Kwantyfikacja adhezji komórek nowotworowych w kriosekcjach węzłów chłonnych

Najczęstszymi miejscami przerzutów są pierwotne węzły chłonne. Somatidy mogą być stosowane do wykrywania powinowactwa adhezyjnego między odcinkami węzłów chłonnych komórek nowotworowych in vitro. Jedną z zalet tej techniki jest to, że świeże skrawki węzłów chłonnych zapewniają naturalną złożoność oryginalnej tkanki, która nie byłaby możliwa do odtworzenia przy użyciu oczyszczonych białek.

Metoda ta może być przydatna w badaniach onkologii molekularnej, które mają na celu identyfikację genów lub terapii, które zakłócają adhezję komórek nowotworowych w przerzutowych narządach docelowych, takich jak węzły chłonne. Aby pobrać węzły chłonne w ciągu trzydziestu minut od złożenia ofiary, umieść dorosłego szczura Wistar w pozycji leżącej grzbietowej na czystej desce preparacyjnej w temperaturze pokojowej i spryskaj futro 70% alkoholem izopropylowym. Za pomocą wysterylizowanych narzędzi podnieś skórę brzucha i wykonaj przyśrodkowe nacięcie skóry, aby odsłonić wnętrzności brzucha.

Wyciągnij jelito, aż węzły chłonne piersiowe i brzuszne staną się widoczne. Za pomocą nożyczek z końcówką ostrożnie wyciąć węzły chłonne, nie uszkadzając leżącej poniżej tętnicy krezkowej górnej, i umieść węzeł chłonny w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml sterylnego PBS. Po pobraniu wszystkich węzłów chłonnych umieść jeden węzeł chłonny na kriomaldzie zadrukowaną stroną do dołu na podstawie każdej formy i dodaj tylko tyle optymalnej pożywki o temperaturze cięcia, aby pokryć tkanki.

Po zatrzaskowym zamrożeniu za pomocą kriostatu uzyskaj skrawki o grubości od 5 do 8 mikrometrów w temperaturze 22 stopni Celsjusza i zbierz skrawki na szklane szkiełka mikroskopowe. Dobrej jakości kriosekcje z kolejnych wycinków tego samego węzła chłonnego mają kluczowe znaczenie dla zminimalizowania różnic między plasterkami i ułatwienia stałych wskaźników adhezji komórek. W celu znakowania komórek nowotworowych należy pobrać interesujące komórki z odpowiednio przygotowanej hodowli komórkowej i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 10 do 6 komórek na ml i pożywce wolnej od surowicy.

Przenieś 1 ml komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i oznacz komórki 2 mikrogramami na ml DiI(C18) przez dziesięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając po pięciu minutach, aby uniknąć sedymentacji komórek. Pod koniec inkubacji rozpuść komórki przez odwirowanie i umyj znakowane komórki dwa razy 10 ml świeżej pożywki bez surowicy, aby usunąć nadmiar barwnika. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić komórki w proporcjach 1 x 10 do 6 komórek na ml pożywki wolnej od surowicy, uzupełnionej stężeniem 0,1% albuminy surowicy bydlęcej.

Kontynuując znakowane komórki nowotworowe na pobranych skrawkach tkanek węzłów chłonnych, delikatnie umyj skrawki dwa razy w PBS, a następnie ponownie nawodnij w świeżym PBS przez piętnaście minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania z 2,5% albuminą surowicy bydlęcej przez trzydzieści minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie użyj bawełnianego wacika do wysuszenia szkiełek. Użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować barierę wokół każdej sekcji i dodaj 100 mikrolitrów oznaczonych komórek na każdy otoczony węzeł chłonny.

Po jednej do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze, usuń wszelkie nieprzylegające komórki za pomocą czterech delikatnych płukań w PBS i utrwal pozostałe przylegające komórki fluorescencyjne za pomocą 3,7% formaldehydu w PBS przez piętnaście minut w temperaturze pokojowej. Do ilościowego określenia wskaźnika adhezyjnego należy użyć obiektywu 10x w mikroskopie fluorescencyjnym, aby uzyskać indywidualne obrazy TIFF każdej sekcji w jasnym i czerwonym polu fluorescencyjnym. Następnie nazwij i systematycznie zapisz obrazy przed otwarciem obrazów na Fidżi.

Po ustawieniu skali użyj narzędzia wielokąta, aby wybrać obszar zainteresowania, który ma zostać określony ilościowo. Wybierz, aby określić ilościowo obszar węzłów chłonnych. Dane będą wyrażone w milimetrach kwadratowych.

Następnie wybierz Wtyczki, Analizuj, Licznik komórek i kliknij zdjęcie, które chcesz określić ilościowo. Kliknij przycisk Inicjuj i wybierz opcję Typ licznika. Następnie kliknij komórki na zdjęciu.

Wskaźnik adhezji węzłów chłonnych zostanie wyrażony jako liczba przylegających komórek nowotworowych na obszar pokryty węzłem chłonnym. Aby zainicjować następne zdjęcie, otwórz następne zdjęcie i powtórz kwantyfikację, jak pokazano. Jak zaobserwowano, morfologia przylegających komórek ma zaokrąglony kształt, a komórki są niejednorodnie rozproszone w interesującym węźle chłonnym.

Wskaźnik adhezji węzłów chłonnych jest od dwóch do trzech razy wyższy w liniach komórkowych NDRG4 ujemnego raka piersi w porównaniu z tym mierzonym dla odpowiadających im komórek NDRG4 dodatnich. Procedura ta może być dostosowana do wspomagania szybkości adhezji w innych przerzutowych tkankach docelowych, takich jak mózg lub płuca, w celu oceny drugorzędowych preferencyjnych miejsc adhezji dla inseminowanych komórek nowotworowych. Pamiętaj, że zarówno świeże, jak i zamrożone tkanki powinny być uważane za niebezpieczne biologicznie i należy się z nimi obchodzić z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności bezpieczeństwa biologicznego.