Name: Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji adhezji komórek nowotworowych do kriosekcji węzłów chłonnych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie procesów metastazy w onkologii molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Rosanie De Pagano i Anie Carolinie Pinheiro Campos za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez granty z: FAPESP - São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) oraz Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).

LN zostały odzyskane ze świeżych zwłok zdrowych dorosłych szczurów rasy Wistar, które zostały uśmiercone przez zwichnięcie szyjki macicy. Postępowaliśmy zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi bólu i stresu u zwierząt laboratoryjnych, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki i Badania na Zwierzętach Instytutu Badań i Edukacji szpitala Sírio-Libanês (CEUA P 2016-04).
UWAGA: Wszystkie świeżo zamrożone tkanki są uważane za biologicznie niebezpieczne i powinny być traktowane przy użyciu odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego.
1. Limfadenektomia i kriosekcja
<ol>
	<li>Świeże tusze dorosłych szczurów rasy Wistar (180-220 g) leżące w pozycji leżącej grzbietowej należy umieścić na czystej desce rozwarstwiającej w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: LN muszą być zebrane do 30 minut po eutanazji.</li>
	<li>Spryskaj tuszę szczura 70% alkoholem izopropylowym i użyj wysterylizowanych narzędzi do zbioru LN.</li>
	<li>Podnieś skórę brzucha za pomocą pęsety i otwórz jamę z nacięciem przyśrodkowym, nie uszkadzając leżącej poniżej tkanki, odsłaniając wnętrzności brzucha. Wyciągnij jelito, a LN klatki piersiowej i jamy brzusznej staną się widoczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Ostrożnie wytnij LN od każdego szczura za pomocą nożyczek z końcówką, aby uniknąć uszkodzenia górnej tętnicy krezkowej leżącej z tyłu. 
	UWAGA: W zależności od lokalizacji wyciętego węzła chłonnego konieczne jest oczyszczenie innych przylegających do niego tkanek, takich jak tkanka krezkowa.</li>
	<li>Zebrać LN do stożkowych probówek o pojemności 15 ml zawierających 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Prawidłowo wyrzuć tusze szczurów.</li>
	<li>Usuń świeże LN z PBS, zwiń i wysusz węzeł na suchej bibule filtracyjnej. Umieść go na małej szalce Petriego i dodaj roztwór do osadzania zamrożonych próbek tkanek (O.C.T.) na 2 minuty.</li>
	<li>Przenieś i zorientuj LN stroną zadrukowaną do dołu w żądanej pozycji w podstawie krioformy, z wystarczającą ilością OCT, aby ją przykryć. Unikaj pęcherzyków w pobliżu tkanki. Powierzchnią przekroju jest spód krioformy.</li>
	<li>Natychmiast zamroź kriodruk w styropianowej chłodziarce z suchym lodem. Gdy nadal pozostaje niewielka część niezamrożonego OCT (~20-35 s), przenieś próbkę na folię aluminiową i umieść ją w chłodziarce z suchym lodem, kontynuując zamrażanie innych próbek. Na koniec przechowywać wszystkie próbki w temperaturze -80 °C do momentu ich podziału.</li>
	<li>Przeciąć LN za pomocą kriostatu regulującego grubość przekroju do 5-8 μm. Przenieść kriosekty na szkiełka mikroskopowe. 
	UWAGA: Przed podziałem na sekcje należy wyjąć zamrożone próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić je do osiągnięcia temperatury w komorze mikrotomu kriostatu wynoszącej -22 °C przez około 30 minut. Szkiełka zawierające LN można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
</ol>
2. Znakowanie komórkowe za pomocą barwników fluorescencyjnych
UWAGA: Barwniki fluorescencyjne są szeroko stosowane w biologii komórki. Preferujemy znakowanie długołańcuchowymi dialkilokarbocyjaninami (DiI(C18), wzbudzenie 549 nm, emisja 565 nm), ponieważ są one jasne, stabilne i mogą być dodawane bezpośrednio do pożywek hodowlanych, nie wpływają na żywotność komórek ani właściwości adhezyjne komórek25,26.
<ol>
	<li>Dysocjuj komórki rosnące w idealnych warunkach (tj. w kompletnym pożywce) i ponownie zawieś w pożywce bez surowicy o gęstości 10-6 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny komórek (106 komórek) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i oznaczyć etykietą Dil(C18) (2 μg/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Po 5 minutach delikatnie porusz probówki, aby uniknąć sedymentacji komórek i niedobarwienia osadzonych komórek. Większe gęstości wymagają dłuższego czasu inkubacji w celu równomiernego barwienia. Optymalny czas inkubacji do barwienia komórek różni się w zależności od linii komórkowej. Można go lepiej określić ilościowo za pomocą konwencjonalnego kanału detekcji cytometrii przepływowej FL2 (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2A).</li>
	<li>Odwirować oznakowane probówki z zawiesiną o masie 300 x g przez 4 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć dwukrotnie w 10 ml podłoża niezawierającego surowicy. Odzyskaj komórki w postaci czerwonych granulek. Zawiesić komórki w stężeniu10-6 komórek/ml w podłożu bez surowicy z 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).</li>
</ol>
3. Wstępne powlekanie naczyń roztworem poli-L-lizyny lub BSA jako kontrola wysiewu (opcjonalnie)
UWAGA: Użyliśmy naczyń do hodowli komórkowych wstępnie pokrytych PLL jako powierzchni do kontroli obciążenia, aby zapewnić, że różne eksperymentalne grupy komórek nowotworowych zostały wysiane w tej samej liczbie, a także powierzchnie pokryte BSA jako kontrole negatywne.
<ol>
	<li>W sterylnych warunkach, w celu przygotowania studzienek pokrytych PLL lub BSA, należy dodać 300 μl PLL (0,1% w/v w H2O) lub BSA (rozcieńczonych w stężeniu 2,5% w/v w H2O) bezpośrednio do płytki 24-dołkowej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przez aspirację, delikatnie spłukać powierzchnię sterylnym PBS i wysuszyć płytkę na powietrzu w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowych przed wysiewem komórek. 
	UWAGA: Końcowe objętości PLL lub BSA należy dostosować do obszaru różnych płyt dołkowych.</li>
</ol>
4. Wysiewanie komórek nowotworowych znakowanych fluorescencyjnie na kriosekcjach LN lub studzienkach pokrytych PLL/BSA
UWAGA: Jako eksperymentalne kontrole, użyliśmy (1) naczyń do hodowli komórkowych wstępnie pokrytych PLL lub BSA i (2) kolejnych sekcji tego samego LN na eksperyment (zobacz ten szczegół w <silna klasa="xfig">Rysunek 2D), gdzie ten ostatni zminimalizuje regionalne różnice w składzie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) każdej sekcji LN, co z kolei może dyktować szybkość adhezji komórek. Do poniższego testu adhezji komórek nowotworowych wybierz wysokiej jakości i sekwencyjne kriosekcje LN.
<ol>
	<li>Delikatnie umyj kriosekcje dwukrotnie PBS i ponownie nawodnij PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzną adhezję do kriosekcji za pomocą 2,5% BSA przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Użyj komór do mycia immunohistochemicznego i kołysek blaszki, aby upewnić się, że cały OCT został usunięty podczas płukania i inkubacji.</li>
	<li>Odcedź nadmiar BSA na suchym ręczniku papierowym, osusz kontur odcinków LN bawełnianym wacikiem i owiń sekcje za pomocą pisaka PAP.</li>
	<li>W celu przeprowadzenia testu adhezji komórek nowotworowych dodać 100 μl zawiesiny komórkowej (z kroku 2.4) do każdego otoczonego odcinka LN lub studzienki na 24-dołkowych płytkach pokrytych PLL i umieścić je w wilgotnym stojaku komorowym na 1-2 godziny w temperaturze 37 °C w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Ostateczna objętość zawiesiny komórek musi być dostosowana do obszaru różnych otoczonych LN.</li>
	<li>Delikatnie zmyj nieprzylegające komórki cztery razy za pomocą PBS. Utrwal pozostałe przylegające komórki fluorescencyjne za pomocą 3,7% formaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
5. Ręczna kwantyfikacja wskaźnika adhezji
UWAGA: Wskaźnik adhezji (tj. komórki nowotworowe/LN mm2) został osiągnięty przy użyciu 10-krotnego obiektywu i ręcznego liczenia liczby komórek nowotworowych, łatwo zidentyfikowanych przez mikroskopię świetlną i potwierdzonych przez mikroskopię fluorescencyjną (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D), na obszary węzłów chłonnych kilku niezależnych pól (uzyskane za pomocą oprogramowania ImageJ/FIJI Narodowego Instytutu Zdrowia).
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x, aby wykonać oddzielne obrazy TIFF w dwóch kanałach odpowiadających jasnym i czerwonemu polu fluorescencyjnemu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Nazwij i zapisz te obrazy systematycznie.</li>
	<li>Uruchom ImageJ/FIJI, otwórz obrazy i ustaw skalę. Konieczne jest użycie skali kalibracyjnej (np. linijki mikrometrycznej 1 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Otwórz zdjęcie linijki mikrometrycznej (lub mikrometru stolikowego), wybierz narzędzie Linia prosta i narysuj linię prostą określającą znaną odległość.</li>
	<li>W menu Analizuj wybierz opcję Ustaw skalę. Odległość w pikselach zostanie wypełniona na podstawie długości (w pikselach) linii narysowanej w kroku 5.3. Znana odległość zostanie wypełniona rzeczywistą odległością (w tym przypadku w milimetrach) i jednostką długości w polu Jednostka długości (w tym przypadku w milimetrach).</li>
	<li>Kliknij Globalne (ta kalibracja dotyczy wszystkich obrazów otwartych w tej sesji ImageJ/FIJI) i naciśnij OK.</li>
	<li>Kwantyfikacja obszaru węzłów chłonnych: Wybierz narzędzie Różdżka i klikając dwukrotnie, otwórz ustawienia narzędzia Różdżka. Ustaw tryb na 8-connected. Kliknij na zdjęciu i ustaw tolerancję, aż zaznacz wszystkie węzły chłonne na zdjęciu i naciśnij OK. Aby zmierzyć powierzchnię, otwórz punkt menu Analizuj | Zmierz (CTRL + M). Powierzchnia wyrażona jest w jednostkach ustalonych wcześniej.</li>
	<li>Kwantyfikacja komórek nowotworowych: Otwórz obrazy mikroskopii świetlnej/fluorescencji w oprogramowaniu FIJI. Wybierz Wtyczki | Analizowanie | Licznik komórek | Licznik komórek. Kliknij zdjęcie, które chcesz określić ilościowo, i naciśnij przycisk Inicjalizuj w oknie licznika komórek. Wybierz typ licznika (1-8) i kliknij komórki na zdjęciu. Aby zainicjować następne zdjęcie, naciśnij przycisk Resetuj w oknie licznika komórek, otwórz nowe zdjęcie i powtórz wszystkie kroki. 
	UWAGA: Wskaźnik adhezji LN jest wyrażony jako liczba przylegających komórek nowotworowych na obszar pokryty LN (komórki/mm2).</li>
</ol>

<ol><li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+involved+in+cancer+metastasis%3A+a+better+understanding+to+seed+and+soil+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 176(2017).</li>
<li>Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphatic+System+in+Disease+Processes+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).</li>
<li>Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+lymph+node+involvement+and+its+significance+in+the+development+of+distant+metastases+in+head+and+neck+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma.</a> Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).</li>
<li>Kowalski, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+the+distribution+of+neck+node+metastasis+from+oral+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Head+%26+Neck%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma.</a> Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).</li>
<li>McGuire, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+recurrence+and+survival+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).</li>
<li>Gervasi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+lymph+nodal+metastases+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer.</a> The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).</li>
<li>Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+and+curability+at+various+levels+of+metastasis+in+resected+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).</li>
<li>Sasako, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D2+lymphadenectomy+alone+or+with+para-aortic+nodal+dissection+for+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).</li>
<li>Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+evaluation+and+survival+after+curative+resection+of+colon+cancer%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review.</a> Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+lymphadenectomy+and+preoperative+radiotherapy+for+lower+rectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers.</a> Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).</li>
<li>Machens, A., Dralle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+the+number+of+lymph+node+metastases+and+lung+metastasis+in+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).</li>
<li>Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+CD+%22Hemopoietic+System%22">Hemopoietic System</a>. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).</li>
<li>Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cords%2C+channels%2C+corridors+and+conduits%3A+critical+architectural+elements+facilitating+cell+interactions+in+the+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex.</a> Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).</li>
<li>Podgrabinska, S., Skobe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lymphatic+vasculature+in+regional+and+distant+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases.</a> Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).</li>
<li>Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li>
<li>Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+their+extracellular+matrix+ligands+in+lymphangiogenesis+and+lymph+node+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 853703(2012).</li>
<li>Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EblacZ+tumor+dormancy+in+bone+marrow+and+lymph+nodes%3A+active+control+of+proliferating+tumor+cells+by+CD8%2B+immune+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells.</a> Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).</li>
<li>Cady, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+lymph+node+metastases%3B+a+singular+manifestation+of+the+process+of+clinical+metastases+in+cancer%3A+contemporary+animal+research+and+clinical+reports+suggest+unifying+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).</li>
<li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+systemic+progression+of+human+cancer%3A+a+focus+on+the+individual+disseminated+cancer+cell-the+unit+of+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection.</a> Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Brodt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+adhesion+to+frozen+lymph+node+sections-an+in+vitro+correlate+of+lymphatic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Immunology%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).</li>
<li>Jandrey, E. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDRG4+promoter+hypermethylation+is+a+mechanistic+biomarker+associated+with+metastatic+progression+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients.</a> NPJ Breast Cancer. 5, 11(2019).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333(1989).</li>
<li>Costa, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+heterogeneity+of+ADAM23+promotes+tumor+growth+and+metastasis+through+LGI4+and+nitric+oxide+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals.</a> Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+of+secondary+lymphoid+organs+impacts+on+B-cell+fate+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).</li>
<li>Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement-membrane+components+associated+with+the+extracellular+matrix+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node.</a> Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).</li>
<li>Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+extracellular+matrix+proteins+of+the+lymph+node+cortex%3A+evidence+supporting+the+reticular+network+as+a+pathway+for+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration.</a> BMC Immunology. 11, 42(2010).</li>
<li>Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+Node+Metastasis+in+Breast+Cancer+Xenografts+Is+Associated+with+Increased+Regions+of+Extravascular+Drain%2C+Lymphatic+Vessel+Area%2C+and+Invasive+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype.</a> Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych w układzie limfatycznym wymaga wielu złożonych zdarzeń sterowanych przez komórki. Rozpoczynają się one od oderwania komórek od guza pierwotnego i przebudowy architektury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i są wspierane przez uporczywą chemotaksję i aktywną migrację przez aferentne limfy w drodze do wartowniczych LN. Jeśli komórki rakowe przylegają i przeżywają w LN, mogą łatwo rozprzestrzenić się na inne narządy wtórne. W tym miejscu opisujemy łatwą metodę szybkiej i taniej an...

Przerzuty nowotworowe są główną przyczyną niepowodzenia leczenia i dominującym aspektem zagrażającym życiu raka. Jak postulowano 130 lat temu, rozprzestrzenianie się przerzutów następuje, gdy elita rozsianych komórek nowotworowych (DTC, "nasiona") nabywa specyficzne zdolności biologiczne, które pozwalają im uniknąć miejsc pierwotnych i ustanowić złośliwy wzrost w odległych miejscach ("gleba")1. Ostatnio pojawiło się kilka nowatorskich koncepcji dotyczących relacji "ziarno i gleba", takich jak indukcja nisz premetastatycznych (konceptualizowanych jako "żyzna gleba" potrzebna do rozwoju "nasion"), samosiew guzów pierwotnych przez DTC, spoczynek "nasion" w narządach wtórnych i równoległy model progresji przerzutów2.
W przypadku większości nowotworów złośliwych, DTC mogą być zlokalizowane i wykrywane w wielu narządach mezenchymalnych, takich jak szpik kostny i węzły chłonne (LN) u pacjentów z lub bez dowodów na kliniczne przerzuty. Ponieważ LN drenujące guz są pierwszym miejscem regionalnego rozprzestrzeniania się DTC, status LN jest ważnym wskaźnikiem prognostycznym i często wiąże się z decyzjami dotyczącymi leczenia uzupełniającego3. W przypadku niektórych typów nowotworów korelacja między statusem LN a gorszymi wynikami jest silna, w tym głowa i szyja4,5, breast6, prostata7, lung8, gastric9, colorectal10,11 i raki tarczycy12.
LN to małe, jajowate organy układu limfatycznego, które są pokryte komórkami siatkowatymi i otoczone naczyniami limfatycznymi. Narządy te są absolutnie niezbędne do funkcjonowania układu odpornościowego13. LN działają jako platformy atraktantowe dla komórek krążących układu odpornościowego, łącząc limfocyty i komórki prezentujące antygen14. Jednak LN przyciągają również krążące komórki nowotworowe. Przez dziesięciolecia LN były przedstawiane jako pasywne drogi transportu przerzutowych komórek nowotworowych. Jednak ostatnie badania wykazały, że komórki nowotworowe mogą być również kierowane w kierunku LN przez sygnały chemotaktyczne (chemokiny) i/lub haptotaktyczne (elementy macierzy zewnątrzkomórkowej) wydzielane przez śródbłonek limfatyczny15. Na przykład, nadekspresja receptora CCR7 w komórkach nowotworowych ułatwia prowadzenie komórek czerniaka z przerzutami w kierunku drenujących guz LNs16. Ponadto zewnątrzkomórkowe białka LN stanowią adhezyjne rusztowanie do rekrutacji i przeżycia krążących komórek nowotworowych17. W rzeczywistości, drenujące nowotwory LN zapewniają żyzną glebę do wysiewu DTC, które mogą być utrzymywane w stanie proliferacyjnym lub uśpionym przez specyficzne sygnały mikrośrodowiskowe LN18. Ostateczny los tych DTC rezydujących w LN jest kontrowersyjny; Niektóre prace sugerują, że komórki te są pasywnymi wskaźnikami progresji przerzutów19, podczas gdy inne sugerują, że są one bardziej prawdopodobnymi założycielami oporności (poprzez samosiewy pierwotnych miejsc) i/lub działają jako rezerwuary komórkowe dla przerzutów (rozprzestrzeniając "nasiona" dla wzrostu raka trzeciego rzędu)20,21. Niedawno, przy użyciu modeli przedklinicznych, wykazano, że część tych DTC znajdujących się w LN aktywnie atakuje naczynia krwionośne, dostaje się do krążenia krwi i kolonizuje płuca21.
Biorąc pod uwagę, że obecność komórek rakowych w LN jest markerem agresywności i inwazyjności raka, w tym badaniu zoptymalizowaliśmy klasyczną metodę opracowaną przez Brodt22 do ilościowego pomiaru adhezji komórek nowotworowych do LN in vitro. Zastosowanie testu opartego na fluorescencji pozwoliło nam opracować tani, szybki, czuły i przyjazny dla środowiska (nieradioaktywny) protokół wykrywania zmian adhezyjnych między komórkami nowotworowymi a kriosekcjami LN. Wykorzystując komórki raka piersi MCF-7 wyrażające różne poziomy ekspresji genu NDRG4 i zamrożone skrawki LN szczura w celu zilustrowania metody, wykazaliśmy, że protokół ten pozwolił na dobrą korelację między adhezją komórek nowotworowych do LN in vitro a przerzutami LN obserwowanymi u pacjentów z rakiem piersi24.

<table><tbody><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Laminar Flow</td><td>Esco Pojemnik do hodowli</td><td></td><td></td>komórkowych</tr><tr><td>na dysk</td><td>Leica</td><td>14020139126</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych T-25 cm2</td><td>Corning</td><td>430372</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1860</td> Szczotka kriostatu UV <td></td></tr><tr><td>z magnesem</td><td>Sondy</td><td></td> molekularne Leica 14018340426 <td></td></tr><tr><td>DiIC18 Cell Traker Dye</td><td></td><td>V-22885</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon Eclipse 80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Forma Series II</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Wysokoprofilowa jednorazowa maszynka do golenia</td><td></td> Kostka do inkubacji <td>Leica</td> 14035838926 <td></td></tr><tr><td>(IHC)</td><td>KASVI</td><td>K560030</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran 100 mL</td><td>Crist&aaostry; lia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Bloquer Super Pap Pen</td><td>Abcam, odczynniki do nauk przyrodniczych</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia Związek "OCT"</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 1 ml</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010001</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010010</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 2 ml</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010002</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010005</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 50 ml</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010050</td><td></td></tr><tr><td>Pipetor serologiczny Easypet 3</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek cryomold</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Instituto Adolfo Lutz</td><td>ATV</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections

Węzły chłonne drenujące guz (LN) nie są jedynie filtrami odpadów wytwarzanych przez guz. Są one jednym z najczęstszych regionalnych miejsc tymczasowego pobytu rozsianych komórek nowotworowych u pacjentów z różnymi typami raka. Wykrycie tych komórek nowotworowych znajdujących się w LN jest ważnym biomarkerem związanym ze złym rokowaniem i decyzjami dotyczącymi leczenia uzupełniającego. Ostatnie modele mysie wykazały, że komórki nowotworowe znajdujące się w LN mogą być istotnym źródłem komórek złośliwych dla odległych przerzutów. Zdolność do ilościowego określenia adhezji komórek nowotworowych do miąższu LN jest krytycznym wskaźnikiem w badaniach eksperymentalnych, które koncentrują się na identyfikacji genów lub szlaków sygnałowych istotnych dla rozprzestrzeniania się limfy/przerzutów. Ponieważ LN są złożonymi strukturami 3D o różnorodnym wyglądzie i składzie w skrawkach tkanek w zależności od płaszczyzny przekroju, ich matryce są trudne do eksperymentalnego odtworzenia in vitro w całkowicie kontrolowany sposób. Tutaj opisujemy prostą i niedrogą metodę, która umożliwia ilościowe określenie adhezji komórek nowotworowych do kriosekcji LN. Korzystając z odcinków szeregowych tego samego LN, dostosowujemy klasyczną metodę opracowaną przez Brodta do użycia nieradioaktywnych znaczników i bezpośredniego zliczania liczby przylegających komórek nowotworowych na powierzchni LN. Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo do miąższu LN, co jest sugestywnym dowodem na zmiany molekularne w powinowactwie wiązania integryn z ich korelowanymi ligandami LN.

Ilustrujemy ten test, oceniając potencjał adhezyjny do LN czerwonych fluorescencyjnych komórek raka piersi MCF-7 wykazujących różne poziomy ekspresji genu NDRG4 (określanych jako komórki NDRG4-dodatnie i NDRG4-ujemne), który jest negatywnym modulatorem klasteryzacji beta1-integryny na powierzchni komórki24, poprzez badanie frakcji komórek nowotworowych przylegających do LN szczura. Przykłady surowych obrazów z tego protokołu przedstawiono na Ry...

Tutaj opisujemy prostą i tanią metodę, która pozwala na ilościowe określenie komórek nowotworowych adhezji do kriosekcji węzłów chłonnych (LN). Komórki nowotworowe przylegające do LN są łatwo identyfikowane za pomocą mikroskopii świetlnej i potwierdzane metodą opartą na fluorescencji, dając wskaźnik adhezji, który ujawnia powinowactwo wiązania komórek nowotworowych do miąższu LN.

Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Tumor-draining lymph nodes (LNs) are not merely filters of tumor-produced waste. They are one of the most common regional sites of provisional residence ...

Najczęstszymi miejscami przerzutów są pierwotne węzły chłonne. Somatidy mogą być stosowane do wykrywania powinowactwa adhezyjnego między odcinkami węzłów chłonnych komórek nowotworowych in vitro. Jedną z zalet tej techniki jest to, że świeże skrawki węzłów chłonnych zapewniają naturalną złożoność oryginalnej tkanki, która nie byłaby możliwa do odtworzenia przy użyciu oczyszczonych białek.Metoda ta może być przydatna w badaniach onkologii molekularnej, które mają na celu identyfikację genów lub terapii, które zakłócają adhezję komórek nowotworowych w przerzutowych narządach docelowych, takich jak węzły chłonne. Aby pobrać węzły chłonne w ciągu trzydziestu minut od złożenia ofiary, umieść dorosłego szczura Wistar w pozycji leżącej grzbietowej na czystej desce preparacyjnej w temperaturze pokojowej i spryskaj futro 70% alkoholem izopropylowym. Za pomocą wysterylizowanych narzędzi podnieś skórę brzucha i wykonaj przyśrodkowe nacięcie skóry, aby odsłonić wnętrzności brzucha.Wyciągnij jelito, aż węzły chłonne piersiowe i brzuszne staną się widoczne. Za pomocą nożyczek z końcówką ostrożnie wyciąć węzły chłonne, nie uszkadzając leżącej poniżej tętnicy krezkowej górnej, i umieść węzeł chłonny w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml sterylnego PBS. Po pobraniu wszystkich węzłów chłonnych umieść jeden węzeł chłonny na kriomaldzie zadrukowaną stroną do dołu na podstawie każdej formy i dodaj tylko tyle optymalnej pożywki o temperaturze cięcia, aby pokryć tkanki.Po zatrzaskowym zamrożeniu za pomocą kriostatu uzyskaj skrawki o grubości od 5 do 8 mikrometrów w temperaturze 22 stopni Celsjusza i zbierz skrawki na szklane szkiełka mikroskopowe. Dobrej jakości kriosekcje z kolejnych wycinków tego samego węzła chłonnego mają kluczowe znaczenie dla zminimalizowania różnic między plasterkami i ułatwienia stałych wskaźników adhezji komórek. W celu znakowania komórek nowotworowych należy pobrać interesujące komórki z odpowiednio przygotowanej hodowli komórkowej i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 10 do 6 komórek na ml i pożywce wolnej od surowicy.Przenieś 1 ml komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i oznacz komórki 2 mikrogramami na ml DiI(C18) przez dziesięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając po pięciu minutach, aby uniknąć sedymentacji komórek. Pod koniec inkubacji rozpuść komórki przez odwirowanie i umyj znakowane komórki dwa razy 10 ml świeżej pożywki bez surowicy, aby usunąć nadmiar barwnika. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić komórki w proporcjach 1 x 10 do 6 komórek na ml pożywki wolnej od surowicy, uzupełnionej stężeniem 0,1% albuminy surowicy bydlęcej.Kontynuując znakowane komórki nowotworowe na pobranych skrawkach tkanek węzłów chłonnych, delikatnie umyj skrawki dwa razy w PBS, a następnie ponownie nawodnij w świeżym PBS przez piętnaście minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania z 2,5% albuminą surowicy bydlęcej przez trzydzieści minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie użyj bawełnianego wacika do wysuszenia szkiełek. Użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować barierę wokół każdej sekcji i dodaj 100 mikrolitrów oznaczonych komórek na każdy otoczony węzeł chłonny.Po jednej do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze, usuń wszelkie nieprzylegające komórki za pomocą czterech delikatnych płukań w PBS i utrwal pozostałe przylegające komórki fluorescencyjne za pomocą 3,7% formaldehydu w PBS przez piętnaście minut w temperaturze pokojowej. Do ilościowego określenia wskaźnika adhezyjnego należy użyć obiektywu 10x w mikroskopie fluorescencyjnym, aby uzyskać indywidualne obrazy TIFF każdej sekcji w jasnym i czerwonym polu fluorescencyjnym. Następnie nazwij i systematycznie zapisz obrazy przed otwarciem obrazów na Fidżi.Po ustawieniu skali użyj narzędzia wielokąta, aby wybrać obszar zainteresowania, który ma zostać określony ilościowo. Wybierz, aby określić ilościowo obszar węzłów chłonnych. Dane będą wyrażone w milimetrach kwadratowych.Następnie wybierz Wtyczki, Analizuj, Licznik komórek i kliknij zdjęcie, które chcesz określić ilościowo. Kliknij przycisk Inicjuj i wybierz opcję Typ licznika. Następnie kliknij komórki na zdjęciu.Wskaźnik adhezji węzłów chłonnych zostanie wyrażony jako liczba przylegających komórek nowotworowych na obszar pokryty węzłem chłonnym. Aby zainicjować następne zdjęcie, otwórz następne zdjęcie i powtórz kwantyfikację, jak pokazano. Jak zaobserwowano, morfologia przylegających komórek ma zaokrąglony kształt, a komórki są niejednorodnie rozproszone w interesującym węźle chłonnym.Wskaźnik adhezji węzłów chłonnych jest od dwóch do trzech razy wyższy w liniach komórkowych NDRG4 ujemnego raka piersi w porównaniu z tym mierzonym dla odpowiadających im komórek NDRG4 dodatnich. Procedura ta może być dostosowana do wspomagania szybkości adhezji w innych przerzutowych tkankach docelowych, takich jak mózg lub płuca, w celu oceny drugorzędowych preferencyjnych miejsc adhezji dla inseminowanych komórek nowotworowych. Pamiętaj, że zarówno świeże, jak i zamrożone tkanki powinny być uważane za niebezpieczne biologicznie i należy się z nimi obchodzić z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności bezpieczeństwa biologicznego.

quantification-of-tumor-cell-adhesion-in-lymph-node-cryosections

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę badania cytoszkieletu i ogniskowych zrostów w pierwotnych komórkach ludzkiego raka jelita grubego, aby zrozumieć jego zmiany w zależności od sztywności podłoża. Ta hodowla komórek rakowych na miękkich i twardych podłożach umożliwia różne dalsze pomiary biofizyczne w celu prognozowania raka.

Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

W tym filmie demonstrujemy test wykorzystujący mikroskopię fluorescencyjną do wykrywania adhezji komórek rakowych do pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). W studzienkach testowych obserwuje się znaczny wzrost liczby znakowanych fluorescencyjnie komórek rakowych przylegających do NET, podczas gdy studzienki potraktowane DNazą wykazują zmniejszoną adhezję komórek rakowych do NET.

Test adhezji in vitro w celu wykrycia przylegania komórek rakowych do zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Ten protokół opisuje metodę szczegółowej oceny podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza w modelu guza myszy. Komórki czerniaka B16 z ekspresją chemeryny wszczepiono podskórnie myszom syngenicznym. Komórki z mikrośrodowiska guza zostały następnie wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwoliło na szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów.

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Poznaj metodę kwantyfikacji adhezji komórek nowotworowych do kriosekcji węzłów chłonnych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia badanie procesów metastazy w onkologii molekularnej.

Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Przeglądaj więcej filmów