Badanie adsorpcji krótkich peptydów na zdyspergowanych nanocząstkach nieorganicznych w roztworze metodą zubożenia

Wzajemne oddziaływanie białek i peptydów z materiałem nieorganicznym jest fundamentalnym zjawiskiem, które ma implikacje dla nanotechnologii, biomateriałów i biotechnologii. Pierwszym krokiem do zrozumienia tego zjawiska jest ujawnienie podstawowych stałych fizykochemicznych, takich jak stała adsorpcji, energia swobodna Gibbsa, entalpia, entropia i ograniczona adsorpcja, które można ocenić poprzez ustalenie izoterm adsorpcji. Jednak adsorpcja z fazy ciekłej jest ograniczona kinetyką, pojemnością powierzchniową, pH i adsorpcją porównawczą, które należy świadomie rozważyć przed rozpoczęciem eksperymentu.

W tym filmie moi koledzy Elena Korina i Sergei Neifert przedstawią fizykochemiczne badanie adsorpcji dipeptydów na dyspersyjnym roztworze dwutlenku tytanu pokrywającym cechy preparatu, które pomogą uniknąć ukrytych zagrożeń, z którymi naukowcy mogą się spotkać podczas przeprowadzania odpowiednich eksperymentów. Umieścić 183 miligramy dipeptydu w sterylnej polimerowej probówce i rozcieńczyć do około 35 mililitrów podwójnie destylowaną wodą i rozpuścić w temperaturze pokojowej pod energicznym mieszaniem. Jeśli dipeptyd nie rozpuści się w podwójnie destylowanej wodzie i mieszając, umieść roztwór dipeptydu w łaźni ultradźwiękowej i sonikuj przez kilka minut.

Dostosować pH wstępnie rozpuszczonego roztworu peptydu do 7,4, ostrożnie dodając roztwór MES lub wodorotlenku sodu do roztworu dipeptydu po wymieszaniu w temperaturze pokojowej i monitorowaniu pH za pomocą pH-metru. Po wyregulowaniu pH wlej roztwór do cylindra miarowego. Przepłucz probówkę i napełnij cylinder miarowy podwójnie destylowaną wodą do 40 mililitrów, aby uzyskać końcowe stężenie 16 milimolów.

Przygotować rozcieńczenia dipeptydów o stężeniach od 0,4 do 12 milimolowych, rozcieńczając 16-milimolowy roztwór dipeptydu wodą podwójnie destylowaną. Na przykład, aby przygotować ośmiomilimolowy roztwór dipeptydu, dodaj siedem mililitrów podwójnie destylowanej wody do 10 mililitrów 16-milimolowego roztworu dipeptydu. Po rozcieńczeniu dostosować pH do 7,4, dodając kroplami roztwór MES lub wodorotlenku sodu do roztworu dipeptydu.

Po wyregulowaniu pH wlej roztwór do cylindra miarowego. Wypłucz probówkę i napełnij cylinder miarowy do 20 mililitrów podwójnie destylowaną wodą, aby uzyskać stężenie ośmiu milimolów. Odpowiednie przygotowania przygotowuje się inne rozcieńczenia roztworu podstawowego dipeptydu.

Na końcu otrzymujemy rząd rozcieńczeń dipeptydów gotowych do badań adsorpcji. Przygotować 10-milimolowy roztwór buforowy MES. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą wodorotlenku trisodowego po wymieszaniu i monitorowaniu pH za pomocą pH-metru.

To rozwiązanie zostanie użyte do przygotowania podeszwy. Zmielić około 200 miligramów nanokrystalicznego tlenku tytanu w moździerzu przez co najmniej pięć minut. Zważ 40 miligramów zmielonych nanocząstek dwutlenku tytanu.

Umieścić kolbę w łaźni sonizacyjnej za pomocą stanowiska laboratoryjnego. Dodać zmielony dwutlenek tytanu w 20 mililitrach buforu MES do kolby za pomocą szklanego lejka i sonikować w kąpieli ultradźwiękowej przez 20 minut. Ustaw termostat na żądaną temperaturę.

Dodać jeden mililitr sonikowanej podeszwy dwutlenku tytanu do oznaczonych fiolek adsorpcyjnych. Umieścić oznaczone fiolki adsorpcyjne w stosunku do odpowiednich rozcieńczeń w improwizowanym pływającym urządzeniu wykonanym ze styropianu i włożyć je do termostatu w celu zrównoważenia temperatury przez co najmniej pięć minut. Następnie dodaj jeden mililitr rozcieńczenia dipeptydu do odpowiedniej oznaczonej fiolki adsorpcyjnej, upewniając się, że wszystkie roztwory mieszające mają tę samą temperaturę.

Serię otrzymanych próbek adsorpcji należy przechowywać w termostacie przez 24 godziny, aby osiągnąć równowagę adsorpcji. Od czasu do czasu mieszaj dyspersje tlenku tytanu podczas termostatowania. Aby uniknąć ponownej równowagi wywołanej temperaturą, należy wyjmować jedną próbkę z termostatu w celu filtracji na raz.

Pobrać próbkę roztworu dipeptydu z każdej szklanej fiolki za pomocą strzykawki. Wyjąć igłę ze strzykawki i założyć filtr strzykawkowy, aby przefiltrować roztwór dipeptydu do szklanej fiolki. Powtórzyć filtrację z próbkami o innych stężeniach.

Teraz próbki te są gotowe do analizy. Przygotuj 50 mililitrowy roztwór TFA w acetonitrylu. Wstrzyknąć 0,34 mililitra TFA do cylindra miarowego i dostosować objętość roztworu do 50 mililitrów acetonitrylem w temperaturze pokojowej.

Przygotować roztwór do derywatyzacji. Wlej 299 mikrolitrów fenyloizotiocyjanianu i 347 mikrolitrów trietyloaminy do cylindra miarowego i napełnij cylinder do 50 mililitrów acetonitrylem. Przed analizą wysokosprawnej chromatografii cieczowej należy pochodnąć próbki za pomocą odczynników Edmana w fiolkach chromatograficznych

Wymieszać 400 mikrolitrów próbki z 400 mikrolitrami odczynnika do derywatyzacji. Próbki należy przechowywać w temperaturze 60 stopni przez 15 minut. Po podgrzaniu zneutralizować próbki 225 mikrolitrami roztworu TFA i odczekać kilka minut, aby schłodzić próbkę do temperatury pokojowej.

Analizę HPLC należy zastosować w celu określenia stężenia roztworu dipeptydu przed i po adsorpcji. Rozpocznij analizę próbek w niezbędnych warunkach, które są ustawione przez oprogramowanie. Zależności adsorpcji od równowagowego stężenia dipeptydu po adsorpcji, izotermach adsorpcji wykreślono zgodnie z uzyskanymi danymi doświadczalnymi.

Pomiary adsorpcji dipeptydów były danymi przetworzonymi przy użyciu modelu Henry'ego. Stałą wiązania równowagi uzyskano ze zbocza zależności adsorpcji dipeptydu od stężenia równowagi dipeptydu. Równanie van't Hoffa zostało użyte do wyznaczenia standardowej energii swobodnej Gibbsa dla każdej temperatury.

Wykres na wykresie energii swobodnej w funkcji temperatury, określiliśmy entalpię jako przechwycenie wykresu liniowego z osią energii swobodnej dla dipeptydu. Zmiana entropii dla każdej temperatury została określona na podstawie równania podstawowego. Obliczone wartości stałej wiązania równowagi, standardowej energii swobodnej Gibbsa, entalpii i entropii dla dipeptydu przedstawiono w tabeli pierwszej.

Budowa izotermy adsorpcji na podstawie danych o zubożeniu pozostaje najbardziej dostępną metodologią, która nie wymaga kosztownych konfiguracji, dostarczając wyczerpujących danych fizykochemicznych dla dosłownie każdego rozpuszczalnego sorbinianu. W połączeniu z danymi spektroskopowymi lub komputerowymi może ujawnić podstawowe cechy strukturalne złożonego zachowania biomolekuł w kontakcie z nieorganicznymi nanocząstkami.