Obrazowanie uwalniania DPP z dysku skrzydła Drosophila

DPP wpływa na los komórki poprzez wiązanie receptorów i wysyłanie sygnału wewnątrzkomórkowo w celu wpłynięcia na transkrypcję. Jeśli DPP jest wytwarzany, ale nie jest uwalniany, nie ma dostępu do receptorów i dlatego nie może pełnić swoich ról. Technika ta umożliwia wizualizację uwalniania DPP, umożliwiając naukowcom zbadanie, które czynniki genetyczne i środowiskowe zmieniają dynamikę uwalniania DPP.

Szlak sygnałowy BMP jest zachowany od much do ludzi, więc spodziewamy się, że mechanizm, który dyktuje uwalnianie DPP, będzie również istotny dla rozwoju i regeneracji człowieka. Zacznij od skrzyżowania od 30 do 40 dziewiczych samic DPP GAL4 z 10 do 15 samcami much UAS DPP-GFP. Zachęcaj do składania jaj, dodając niewielką ilość pasty drożdżowej do świeżej fiolki z jedzeniem.

Aby zebrać jaja, przełóż skrzyżowane muchy do fiolki i pozwól im złożyć jaja przez trzy do czterech godzin przed ich usunięciem. Przechowywać fiolki do zbierania jaj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około 144 godziny, aż larwy znajdą się w trzecim stadium rozwojowym. Następnie wybierz odpowiednie larwy do sekcji.

Po pierwsze, wybierz larwy, które nie są gruźlicze, które będą normalnej długości, a nie krótkie i grube. Aby wybrać larwy wykazujące ekspresję DPP-GFP, obejrzyj je pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Wszystkie larwy inne niż TB będą miały pewną fluorescencję, ale GFP jest ograniczony do dysków skrzydeł i jest mniej jasny u larw DPP-GFP.

Przygotuj zmodyfikowane podłoże HL3 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, które utrzymają dyski skrzydeł przy życiu do obrazowania. Dostosuj pH do 7,1 za pomocą HEPES, a następnie przefiltruj go przez filtr 0,22 mikrometra. Umieść dwa kawałki bezbarwnej taśmy dwustronnej na szerokość szkiełka mikroskopowego, pozostawiając między nimi odstęp około pięciu milimetrów i upewniając się, że końce taśmy leżą równo z krawędziami szkiełka.

Użyj płaskiej krawędzi, aby mocno docisnąć taśmę do szkiełka. Dodaj 25 mikrolitrów zmodyfikowanego podłoża HL3 między dwa kawałki taśmy. Gdy tarcza skrzydłowa jest zamontowana w nośniku, kawałki taśmy zapobiegną jej zgnieceniu przez szkiełko nakrywkowe.

Aby wypreparować larwę, umieść ją w zmodyfikowanym podłożu HL3 i delikatnie rozerwij na pół za pomocą dwóch par kleszczy. Odrzuć tylną połowę, a następnie chwyć środek przedniej połowy jedną parą kleszczy i użyj drugiej pary, aby wepchnąć haczyki ustne z powrotem do larwy, aż zostanie całkowicie odwrócona. Szukaj ostrych zagięć w dwóch ciemniejszych gałęziach pierwotnych tchawicy, które biegną po obu stronach larwy.

Tarcze skrzydeł leżą bezpośrednio pod spodem. Delikatnie wyjmij krążki i umieść je na nośniku HL3 na przygotowanym szkiełku, upewniając się, że żadne kawałki tchawicy nie są nadal przymocowane do dysków. Ułóż krążki skrzydeł tak, aby perypodialna strona kieszeni skrzydłowej była skierowana do góry, a tarcza leżała płasko.

Przykryj skrzydło szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru natychmiast przystąp do obrazowania. Zobrazuj zamontowany dysk skrzydła za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem olejowym 40X i laserem 488 nanometrów.

Zbieraj obrazy z prędkością dwóch herców przez dwie minuty. Aby uzyskać najlepsze wyniki, ustaw moc lasera na tyle silną, aby uzyskać wyraźny obraz komórek uwalniających DPP, aby uniknąć nadmiernego wybielania. Zbierz obrazy jako szeregi czasowe i wyeksportuj je jako pliki AVI, aby uzyskać film wideo przedstawiający wersję DPP.

Gdy protokół się powiedzie, DPP-GFP pojawia się jako pasek wzdłuż środka dysku skrzydła z jądrami widocznymi jako niefluorescencyjne okręgi. Uwalnianie DPP-GFP jest widoczne jako fluorescencyjne punkty, które pojawiają się i znikają zarówno w ciałach komórek, jak i daleko od nich. Wyraźne punkty są prawdopodobne w cytonemach lub w synapsach cytonemy.

Tarcze skrzydeł są zamontowane w taki sposób, że obrazowanie odbywa się od strony perypodialnej. Jeśli dysk skrzydła jest obrazowany od tyłu, fluorescencja DPP-GFP będzie wydawać się nieostra, a rozdzielczość będzie słaba. Gdy GFP nie jest połączony z DPP, nie obserwuje się żadnych punktów poza ciałami komórkowymi.

Ta kontrolka pokazuje, że DPP-GFP zachowuje się inaczej niż sam GFP. Co więcej, nie pojawiają się punkty fluorescencyjne, gdy DPP-GFP nie ulega ekspresji. Podczas tej procedury ważne jest, aby tarcza skrzydła była zamontowana perypodialną stroną do góry.

Jeśli tarcza skrzydła jest nieprawidłowo zorientowana, DPP-GFP będzie wyglądał na nieostry. Metoda ta może być wykorzystana do badania uwalniania innych rozwojowych ligandów sygnalizacyjnych, takich jak bezskrzydłe lub jeż. Możemy zbadać wszystkie różne czynniki środowiskowe i genetyczne, które mogą wpływać na uwalnianie DPP.

Ponadto możemy zaadaptować tę metodę do badania uwalniania BMP z innych typów komórek.