptydu o stężeniu 8 mM, należy dodać 7 ml DDW do 10 ml roztworu dipeptydu o stężeniu 16 mM. Po rozcieńczeniu dostosować pH do 7,4, dodając kropla po kropli 50 mM MES lub 50 mM NaOH do roztworu dipeptydu (patrz krok 1.1.3). Po wyregulowaniu pH wlej roztwór do cylindra miarowego, przepłucz probówkę i napełnij cylinder miarowy do 20 ml DDW, aby stężenie dipeptydu wynosiło 8 mM. 
		UWAGA: Inne rozcieńczenia 16 mM roztworu podstawowego dipeptydu o stężeniach 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 i 12,0 mM przygotowuje się zgodnie z Rysunek 1. Dostosowanie pH każdego roztworu dipeptydu do 7,4 opisano w kroku 1.1.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie solu tytanowego
<ol>
	<li>Przygotować 10 mM roztwór buforu MES, rozpuszczając 1,066 g MES w 500 ml DDW. Dostosować pH do 7,4 za pomocą suchego wodorotlenku sodu po wymieszaniu i monitorowaniu pH za pomocą pH-metru.</li>
	<li>Zmielić 200 mg nanokrystalicznego TiO2 w moździerzu przez co najmniej 5 minut (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odważyć 40 mg zmielonych nanocząstek ditlenku tytanu do kolby laboratoryjnej. Umieścić kolbę w łaźni sonizacyjnej (patrz Tabela Materiałów) za pomocą stanowiska laboratoryjnego.</li>
	<li>Dodać 20 ml 10 mM buforu MES do kolby z TiO2 i sonikować w łaźni ultradźwiękowej (5 l, 40 kHz, 120 W) przez 20 minut.</li>
</ol>
3. Mieszanie i termostatowanie
<ol>
	<li>Ustaw termostat (patrz Tabela materiałów) na żądane temperatury (tj. 0.00, 10.00, 20.00, 30.00 lub 40.00 °C).</li>
	<li>Dodać 1 ml sonikowanego zolu TiO2 do oznaczonych fiolek adsorpcyjnych. Umieścić oznaczone fiolki adsorpcyjne w odpowiednim rozcieńczeniu dipeptydowym w prowizorycznym urządzeniu flotacyjnym wykonanym z ekstrudowanej pianki polistyrenowej. Umieścić urządzenie flotacyjne z oznaczonymi fiolkami i odpowiadającymi im rozcieńczeniami dipeptydów w termostacie na co najmniej 5 minut.</li>
	<li>Dodać 1 ml każdego rozcieńczenia dipeptydu do odpowiedniej oznaczonej fiolki adsorpcyjnej, upewniając się, że wszystkie roztwory do mieszania mają tę samą temperaturę. Utrzymać serię otrzymanych próbek adsorpcyjnych na termostacie w temperaturze 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 lub 40,00 °C przez 24 godziny, aby osiągnąć równowagę adsorpcji. 
	UWAGA: Ostrożnie wstrząśnij wszystkimi próbkami uzyskanych dyspersji przed włożeniem ich do termostatu.</li>
	<li>Od czasu do czasu mieszaj dyspersje TiO2, ręcznie potrząsając nimi podczas termostatowania.</li>
</ol>
4. Filtracja próbek termostatyzowanych
<ol>
	<li>Aby uniknąć przywrócenia równowagi wywołanej temperaturą, należy wyjmować jedną próbkę na raz z termostatu w celu filtracji.</li>
	<li>Pobrać próbkę roztworu dipeptydu z każdej szklanej fiolki za pomocą strzykawki, przez igłę strzykawki. Wyjąć igłę ze strzykawki i założyć filtr strzykawkowy (patrz Tabela materiałów) w celu przefiltrowania roztworu dipeptydu do szklanej fiolki. Powtórzyć filtrację z pozostałymi próbkami.</li>
	<li>Analizować filtrat zgodnie z sekcją 5. 
	UWAGA: Nie należy odwirowywać próbek, ponieważ zajmuje to kilka minut i może spowodować zmianę równowagi stężeń.</li>
</ol>
5. Derywatyzacja i analiza HPLC
<ol>
	<li>Przygotować 50 ml roztworu kwasu trifluorooctowego (TFA) w acetonitrylu. Dodać 0,34 ml TFA do cylindra miarowego i dostosować objętość roztworu do 50 ml z acetonitrylem w temperaturze RT. 
	UWAGA: Pracuj z TFA pod wyciągiem z wentylacją, ponieważ kwas trifluorooctowy jest szkodliwy przy wdychaniu, powoduje poważne oparzenia skóry i jest toksyczny dla organizmów wodnych nawet w niskich stężeniach53.</li>
	<li>Przygotować roztwór do derywatyzacji (tj. odczynnik Edmana54), umieszczając 299 μl izotiocyjanianu fenylu i 347 μl trietyloaminy w cylindrze miarowym i dostosowując objętość roztworu do 50 ml acetonitrylu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przed analizą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) próbki należy poprowadzić odczynnikiem Edmana w fiolkach chromatograficznych. Zmieszać 400 μl próbki z 400 μl odczynnika Edmana. Podgrzewać próbkę w temperaturze 60 °C przez 15 minut. Po podgrzaniu zneutralizować próbkę 225 μl roztworu TFA i odczekać kilka minut, aby schłodzić próbkę do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę HPLC (patrz tabela materiałów) w celu określenia stężenia roztworu dipeptydu przed i po adsorpcji. Umieścić fiolki chromatograficzne z analizowanymi roztworami w autosamplerze HPLC i rozpocząć analizę próbek w niezbędnych warunkach, które są ustawiane przez oprogramowanie (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Faza ruchoma składa się z 0,1% TFA w wodzie dejonizowanej i czystego acetonitrylu, z gradientami acetonitrylu od 20-90% przy 286 nm przez 13 min. Przeanalizować każdą próbkę w trzech egzemplarzach. Zmierz stężenie roztworu dipeptydu, korzystając z wcześniej ustalonej krzywej kalibracyjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Specyfikacje chromatograficzne patrz Shchelokov et al.55.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Adsorpcja z roztworów do budowy izotermy wymaga dłuższego czasu na zrównoważenie ze względu na ograniczenia kinetyczne i sorbenty o dużej powierzchni właściwej. Ponadto podczas adsorpcji aminokwasów należy wziąć pod uwagę niestabilność zoli, agregatów nanocząstek, krystaliczność, rozkład wielkości nanocząstek, pH roztworu oraz konkurencję o adsorpcję. Jednak budowa izotermy adsorpcyjnej przy użyciu metody zubożenia pozostaje najbardziej dostępną metodologią, ponieważ nie wymaga kosztownych konfiguracji, a mimo to dostarc...

Przez ostatnie 50 lat interakcja między powierzchniami nieorganicznymi a peptydami przyciągała wiele uwagi ze względu na jej duże znaczenie w materiałoznawstwie i medycynie. Badania biomedyczne koncentrują się na kompatybilności i stabilności powierzchni bionieorganicznych, co ma bezpośrednie implikacje dla medycyny regeneracyjnej, inżynierii tkankowej1,2,3, oraz implantation4,5,6,7. Współczesne urządzenia reagujące biologicznie, takie jak czujniki i siłowniki, opierają się na funkcjonalnych białkach unieruchomionych na tlenkowych powierzchniach półprzewodnikowych8,9,10,11,12,13. Nowoczesne praktyki oczyszczania w produkcji białek często opierają się na właściwościach interakcji biomolekuł w dalszym oczyszczaniu i separacji14.
Wśród wielu nieorganicznych tlenków, dwutlenek tytanu pozostaje najczęściej wykorzystywany w połączeniu z biologicznie istotnymi substratami15,16. Badania w dziedzinie biointerfejsów opartych na TiO2 koncentrowały się na ustaleniu silnego i specyficznego wiązania białek i peptydów bez zmiany ich właściwości biologicznych i strukturalnych. Ostatecznym celem jest warstwa biomolekuł o dużej gęstości powierzchniowej o wysokiej stabilności i zwiększonej funkcjonalności, która przyczyni się do rozwoju biotechnologicznych i medycznych zastosowań na bazie tytanu17.
Tytan i jego stopy są szeroko stosowane jako materiał do produkcji implantów chirurgicznych od co najmniej sześciu dekad, ponieważ warstwa TiO2 o grubości kilku nanometrów jest odporna na korozję i wykazuje wysoki poziom biokompatybilności w wielu zastosowaniach in vivo18,19,20. Dwutlenek tytanu jest również powszechnie uważany za substrat nieorganiczny wytwarzany w procesie biomineralizacji, gdzie zarodkowanie i wzrost fazy nieorganicznej, któremu towarzyszą białka i peptydy, mogą dostarczyć materiałów o obiecujących właściwościach katalitycznych i optycznych21,22,23,24.
Biorąc pod uwagę wysokie znaczenie interakcji między materiałami nieorganicznymi i biomolekułami w ogóle, a interakcji białko-TiO2 w szczególności, przeprowadzono wiele badań dotyczących manipulacji i kontroli adsorpcji białek na TiO2. Dzięki tym badaniom ujawniono pewne podstawowe właściwości tej interakcji, takie jak kinetyka adsorpcji, pokrycie powierzchni i konformacja biomolekuł, co stanowi istotne wsparcie dla dalszych postępów w biointerfejsach5,13.
Jednakże, złożoność białek znacznie utrudnia pełne określenie i zrozumienie interakcji białka na poziomie molekularnym z powierzchniami nieorganicznymi. Zakładając, że biomolekuły oddziałują z powierzchniami nieorganicznymi poprzez ograniczone miejsca, niektóre białka o znanych strukturach i sekwencjach aminokwasów zostały zredukowane do ich składników - peptydów i aminokwasów - które są badane oddzielnie. Niektóre z tych peptydów wykazały znaczącą aktywność, co czyni je unikalnym przedmiotem badań adsorpcji bez konieczności uprzedniej separacji białek25,26,27,28,29,30.
Ilościowa charakterystyka adsorpcji peptydów na TiO2 lub innych powierzchniach nieorganicznych może być osiągnięta za pomocą metod fizycznych, które zostały specjalnie dostosowane do biomolekuł w ciągu ostatnich kilku dekad. Metody te obejmują izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC), powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), mikrowagę kryształów kwarcu (QCM), fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) i spektroskopię całkowitego odbicia tłumionego (ATR), z których wszystkie pozwalają na wykrycie siły adsorpcji poprzez dostarczenie kluczowych danych termodynamicznych: stałej wiązania, energii swobodnej Gibbsa, entalpii i entropii31.
Adsorpcja biomolekuł w materiale nieorganicznym może być realizowana na dwa sposoby: 1) ITC jak również metoda zubożenia wykorzystują cząstki rozproszone w roztworze wiążące się z ustalonymi powierzchniami makroskopowymi; 2) SPR, QCM, TIRF i ATR wykorzystują makroskopowe powierzchnie zmodyfikowane materiałem nieorganicznym, takim jak odpowiednio szkło lub wióry metalowe pokryte złotem, kryształy kwarcu, kryształy siarczku i wióry PMMA.
Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) to bezznacznikowa metoda fizyczna, która mierzy ciepło wytwarzane lub zużywane podczas miareczkowania roztworów lub mieszanin heterogenicznych. Czułe ogniwa kalorymetryczne wykrywają efekty cieplne już od 100 nanodżuli, dzięki czemu możliwy jest pomiar ciepła adsorpcji na powierzchniach nanocząstek. Zachowanie termiczne sorbinianu podczas ciągłego miareczkowania addycyjnego, zapewnia pełny profil termodynamiczny oddziaływania, ujawniając entalpię, stałą wiązania i entropię w danej temperaturze32,33,34,35,36.
Spektroskopia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) jest powierzchniowo czułą techniką optyczną opartą na pomiarze współczynnika załamania światła w bliskiej odległości od badanej powierzchni. Jest to metoda monitorowania adsorpcji odwracalnej i grubości warstwy adsorpcyjnej w czasie rzeczywistym bez użycia etykiet. Stałą wiązania można obliczyć na podstawie współczynników asocjacji i dysocjacji. Eksperymenty adsorpcyjne przeprowadzone w różnych temperaturach mogą dostarczyć informacji o zależności energii aktywacji od temperatury i sekwencyjnie innych parametrów termodynamicznych37,38,39.
Metoda mikrobalansu kryształu kwarcu (QCM) mierzy zmianę częstotliwości oscylacji kryształów piezoelektrycznych podczas procesów adsorpcji i desorpcji. Stałą wiązania można obliczyć na podstawie stosunku stałych szybkości adsorpcji i desorpcji. QCM jest używany do pomiarów masy względnej i dlatego nie wymaga kalibracji25,27,40. QCM służy do adsorpcji zarówno z gazu, jak i cieczy. Technika ciekła pozwala na wykorzystanie QCM jako narzędzia analitycznego do opisu osadzania na różnie zmodyfikowanych powierzchniach41.
Całkowita fluorescencja wewnętrznego odbicia (TIRF) to czuła optyczna technika międzyfazowa oparta na pomiarze fluorescencji zaadsorbowanych fluoroforów wzbudzonych wewnętrznie odbitymi falami ulotnymi. Metoda pozwala na detekcję cząsteczek fluorescencyjnych pokrywających powierzchnię o grubościach rzędu kilkudziesięciu nanometrów, dlatego znajduje zastosowanie w badaniu adsorpcji makromolekularnej na różnych powierzchniach42,43. Monitorowanie in situ dynamiki fluorescencji podczas adsorpcji i desorpcji dostarcza kinetyki adsorpcji, a tym samym danych termodynamicznych42,43.
Osłabiony całkowity współczynnik odbicia (ATR) został użyty przez Roddicka-Lanzilottę do ustalenia izoterm adsorpcji lizyny na podstawie pasm widmowych lizyny na 1,600 i 1,525 cm-1. Jest to pierwszy raz, kiedy stała wiązania peptydu na TiO2 została określona za pomocą metody podczerwieni in situ44. Technika ta okazała się skuteczna w ustalaniu izoterm adsorpcji dla peptydów polilizynowych45 i aminokwasów kwaśnych46.
W przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, gdzie parametr adsorpcji jest mierzony in situ, w konwencjonalnym eksperymencie ilość zaadsorbowanych biomolekuł jest mierzona przez zmianę stężenia po zetknięciu się powierzchni z roztworem. Ponieważ stężenie sorbinianu ulega zanikowi w zdecydowanej większości przypadków adsorpcji, metoda ta jest określana jako metoda zubożenia. Pomiary stężenia wymagają zwalidowanego testu analitycznego, który może być oparty na wewnętrznej właściwości analitycznej sorbatu lub na etykiecie47,48,49,50 lub derywatyzacja51,52.
Eksperymenty z adsorpcją przy użyciu QCM, SPR, TIRF lub ATR wymagają specjalnego przygotowania powierzchni chipów i czujników używanych do badań adsorpcji. Przygotowane powierzchnie powinny być używane jednorazowo i wymagać zmiany po zmianie adsorbatu, ze względu na nieuniknione uwodnienie powierzchni tlenku lub możliwą chemisorpcję sorbinianu. Tylko jedna próbka na raz może być badana przy użyciu ITC, QCM, SPR, TIRF lub ATR, podczas gdy w metodzie zubożenia można uruchomić dziesiątki próbek, dla których ilość jest ograniczona tylko wydajnością termostatu i dostępnością sorbentu. Jest to szczególnie ważne w przypadku przetwarzania dużych partii próbek lub bibliotek cząsteczek bioaktywnych. Co ważne, metoda depletion nie wymaga kosztownego sprzętu, a jedynie termostatu.
Jednakże, pomimo swoich oczywistych zalet, metoda wyczerpania wymaga skomplikowanych procedur, które mogą wydawać się uciążliwe. W artykule przedstawiono, jak przeprowadzić kompleksowe badanie fizykochemiczne adsorpcji dipeptydów na TiO2 przy użyciu metody zubożenia oraz omówiono problemy, z którymi mogą się spotkać badacze podczas wykonywania odpowiednich eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-(N-Morfolino)etanosulfonowy</td><td>TCI Chemicals</td><td>4432-31-9</td><td>MES, >98%</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Panreac AppliChem</td><td></td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Fiolki</td><td></td><td></td> chromatograficzne <td>szklane</td></tr><tr><td>Dipeptyd Ile-His</td><td>Bachem</td><td>4000894</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> podwójnie destylowana <td>DDW została uzyskana na miejscu</td></tr><tr><td>Kąpiel grzewcza czyszcząca "Ultrasons-HD"</td><td>J.P. Selecta</td><td>3000865</td><td>5 L, 40 kHz, 120 Watts</td></tr><tr><td>Wysokowydajny system chromatografu cieczowego wyposażony w UV&minus; detektor vis</td><td>Shimadzu, LC-20 Prominence</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=67-63-0&amp; interface=CAS%20No.& lang=en& region=US& focus=produkt" target="_blank">67-63-0</a></td><td>99.70%</td></tr><tr><td>LabSolutions Lite</td><td>Shimadzu</td><td>223-60410</td><td>Oprogramowanie do wysokowydajnego systemu chromatografii cieczowej</td></tr><tr><td>Nanokrystaliczna TiO2</td><td></td><td></td><td>Czysta anataz o co najmniej 99% krystaliczności. Średnia wielkość cząstek 10,62 &plusmn; 3,31 nm. Powierzchnia właściwa 131,9 m2/g (BET). Patrz Langmuir 2019, 35, 538&minus; 550, po szczegóły.</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fenylu</td><td>Acros Organics</td><td>103-72-0</td><td>PITC, 98%</td></tr><tr><td>Kolumna Zorbax z odwróconymi fazami</td><td>ZORBAX LC</td><td></td><td>150 razy; średnica wewnętrzna 2,5 mm o średniej wielkości cząstek 5 & mu; m</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Vladfilter</td><td></td><td>25 mm, 0,2 &mu; m pore, octan celulozy</td></tr><tr><td>Test sterylnej rurki</td><td></td><td></td> polimerowej Termostat <td>polipropylenowy</td></tr><tr><td>TC-502</td><td>Brookfield</td><td></td><td>Chłodnicza/podgrzewająca kąpiel cyrkulacyjna z programowalnym sterownikiem do derywatyzacji</td></tr><tr><td>próbki Trietyloamina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=121-44-8&amp; interface=CAS%20No.& N=0& mode=częściowymax& lang=en& region=RU& focus=produkt" target="_blank">121-44-8</a></td><td>HERBATA; 99%</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Panreac AppliChem</td><td>163317</td><td>TFA, 99%</td></tr></tbody></table>

badanie adsorpcji krótkich peptydów na zdyspergowanych nanocząstkach nieorganicznych w roztworze metodą zubożenia

Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method

Podstawy interakcji nieorganiczno-organicznych są niezwykle ważne dla odkrywania i rozwoju nowych biointerfejsów, które można wykorzystać w biotechnologii i medycynie. Ostatnie badania wskazują, że białka oddziałują z powierzchniami poprzez ograniczone miejsca adsorpcji. Fragmenty białek, takie jak aminokwasy i peptydy, można wykorzystać do modelowania interakcji między złożonymi makrocząsteczkami biologicznymi a powierzchniami nieorganicznymi. W ciągu ostatnich trzech dekad opracowano wiele ważnych i czułych metod pomiaru podstaw chemii fizycznej tych oddziaływań: kalorymetria miareczkowa izotermiczna (ITC), powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), mikrowaga kryształu kwarcu (QCM), fluorescencja całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) i spektroskopia całkowitego odbicia tłumionego (ATR).
Najprostszą i najtańszą techniką pomiaru adsorpcji jest metoda zubożenia, gdzie zmiana stężenia sorbinianu (wyczerpanie) po kontakcie z sorbentem zdyspergowanym w roztworze jest obliczana i zakłada się, że jest zaadsorbowany. Izotermy adsorpcji oparte na danych o zubożeniu dostarczają wszystkich podstawowych danych fizykochemicznych. Jednak adsorpcja z roztworów wymaga dłuższych czasów równowagi ze względu na ograniczenia kinetyczne i sorbenty o dużej powierzchni właściwej, co sprawia, że prawie nie ma zastosowania do makroskopowych powierzchni o stałej płaszczyźnie. Ponadto podczas badania peptydów adsorpcyjnych należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak niestabilność zoli, agregaty nanocząstek, krystaliczność sorbentu, rozkład wielkości nanocząstek, pH roztworu i konkurencja o adsorpcję. Konstrukcja izotermy danych o zubożeniu dostarcza kompleksowych danych z zakresu chemii fizycznej dla dosłownie każdego rozpuszczalnego sorbinianu, a jednocześnie pozostaje najbardziej dostępną metodologią, ponieważ nie wymaga kosztownych konfiguracji. W artykule opisano podstawowy protokół eksperymentalnego badania adsorpcji peptydów na tlenku nieorganicznym i omówiono wszystkie punkty krytyczne, które wpływają na ten proces.

Adsorpcję dipeptydu na nanokrystalicznym dwutlenku tytanu badano w warunkach biokompatybilnych w zakresie temperatur 0−40 °C. Eksperymentalną adsorpcję dipeptydu (A, mmol/g) na powierzchni dwutlenku tytanu oceniono jako
<img src="/files/ftp_upload/60526/60526eq1.jpg" alt="Wzór na pojemność adsorpcyjną A=V(C₀-Cₑ)/m, stosowany w analizie chemicznej, równowaga statyczna." data-altupdatedat="1788250015000">
<p class="jove_conten...

Pierwszym krokiem do zrozumienia interakcji biomolekuła z nieorganiczną fazą stałą jest odkrycie podstawowych stałych fizykochemicznych, które mogą być oceniane poprzez ustalenie izoterm adsorpcji. Adsorpcja w fazie ciekłej jest ograniczona przez kinetykę, pojemność powierzchniową, pH i adsorpcję konkurencyjną, które należy ostrożnie rozważyć przed rozpoczęciem eksperymentu adsorpcji.

Badanie adsorpcji krótkich peptydów na zdyspergowanych nanocząstkach nieorganicznych w roztworze metodą zubożenia

Fundamentals of inorganic-organic interactions are critically important in the discovery and development of novel biointerfaces amenable for utilization ...

Wzajemne oddziaływanie białek i peptydów z materiałem nieorganicznym jest fundamentalnym zjawiskiem, które ma implikacje dla nanotechnologii, biomateriałów i biotechnologii. Pierwszym krokiem do zrozumienia tego zjawiska jest ujawnienie podstawowych stałych fizykochemicznych, takich jak stała adsorpcji, energia swobodna Gibbsa, entalpia, entropia i ograniczona adsorpcja, które można ocenić poprzez ustalenie izoterm adsorpcji. Jednak adsorpcja z fazy ciekłej jest ograniczona kinetyką, pojemnością powierzchniową, pH i adsorpcją porównawczą, które należy świadomie rozważyć przed rozpoczęciem eksperymentu.W tym filmie moi koledzy Elena Korina i Sergei Neifert przedstawią fizykochemiczne badanie adsorpcji dipeptydów na dyspersyjnym roztworze dwutlenku tytanu pokrywającym cechy preparatu, które pomogą uniknąć ukrytych zagrożeń, z którymi naukowcy mogą się spotkać podczas przeprowadzania odpowiednich eksperymentów. Umieścić 183 miligramy dipeptydu w sterylnej polimerowej probówce i rozcieńczyć do około 35 mililitrów podwójnie destylowaną wodą i rozpuścić w temperaturze pokojowej pod energicznym mieszaniem. Jeśli dipeptyd nie rozpuści się w podwójnie destylowanej wodzie i mieszając, umieść roztwór dipeptydu w łaźni ultradźwiękowej i sonikuj przez kilka minut.Dostosować pH wstępnie rozpuszczonego roztworu peptydu do 7,4, ostrożnie dodając roztwór MES lub wodorotlenku sodu do roztworu dipeptydu po wymieszaniu w temperaturze pokojowej i monitorowaniu pH za pomocą pH-metru. Po wyregulowaniu pH wlej roztwór do cylindra miarowego. Przepłucz probówkę i napełnij cylinder miarowy podwójnie destylowaną wodą do 40 mililitrów, aby uzyskać końcowe stężenie 16 milimolów.Przygotować rozcieńczenia dipeptydów o stężeniach od 0,4 do 12 milimolowych, rozcieńczając 16-milimolowy roztwór dipeptydu wodą podwójnie destylowaną. Na przykład, aby przygotować ośmiomilimolowy roztwór dipeptydu, dodaj siedem mililitrów podwójnie destylowanej wody do 10 mililitrów 16-milimolowego roztworu dipeptydu. Po rozcieńczeniu dostosować pH do 7,4, dodając kroplami roztwór MES lub wodorotlenku sodu do roztworu dipeptydu.Po wyregulowaniu pH wlej roztwór do cylindra miarowego. Wypłucz probówkę i napełnij cylinder miarowy do 20 mililitrów podwójnie destylowaną wodą, aby uzyskać stężenie ośmiu milimolów. Odpowiednie przygotowania przygotowuje się inne rozcieńczenia roztworu podstawowego dipeptydu.Na końcu otrzymujemy rząd rozcieńczeń dipeptydów gotowych do badań adsorpcji. Przygotować 10-milimolowy roztwór buforowy MES. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą wodorotlenku trisodowego po wymieszaniu i monitorowaniu pH za pomocą pH-metru.To rozwiązanie zostanie użyte do przygotowania podeszwy. Zmielić około 200 miligramów nanokrystalicznego tlenku tytanu w moździerzu przez co najmniej pięć minut. Zważ 40 miligramów zmielonych nanocząstek dwutlenku tytanu.Umieścić kolbę w łaźni sonizacyjnej za pomocą stanowiska laboratoryjnego. Dodać zmielony dwutlenek tytanu w 20 mililitrach buforu MES do kolby za pomocą szklanego lejka i sonikować w kąpieli ultradźwiękowej przez 20 minut. Ustaw termostat na żądaną temperaturę.Dodać jeden mililitr sonikowanej podeszwy dwutlenku tytanu do oznaczonych fiolek adsorpcyjnych. Umieścić oznaczone fiolki adsorpcyjne w stosunku do odpowiednich rozcieńczeń w improwizowanym pływającym urządzeniu wykonanym ze styropianu i włożyć je do termostatu w celu zrównoważenia temperatury przez co najmniej pięć minut. Następnie dodaj jeden mililitr rozcieńczenia dipeptydu do odpowiedniej oznaczonej fiolki adsorpcyjnej, upewniając się, że wszystkie roztwory mieszające mają tę samą temperaturę.Serię otrzymanych próbek adsorpcji należy przechowywać w termostacie przez 24 godziny, aby osiągnąć równowagę adsorpcji. Od czasu do czasu mieszaj dyspersje tlenku tytanu podczas termostatowania. Aby uniknąć ponownej równowagi wywołanej temperaturą, należy wyjmować jedną próbkę z termostatu w celu filtracji na raz.Pobrać próbkę roztworu dipeptydu z każdej szklanej fiolki za pomocą strzykawki. Wyjąć igłę ze strzykawki i założyć filtr strzykawkowy, aby przefiltrować roztwór dipeptydu do szklanej fiolki. Powtórzyć filtrację z próbkami o innych stężeniach.Teraz próbki te są gotowe do analizy. Przygotuj 50 mililitrowy roztwór TFA w acetonitrylu. Wstrzyknąć 0,34 mililitra TFA do cylindra miarowego i dostosować objętość roztworu do 50 mililitrów acetonitrylem w temperaturze pokojowej.Przygotować roztwór do derywatyzacji. Wlej 299 mikrolitrów fenyloizotiocyjanianu i 347 mikrolitrów trietyloaminy do cylindra miarowego i napełnij cylinder do 50 mililitrów acetonitrylem. Przed analizą wysokosprawnej chromatografii cieczowej należy pochodnąć próbki za pomocą odczynników Edmana w fiolkach chromatograficznych.Wymieszać 400 mikrolitrów próbki z 400 mikrolitrami odczynnika do derywatyzacji. Próbki należy przechowywać w temperaturze 60 stopni przez 15 minut. Po podgrzaniu zneutralizować próbki 225 mikrolitrami roztworu TFA i odczekać kilka minut, aby schłodzić próbkę do temperatury pokojowej.Analizę HPLC należy zastosować w celu określenia stężenia roztworu dipeptydu przed i po adsorpcji. Rozpocznij analizę próbek w niezbędnych warunkach, które są ustawione przez oprogramowanie. Zależności adsorpcji od równowagowego stężenia dipeptydu po adsorpcji, izotermach adsorpcji wykreślono zgodnie z uzyskanymi danymi doświadczalnymi.Pomiary adsorpcji dipeptydów były danymi przetworzonymi przy użyciu modelu Henry'ego. Stałą wiązania równowagi uzyskano ze zbocza zależności adsorpcji dipeptydu od stężenia równowagi dipeptydu. Równanie van't Hoffa zostało użyte do wyznaczenia standardowej energii swobodnej Gibbsa dla każdej temperatury.Wykres na wykresie energii swobodnej w funkcji temperatury, określiliśmy entalpię jako przechwycenie wykresu liniowego z osią energii swobodnej dla dipeptydu. Zmiana entropii dla każdej temperatury została określona na podstawie równania podstawowego. Obliczone wartości stałej wiązania równowagi, standardowej energii swobodnej Gibbsa, entalpii i entropii dla dipeptydu przedstawiono w tabeli pierwszej.Budowa izotermy adsorpcji na podstawie danych o zubożeniu pozostaje najbardziej dostępną metodologią, która nie wymaga kosztownych konfiguracji, dostarczając wyczerpujących danych fizykochemicznych dla dosłownie każdego rozpuszczalnego sorbinianu. W połączeniu z danymi spektroskopowymi lub komputerowymi może ujawnić podstawowe cechy strukturalne złożonego zachowania biomolekuł w kontakcie z nieorganicznymi nanocząstkami.

study-short-peptide-adsorption-on-solution-dispersed-inorganic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano metodę wykorzystania nanoporów w stanie stałym do monitorowania niespecyficznej adsorpcji białek na powierzchni nieorganicznej. Metoda ta opiera się na zasadzie impulsu rezystywnego, co pozwala na badanie adsorpcji w czasie rzeczywistym i na poziomie pojedynczych cząsteczek. Ponieważ proces adsorpcji pojedynczych białek zachodzi daleko od stanu równowagi, proponujemy zastosowanie równoległych macierzy syntetycznych nanoporów, co umożliwia ilościowe wyznaczenie pozornej stałej szybkości...

Monitorowanie adsorpcji białek za pomocą nanoporów w stanie stałym

Miękkie lądowanie masowo wybranych jonów na powierzchniach jest skutecznym podejściem do wysoce kontrolowanego przygotowania nowych materiałów. W połączeniu z analizą za pomocą spektrometrii mas jonów wtórnych in situ (SIMS) i spektroskopii absorpcyjnej odbicia w podczerwieni (IRRAS), miękkie lądowanie zapewnia bezprecedensowy wgląd w interakcje dobrze zdefiniowanych gatunków z powierzchniami.

In Situ Spektroskopia SIMS i IR dobrze zdefiniowanych powierzchni przygotowanych przez miękkie lądowanie jonów o wybranej masie

Nanoskopia sondy koloidalnej może być używana w różnych dziedzinach, aby uzyskać wgląd w fizyczną stabilność i kinetykę krzepnięcia systemów koloidalnych oraz pomóc w odkrywaniu leków i naukach o recepturach przy użyciu systemów biologicznych. Opisana w nim metoda dostarcza ilościowych i jakościowych środków do badania takich systemów.

Ilościowe i jakościowe badanie oddziaływań cząstka-cząstka za pomocą nanoskopii sondy koloidalnej

Formułowanie stabilnych, funkcjonalnych atramentów ma kluczowe znaczenie dla rozszerzenia zastosowań produkcji addytywnej.  Z kolei wiedza na temat mechanizmów wiązania dyspergatora z cząstkami jest niezbędna do skutecznego formułowania tuszu.  Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (DRIFTS) z dyfuzyjnym odbiciem jest przedstawiana jako prosty i niedrogi sposób na uzyskanie wglądu w te mechanizmy.

Spektroskopowa identyfikacja mechanizmów wiązania dyspergatora/cząstek w farbach funkcjonalnych z dyfuzyjnym odbiciem dyfuzyjnym

Ze względu na znaczenie i szerokie zastosowanie palladu, złota i kobaltu w sprzęcie high-tech, ich odzysk i recykling stanowią ważne wyzwanie przemysłowe. Opisany w niniejszym dokumencie system odzysku metali jest prostym, tanim sposobem na skuteczne wykrywanie, usuwanie i odzysk tych metali z kopalni miejskiej.

Wykrywanie i odzyskiwanie palladu, złota i metali kobaltowych z kopalni miejskiej przy użyciu nowatorskich czujników/adsorbentów oznaczonych nanoskalowymi porami w kształcie koła wagonowego

Aby uzyskać podstawowe informacje na temat sorpcji i recyklingu złota z układów wodnych, zbadano oddziaływanie nanocząstek Au(III) i Au(0) na białka warstwy S. Absorpcję polimerów białkowych badano za pomocą ICP-MS, a monowarstw białkowych za pomocą QCM-D. Późniejsze AFM umożliwia obrazowanie nanostruktur.

Interakcja Au polimerów Slp1 i monowarstwy z Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS i AFM jako narzędzia do badań biomolekuł i metali

Opisano protokół syntezy i charakterystyki koloidów pokrytych cząstkami supramolekularnymi. Te supramolekularne koloidy ulegają samoorganizacji po aktywacji wiązań wodorowych między cząsteczkami zakotwiczonymi na powierzchni przez światło UV.

Synteza i charakterystyka koloidów supramolekularnych

Ten protokół opisuje działanie uchwytu na próbki przepływu cieczy do skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej AuNPs w wodzie, używanej do obserwacji dynamicznych procesów w nanoskali.

Badanie procesów dynamicznych nano-rozmiarów obiektów w cieczy za pomocą skaningowej transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru siły oddziaływań między dobrze zdefiniowaną powierzchnią nieorganiczną a peptydami lub aminokwasami za pomocą pomiarów spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Informacje uzyskane z pomiaru są ważne dla lepszego zrozumienia interakcji peptyd-materiał nieorganiczny.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Przedstawiono prosty protokół funkcjonalizacji powierzchni nanodiamentów za pomocą polidopaminy.

Inspirowana biologicznie polidopaminowa modyfikacja powierzchni nanodiamentów i redukcja nanocząstek srebra

Neutralne klastry SO2 o niskiej energii kinetycznej (&lt; 0,8 eV/składnik) są używane do desorpcji złożonych cząsteczek powierzchniowych, takich jak peptydy lub lipidy, do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas przy użyciu spektrometru masowego z pułapką jonową. Nie jest wymagane specjalne przygotowanie próbki i możliwa jest obserwacja reakcji w czasie rzeczywistym.

Analiza złożonych cząsteczek i ich reakcji na powierzchniach za pomocą spektrometrii mas desorpcji/jonizacji indukowanej klastrami

Poznaj metodę badania adsorpcji dipeptydów na dwutlenku tytanu w roztworze metodą zubożenia. Technika ta pozwala wyznaczyć stałe fizykochemiczne i izotermy adsorpcji dla badań w nanotechnologii i biotechnologii.

Badanie adsorpcji krótkich peptydów na zdyspergowanych nanocząstkach nieorganicznych w roztworze metodą zubożenia

Przeglądaj więcej filmów