Name: Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Odkryj metodę identyfikacji związków regulujących transpirację roślin za pomocą obrazowania termicznego u Helianthus annuus. Technika ta umożliwia badanie aktywności aparatów szparkowych i efektywności wykorzystania wody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Pomona College Start-up Funds i Hirsch Research Initiation Grants Fund (dla FJ), a także Pomona College Molecular Biology Program poprzez Stellar Summer Research Assistant Program (do KG).

1. Uprawa roślin
<ol>
	<li>Dodaj warstwę drobnego wermikulitu o grubości 4 cm do standardowych 10 cali x 20 cali. (254 mm x 501 mm) tace na rośliny bez otworów.</li>
	<li>Umieść uchwyty na nasiona (patrz tabela materiałów) w odległości 2 cm od siebie w tacach na rośliny.</li>
	<li>Napełnij pojemniki na nasiona wermikulitem.</li>
	<li>Umieść ziarno słonecznika spiczastym końcem w dół w każdym uchwycie na nasiona, dociskając w dół, aby połowa nasion pozostała odsłonięta. 
	UWAGA: Ziarno słonecznika jest asymetryczne, a spiczasty koniec, z którego wyłoni się korzonek, powinien być skierowany w dół. Prawidłowe umieszczenie nasion jest ważne, ponieważ reorientacja korzenia i łodygi nie jest możliwa w uchwytach na nasiona. Zaokrąglony koniec nasion powinien wystawać poza górną część uchwytu na nasiona.</li>
	<li>Gdy nasiona znajdą się na miejscu, przykryj je dodatkową warstwą drobnego wermikulitu o grubości 2 cm. Woda przez zamgławianie z góry. Powierzchnia powinna pozostać mokra po godzinie. W takim przypadku przykryj tace pokrywkami.</li>
	<li>Uprawiaj rośliny w komorze wzrostowej lub szklarni. Zalecane warunki to natężenie światła 140 μmol fotonów·m-2·s-1 oraz fotoperiod 16 godzin światła w temperaturze 22 °C i 9 godzin ciemności w temperaturze 20 °C przez 5 dni. 
	UWAGA: Podlewanie nie powinno być konieczne, chyba że powierzchnia stanie się widocznie sucha.</li>
</ol>
2. Konfiguracja systemu hydroponicznego
<ol>
	<li>Znajdź pojemnik o odpowiedniej wielkości, odpowiedni do hydroponicznej uprawy roślin. Wielkość pojemnika powinna być dostosowana do przestrzeni dostępnej w komorze uprawowej lub szklarni. Zalecana jest minimalna głębokość 15 cm.</li>
	<li>Napełnij pojemnik wodą destylowaną i dodaj ogólny nawóz hydroponiczny zgodnie ze wskazaniami producenta. Powstały roztwór hydroponiczny powinien być napowietrzany i w ciągłym ruchu, co można osiągnąć za pomocą pomp powietrznych i wodnych.</li>
	<li>Przygotuj pływaki hydroponiczne.
	<ol>
		<li>Przyciąć arkusz styropianu o grubości 2 cm (patrz Tabela materiałów) do wymiarów pojemnika. Arkusz powinien pokrywać większość powierzchni pojemnika, aby ograniczyć rozwój glonów. Narzędzie do spalania drewna jest skuteczne do cięcia styropianu i jest wystarczająco wszechstronne dla tego protokołu. 
		UWAGA: Opary lub opary uwalniające się podczas cięcia styropianu na gorąco stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia. Stosować odpowiednią ochronę dróg oddechowych. Użytkownicy mogą również spełnić wymagania dotyczące wentylacji, przecinając piankę pod wyciągiem.</li>
		<li>Wykonaj otwory (o średnicy 1-2 cm) w styropianie za pomocą narzędzia do wypalania drewna. Odległość między środkami dwóch otworów może być dostosowana do potrzeb eksperymentu. Zalecana jest jednak minimalna odległość 2,5 cm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeniesienie sadzonek do hydroponiki i wzrost roślin
<ol>
	<li>Delikatnie wyciągnij 5-dniowe sadzonki z wermikulitu i natychmiast przenieś do pojemnika wypełnionego wodą na 30 minut. Ten krok usunie nadmiar wermikulitu i zmiękczy pozostałe owocnie. Wyłaniający się korzeń pierwotny powinien być widoczny.</li>
	<li>W razie potrzeby usuń ścianki owocni ręcznie, aby zoptymalizować przyszłą ekspansję liścieni.</li>
	<li>Przenieś sadzonki w uchwytach na nasiona do pływaka z pianki polistyrenowej. Rośliny uprawiać o natężeniu światła 140 μmol fotonów·m-2·s-1, wilgotności względnej 65% i fotoperiodzie 16 godzin światła w temperaturze 22 °C i 9 godzin ciemności w temperaturze 20 °C przez 2 dni.</li>
</ol>
4. Przygotowanie przed zabiegiem
UWAGA: Ta procedura służy do testowania 20 substancji chemicznych z małej biblioteki związków w trzech egzemplarzach, z 100 μM ABA w 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) i 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) zawierających 1% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO) jako odpowiednio kontrole pozytywne i negatywne.
<ol>
	<li>Upewnij się, że jest wystarczająca liczba roślin gotowych do zabiegu. Rośliny gotowe do leczenia powinny być wystarczająco dojrzałe, aby mieć w pełni rozwinięte liścienie, ale na tyle młode, aby boczne rozrosty korzeni były minimalne. Aby wykonać standardowe przesiewanie, potrzebnych jest 69 takich roślin.</li>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę zawierającą małe związki z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Rozmrozić w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 80 ml 10 mM BUFORU MES-KOH dostosowanego do pH 6,2 z 1 M KOH.</li>
	<li>Oznaczyć bez nakrętki mikroprobówki 2 ml. Przygotować co najmniej sześć probówek do poddania działaniu kontroli ujemnej (10 mM MES-KOH (pH = 6,2) zawierające 1% (v/v) DMSO). Do leczenia ABA należy użyć trzech probówek (100 μM ABA w 10 mM MES-KOH pH = 6,2), kontrola pozytywna). Użyj pozostałych 60 probówek, aby przeanalizować wpływ 20 substancji chemicznych w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Przenieś 10 μl każdej substancji chemicznej (10 mM w DMSO) do każdej z trzech odpowiednio oznakowanych probówek. Odpipetować 10 μl 10 mM ABA rozpuszczonego w DMSO do trzech probówek i 10 μl DMSO do sześciu probówek kontrolnych. 
	UWAGA: Z natury niektóre związki mogą powodować poważne skutki zdrowotne, a użytkownicy muszą podjąć odpowiednie środki ochronne.</li>
	<li>Dodaj 990 μl 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) do każdej z 69 probówek. Dozuj bufor MES z wystarczającą siłą, aby wymieszać substancję chemiczną z buforem MES, ale należy bardzo uważać, aby nie używać tak dużej siły, aby chemikalia i bufor MES wytrysnęły z probówki. Alternatywnie, wiruj z małą prędkością.</li>
</ol>
5. Konfiguracja kamery termowizyjnej
<ol>
	<li>Zamontuj kamerę termowizyjną na stojaku do kopiowania. Podłącz wszystkie do laptopa. 
	UWAGA: Zapis odbywa się w warunkach temperatury (od 20 °C do 25 °C), wilgotności (od 50% do 70%) i jakości światła (110 do 140 μmol fotonów·m-2·s-1) podobnych do tych używanych do uprawy roślin.</li>
	<li>Włącz aparat, a następnie laptopa i otwórz oprogramowanie do analizy termowizyjnej. 
	UWAGA: Poniższe instrukcje dotyczące nagrywania dotyczą konkretnego używanego oprogramowania (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Dostosuj ustawienia nagrywania.
	<ol>
		<li>Najedź kursorem na czerwony przycisk nagrywania w górnej części środkowego okna. Pojawi się menu rozwijane. Kliknij ikonę klucza Ustawienia nagrywania.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni tryb nagrywania i opcje. Można użyć opcji nagrywania okresowego, z jedną klatką rejestrowaną na minutę i ręcznym zatrzymaniem. Zanotuj miejsce docelowe pliku, w którym oprogramowanie zapisze wideo. Zamknij okno Ustawienia nagrywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przygotowanie i leczenie roślin
<ol>
	<li>Umieść probówki bez nakrętki zawierające chemikalia w stojakach na probówki. Alternatywnie, arkusz styropianu można przeciąć i szturchnąć za pomocą narzędzia do spalania drewna, jak opisano w kroku 2.3, aby uzyskać niestandardowy stojak na tuby. Średnica każdego otworu powinna być bardzo zbliżona do zewnętrznej średnicy rurek bez nakrętki, aby je mocno trzymać. 
	UWAGA: Pole widzenia kamery jest czynnikiem ograniczającym, który należy wziąć pod uwagę przy podejmowaniu decyzji o tym, w jaki sposób rurki bez nasadki będą utrzymywane na miejscu.</li>
	<li>Równomiernie rozprowadź probówki kontroli dodatniej i ujemnej, a także probówki eksperymentalne w stojakach, aby uwzględnić odchylenie związane z pozycją17.</li>
	<li>Obok roślin uprawianych hydroponicznie przygotuj następujące materiały: nożyczki do mikrodysekcji, płytkie naczynie z wodą, delikatne chusteczki do ćwiczeń, 69 probówek bez nasadki zawierających różne chemikalia.</li>
	<li>Powtórz następujące kroki dla każdej rośliny, która ma być poddana zabiegowi. Kiełki słonecznika zawsze pozostaną w uchwycie na nasiona.
	<ol>
		<li>Ostrożnie podnieś uchwyt na nasiona i szybko zanurz korzeń w płytkim naczyniu zawierającym wodę.</li>
		<li>Przetnij główny korzeń pod wodą, aby zapobiec kawitacji. Cięcie powinno nastąpić 0,8-1 cm poniżej najbardziej podstawowego końca uchwytu nasion.</li>
		<li>Włóż świeżo ściętą roślinę do jednej z probówek zawierających chemikalia.</li>
		<li>Jeśli na liścieniach znajdują się krople wody, delikatnie osusz je delikatną chusteczką do smarowania. 
		UWAGA: Te cztery kroki należy wykonać tak szybko, jak to możliwe (10 minut lub mniej), aby zapobiec niespójnościom w badaniu kinetycznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesuń rośliny pod kamerę termowizyjną i upewnij się, że wszystkie rośliny znajdują się w polu widzenia kamery. W razie potrzeby dostosuj wysokość kamery i położenie stojaków.</li>
</ol>
7. Nagrywanie
<ol>
	<li>Ustaw ostrość aparat na powierzchni liścieni, naciskając Ctrl + Alt + A.</li>
	<li>Najedź myszką na czerwony przycisk i kliknij opcję Nagraj film. Powinno otworzyć się nowe okno potwierdzające nagranie.</li>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie 1-2 godziny później. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
8. Zbieranie danych
<ol>
	<li>Przejdź do punktu menu Plik | Otwórz | Wyszukaj właściwy plik . SEQ i otwórz go.</li>
	<li>Zatrzymaj odtwarzanie filmu.</li>
	<li>Po lewej stronie okna głównego kliknij ikonę dodaj kursor pomiaru ROI (3x3 piksele). ROI to skrót od Region of Interest (region zainteresowania).</li>
	<li>Najedź myszką na środek liścienia pierwszej rośliny i kliknij raz lewym przyciskiem myszy. Kursor 1 jest teraz na swoim miejscu. Oznacz drugi liścień pierwszej rośliny, powtarzając procedurę. Należy zwrócić uwagę na kolejność etykiet.</li>
	<li>Powtórz procedurę. Wszystkie rośliny powinny być oznaczone dwoma kursorami.</li>
	<li>Kliknij ikonę Edytuj ROI. W oknie głównym kliknij lewym przyciskiem myszy i przytrzymaj lewy górny róg i przewiń do prawego dolnego rogu, aby wybrać wszystkie ROI.</li>
	<li>Najedź kursorem na ikonę Przeglądarka statystyk i wybierz opcję Wykres czasowy. Otworzy się nowe okno.</li>
	<li>Uruchom film. Wykres zostanie wypełniony danymi.</li>
	<li>W tym oknie kliknij podwójną strzałkę w prawym górnym rogu, aby otworzyć nowe menu.</li>
	<li>Kliknij ikonę Zapisz. Zapisz jako wartości X i Y na wykresie (.csv). Zamknij oprogramowanie po wyeksportowaniu danych.</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik .csv za pomocą oprogramowania do analizy danych (np. Microsoft Excel). Zauważ, że trzy pierwsze kolumny (od A do C) zawierają informacje o numerze klatki, czasie bezwzględnym i czasie względnym. Pozostałe kolumny podają temperaturę każdego zwrotu z inwestycji w czasie.</li>
	<li>Należy zdecydować o charakterze narzędzia statystycznego, które ma być użyte; decyzja ta zależy od różnych czynników, w tym od projektu eksperymentu. 
	UWAGA: W naszym przykładzie wynik standardowy lub wskaźnik z jest obliczany dla każdej próby na podstawie średniej populacji i odchylenia standardowego populacji. Dla każdej próbki wartość p jest następnie obliczana na podstawie wskaźnika z. Metoda ta pozwala na potwierdzenie kontroli dodatnich i ujemnych, jak również na identyfikację nowych związków, które mają być dalej badane.</li>
</ol>

<ol><li>Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+adaptation+to+drought+stress%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Plant adaptation to drought stress.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gate+control%3A+guard+cell+regulation+by+microbial+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Gate control: guard cell regulation by microbial stress.</a> The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).</li>
<li>Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Plant%27s+Dilemma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Plant's Dilemma.</a> Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).</li>
<li>Macarron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+high-throughput+screening+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Impact of high-throughput screening in biomedical research.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).</li>
<li>Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+delivery+of+next+generation+therapeutics+from+high+throughput+screening+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+interrogation+of+natural+variation+uncovers+a+molecule+that+is+glycoactivated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated.</a> Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+inhibits+type+2C+protein+phosphatases+via+the+PYR%2FPYL+family+of+START+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins.</a> Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+PP2C+phosphatase+activity+function+as+abscisic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors.</a> Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).</li>
<li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ABA-mimicking+ligand+that+reduces+water+loss+and+promotes+drought+resistance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants.</a> Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).</li>
<li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+dimeric+ABA+receptors+elicits+guard+cell+closure%2C+ABA-regulated+gene+expression%2C+and+drought+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).</li>
<li>Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unnatural+agrochemical+ligands+for+engineered+abscisic+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors.</a> Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+reveals+negative+regulation+of+abscisic+acid+signaling+by+a+plant+immune+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway.</a> Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Abscisic+Acid+Antagonists+Identified+with+Chemical+Array+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Chemical+Inhibitor+of+ABA+Signaling+Targets+All+ABA+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).</li>
<li>Takeuchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designed+abscisic+acid+analogs+as+antagonists+of+PYL-PP2C+receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions.</a> Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+modification+of+sunflower+oil+to+expand+its+industrial+value%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).</li>
<li>Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+overcoming+systematic+bias+in+high-throughput+screening+technologies%3A+a+comprehensive+review+of+practical+issues+and+methodological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions.</a> Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).</li>
<li>Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermography+to+explore+plant-environment+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Thermography to explore plant-environment interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).</li>
<li>Merlot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+infrared+thermal+imaging+to+isolate+Arabidopsis+mutants+defective+in+stomatal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation.</a> The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Liczba związków, które można przetestować w danym dniu, zależy głównie od (i) kontrolowanej środowiskowo przestrzeni dostępnej do uprawy roślin i przeprowadzenia badania przesiewowego, a także (ii) liczby osób, które mogą być zaangażowane w krok 6 protokołu. Zalecamy użycie trzech powtórzeń eksperymentalnych w celu utrwalenia interpretacji wyników po leczeniu statystycznym. W ciągu typowego dnia jedna lub dwie osoby mogą bez trudu przebadać 60 związków w trzech egzemplarzach, testując na przykład [60 substancji chemiczny...

Tolerancja na stres u roślin to cecha poligeniczna, na którą wpływa różnorodność cech i mechanizmów molekularnych, komórkowych, rozwojowych i fizjologicznych1. Rośliny w zmiennym środowisku muszą stale modulować swoje ruchy szparkowe, aby zrównoważyć zapotrzebowanie fotosyntetyczne na węgiel, jednocześnie utrzymując wystarczającą ilość wody i zapobiegając inwazji patogenów2; Jednak mechanizmy, za pomocą których podejmowane są te kompromisowe "decyzje", są słabo zrozumiałe3. Wprowadzenie bioaktywnych cząsteczek do roślin może modulować ich fizjologię i pomóc w badaniu nowych mechanizmów regulacji.
Zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe małych cząsteczek to skuteczna strategia stosowana w odkrywaniu leków przeciwnowotworowych i testach farmakologicznych w celu przetestowania fizjologicznych efektów setek do tysięcy molekuł w krótkim okresie czasu4,5. W biologii roślin wysokoprzepustowe badania przesiewowe wykazały swoją skuteczność, na przykład w identyfikacji syntetycznej cząsteczki pyrabaktyny6, a także w odkryciu długo poszukiwanego receptora kwasu abscysynowego (ABA)7,8. Od tego czasu zidentyfikowano agonistów i antagonistów receptorów ABA oraz małe cząsteczki zdolne do modulowania ekspresji genów reporterowych indukowanych przez ABA9,10,11,12,13,14,15. Obecnie dostępne metody wysokoprzepustowych badań przesiewowych w celu identyfikacji małych związków, które mogą modulować aperturę aparatów szparkowych, mają pewne wady: (i) protokoły obracające się wokół szlaku sygnałowego ABA mogą uniemożliwić identyfikację nowych mechanizmów niezależnych od ABA, oraz (ii) strategie in vivo stosowane do identyfikacji bioaktywnych małych cząsteczek opierają się przede wszystkim na ich fizjologicznym wpływie na kiełkowanie nasion lub wzrost siewek, a nie na regulacji transpiracji roślin jako takiej.
Dodatkowo, chociaż istnieje wiele sposobów na leczenie roślin bioaktywnymi cząsteczkami, większość z nich nie nadaje się do badania ruchu szparkowego na dużą skalę. Krótko mówiąc, trzy najczęstsze techniki to aplikacja dolistna przez opryskiwanie lub zanurzanie, leczenie systemu korzeniowego i nawadnianie korzeni. Stosowanie dolistne nie jest zgodne z najpopularniejszymi i najszybszymi metodologiami pomiaru otworów szparkowych, ponieważ obecność kropelek na powierzchni liści przeszkadza w gromadzeniu danych na dużą skalę. Głównymi ograniczeniami nawadniania korzeni są duże wymagania dotyczące objętości próbki, potencjalna retencja związków przez pierwiastki w ryzosferze oraz zależność od aktywnego pobierania przez korzenie.
Tutaj prezentujemy metodę na dużą skalę do identyfikacji nowych związków regulujących transpirację roślin, która niekoniecznie obejmuje ABA lub znane mechanizmy reagujące na suszę i pozwala na skuteczne i niezawodne leczenie roślin. W tym systemie rośliny Helianthus annuus są traktowane przy użyciu metody dokarmiania korzeni, która polega na odcięciu pierwotnego korzenia sadzonek uprawianych hydroponicznie i zanurzeniu miejsca cięcia w roztworze próbki. Po poddaniu działaniu substancji badanej mierzy się wpływ każdego związku na transpirację roślin za pomocą kamery termowizyjnej na podczerwień. Ponieważ głównym wyznacznikiem temperatury powierzchni liścia jest szybkość parowania z liścia, dane termowizyjne mogą być bezpośrednio skorelowane z przewodnictwem aparatów szparkowych. Względna zmiana temperatury liści po zastosowaniu zabiegu chemicznego stanowi zatem bezpośredni sposób na ilościowe określenie transpiracji roślin.
H. annuus jest jedną z pięciu największych roślin oleistych na świecie16, a odkrycia dokonane bezpośrednio na tej roślinie mogą ułatwić przyszły transfer technologii. Ponadto siewki H. annuus mają duże i płaskie liścienie, a także gruby korzeń pierwotny, który był idealny do opracowania tego protokołu. Jednak tę metodę można łatwo dostosować do innych roślin i różnych związków.
Ten protokół może być wykorzystany do skutecznego identyfikowania cząsteczek zdolnych do wywołania zamknięcia aparatów szparkowych lub promowania otwarcia aparatów szparkowych, co ma duże implikacje dla zrozumienia sygnałów regulujących przewodnictwo aparatów szparkowych i adaptację roślin do stresów środowiskowych.

<table><tbody><tr><td>1020 plastikowych tacek do uprawy bez otworów</td><td></td><td></td> odpływowych <td>Standardowe tace 10 x 20 cali</td></tr><tr><td>Mikroprobówki 2,0 ml, bez nakrętki</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-283NC</td><td></td></tr><tr><td>Kwas abscysynowy (ABA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrza</td><td>Active Aqua</td><td>AAPA7.8L</td><td>2 wyloty, 3W, 7.8 L/min</td></tr><tr><td>Napowietrzacze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka związków chemicznych</td><td>MicroSource Discovery</td><td></td><td>Natural Product Collection</td></tr><tr><td>Creative Versa-Tool (narzędzie do spalania drewna)</td><td>Nasco</td><td>9724549</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO), testowana hodowla komórek roślinnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Dwarf Sunspot Nasiona słonecznika</td><td>Outsidepride.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erythrosin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>200964</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw nawozów hydroponicznych (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro)</td><td>General Hydroponics</td><td>GL51GH1421.31.11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Delikatne wycieraczki do</td> zadań <td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td> do mikrodysekcji</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ResearchIR</td><td>FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R-Tech Sztywna płyta z pianki polistyrenowej</td><td>Izolacyjne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pianki Nasiona</td><td>Araponika</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Super Tub (plastikowa wanna użytkowa)</td><td>Maccourt</td><td>ST3608</td><td>Wanna 36 x 24 x 8 cali używana do hydroponiki</td></tr><tr><td>T450sc LWIR (długofalowa) Ręczna kamera termowizyjna</td><td>FLIR</td><td>FLIR-T62101</td><td>W zestawie wymagany ładujący i USB potrzebny do podłączenia do laptopa</td></tr> Filtr <tr><td>do wody wermikulitowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SunSun</td><td>HW-304B Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u helianthus annuus

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Adaptacja roślin do stresów biotycznych i abiotycznych jest regulowana przez różne czynniki, wśród których kluczową rolę odgrywa regulacja otworu szparkowego w odpowiedzi na deficyt wody lub patogeny. Identyfikacja małych cząsteczek, które regulują ruchy aparatów szparkowych, może zatem przyczynić się do zrozumienia fizjologicznych podstaw, dzięki którym rośliny przystosowują się do środowiska. Zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe, które wykorzystano do identyfikacji regulatorów ruchu aparatów szparkowych, mają potencjalne ograniczenia: niektóre w dużym stopniu opierają się na szlaku sygnałowym hormonu kwasu abscysynowego (ABA), wykluczając w ten sposób mechanizmy niezależne od ABA, podczas gdy inne opierają się na obserwacji pośrednich, długoterminowych skutków fizjologicznych, takich jak wzrost i rozwój roślin. Przedstawiona tutaj metoda przesiewowa pozwala na leczenie roślin na dużą skalę za pomocą biblioteki substancji chemicznych w połączeniu z bezpośrednią kwantyfikacją ich transpiracji za pomocą obrazowania termicznego. Ponieważ parowanie wody w wyniku transpiracji powoduje chłodzenie powierzchni liści, obrazowanie termiczne zapewnia nieinwazyjne podejście do badania zmian przewodnictwa szparkowego w czasie. W tym protokole siewki Helianthus annuus są uprawiane hydroponicznie, a następnie traktowane przez dokarmianie korzeni, w którym pierwotny korzeń jest cięty i zanurzany w testowanej substancji chemicznej. Obrazowanie termiczne, a następnie analiza statystyczna zmian temperatury liścieni w czasie, pozwala na identyfikację bioaktywnych cząsteczek modulujących aperturę aparatów szparkowych. Nasze eksperymenty potwierdzające słuszność koncepcji pokazują, że substancja chemiczna może zostać przeniesiona z ściętego korzenia do liścienia sadzonki słonecznika w ciągu 10 minut. Ponadto, gdy rośliny są traktowane ABA jako kontrola pozytywna, w ciągu kilku minut można wykryć wzrost temperatury powierzchni liści. Nasza metoda pozwala zatem na skuteczną i szybką identyfikację nowych cząsteczek regulujących aperturę aparatów szparkowych.

Eksperyment z wykorzystaniem czerwonego barwnika Erytrozyny B (0.8 kDa) demonstruje zdolność substancji chemicznych do widocznej absorpcji przez przecięty korzeń do liści zasadniczych siewki słonecznika w ciągu 10 minut (Rysunek 1).
Po potraktowaniu roślin ABA, w liściach zasiedlonych w kotyledonach słonecznika w ciągu kilku minut wykrywany jest wzrost temperatury. Wzrost ten jest powiązany ze zmnie...

Udostępniamy metodę identyfikacji modulatorów transpiracji dolistnej poprzez zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe biblioteki złożonej.

Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Protokół ten wykorzystuje obrazowanie termiczne do identyfikacji nowych związków zdolnych do regulowania transpiracji roślin. Technika ta jest wszechstronna pod względem gatunków roślin, które można testować, charakteru związku i rodzaju obrazowania. Aby przygotować rośliny do uprawy, najpierw dodaj warstwę drobnego wermikulitu o grubości czterech centymetrów do standardowych tacek na rośliny o wymiarach 10 na 20 cali bez otworów i umieść w tacach uchwyty na nasiona w odległości dwóch centymetrów od siebie.Napełnij pojemniki na nasiona wermikulitem i umieść jedno ziarno słonecznika szpiczastym końcem w dół w każdym uchwycie, tak aby połowa nasion pozostała odsłonięta. Kiedy wszystkie nasiona zostaną platerowane, przykryj je dodatkowymi dwoma centymetrami drobnego wermikulitu i spryskaj wodą od góry. Po godzinie przykryj tace pokrywkami i umieść rośliny w komorze wzrostowej w szklarni.Aby skonfigurować system hydroponiczny, napełnij pojemnik odpowiedniej wielkości odpowiedni do hydroponicznej uprawy roślin wodą destylowaną i dodaj ogólny nawóz hydroponiczny zgodnie ze wskazaniami producenta. Następnie użyj pomp powietrza i wody, aby napowietrzyć powstały roztwór hydroponiczny przy ciągłym ruchu. Aby przygotować pływaki hydroponiczne, przyciąć arkusz styropianu o grubości dwóch centymetrów do wymiarów pojemnika i za pomocą narzędzia do spalania drewna wykonać otwory w piance o średnicy od jednego do dwóch centymetrów.Następnie umieść pływaki w systemie hydroponicznym. Pięć dni po posadzeniu delikatnie wyciągnij sadzonki z wermikulitu. Natychmiast umieść sadzonki w pojemniku z wodą na 30 minut, aby usunąć nadmiar wermikulitu i zmiękczyć pozostałe owocnie.Gdy pojawią się korzenie pierwotne, w razie potrzeby usuń owocnie ręcznie. Przenieś sadzonki w uchwytach na nasiona do przygotowanych pływaków z pianki polistyrenowej w systemie hydroponicznym. Uprawiaj rośliny w hydroponice przez dwa dni.Pozwól, aby chemikalia z małej biblioteki związków rozmroziły się w temperaturze pokojowej. Oznaczyć sześć beznasadkowych dwumililitrowych mikroprobówek do leczenia kontrolą ujemną, trzy probówki do leczenia ABA i końcowe 60 probówek do analizy skutków 20 substancji chemicznych będących przedmiotem zainteresowania w trzech egzemplarzach. Dodaj 10 mikrolitrów każdej substancji chemicznej do każdej z probówek, 10 mikrolitrów 10-milimolowego ABA i dimetylosulfotlenku do trzech probówek ABA i 10 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do sześciu probówek.Następnie ostrożnie wymieszaj 990 mikrolitrów 10-milimolowego wodorotlenku potasu MES z każdą probówką. Umieść probówki w stojaku na probówki z kontrolą dodatnią i ujemną oraz probówkami eksperymentalnymi równomiernie rozmieszczonymi w stojaku, aby uwzględnić odchylenie związane z położeniem. Aby skonfigurować kamerę termowizyjną, najpierw zamontuj kamerę na podstawce do kopiowania i podłącz wszystkie do laptopa.Włącz kamerę przed włączeniem laptopa i otwórz oprogramowanie do analizy termowizyjnej. Aby dostosować parametry nagrywania, najedź myszką na przycisk nagrywania, aby umożliwić wybór ikony klucza w obszarze Ustawienia nagrywania i wybierz odpowiedni tryb i opcje nagrywania. W celu zaprawienia sadzonek ostrożnie podnieś uchwyt na nasiona i szybko zanurz korzeń w płytkim naczyniu zawierającym wodę.Odetnij główny korzeń każdej sadzonki pod wodą 0,8 do jednego centymetra poniżej najbardziej podstawowego końca uchwytu na nasiona, aby zapobiec główieniu i włóż świeżo ściętą roślinę do jednej tubki z chemikaliami. Po przeniesieniu wszystkich sadzonek umieść rośliny pod kamerą termowizyjną i upewnij się, że wszystkie rośliny znajdują się w polu widzenia kamery. Aby ustawić ostrość aparatu na powierzchni liścieni, naciśnij Control Alt A i kliknij przycisk Nagraj film.Otworzy się nowe okno potwierdzające nagranie. Po jednej do dwóch godzin zatrzymaj nagrywanie. W celu analizy danych otwórz odpowiednie pliki sekwencyjne i wstrzymaj odtwarzanie filmu.Kliknij ikonę dodawania obszaru zainteresowania kursora pomiaru trzy na trzy piksele i przesuń kursor myszy na środek liścienia pierwszej rośliny. Kliknij lewym przyciskiem myszy obraz, aby oznaczyć liścienie. Oznacz drugi liścień pierwszej rośliny w ten sam sposób.Gdy wszystkie rośliny zostaną oznaczone dwoma kursorami, kliknij ikonę edycji obszarów zainteresowania i kliknij lewym przyciskiem myszy, przytrzymaj i przewiń, aby zaznaczyć wszystkie obszary zainteresowania. Następnie najedź myszką na ikonę przeglądarki statystyk i wybierz wykres czasowy. Otworzy się nowe okno.Uruchom film, wykres wypełni się danymi. Następnie w oknie wykresu kliknij podwójną strzałkę, aby otworzyć nowe menu i kliknij ikonę zapisywania, aby zapisać dane. Zastosowanie czerwonego barwnika erytrozyny B wykazuje zdolność substancji chemicznych do widocznego wchłaniania przez ścięty korzeń do liścieni sadzonki słonecznika w ciągu 10 minut.Kiedy rośliny są traktowane ABA, w ciągu 30 minut wykrywa się wzrost temperatury liści w liścieniach słonecznika, co wiąże się ze zmniejszeniem otworu szparkowego i przewodnictwa szparkowego. Ponadto podwyższoną temperaturę liści obserwuje się 15 minut po zastosowaniu 10 mikromolowych ABA i 20 minut po zastosowaniu pięciu mikromolowych ABA, co pokazuje, że pomiar temperatury liści za pomocą obrazowania termicznego jest dobrym wskaźnikiem zastępczym do pomiaru apertury i przewodności aparatów szparkowych. W tym reprezentatywnym eksperymencie standardowe leczenie statystyczne oparte na punktacji pozwala na identyfikację substancji chemicznych, które sprzyjają zamykaniu lub otwieraniu aparatów szparkowych.Aby zmierzyć wpływ związków na transpirację, ważne jest, aby uprawiać rośliny w optymalnych warunkach światła, wilgotności i temperatury. Ten protokół można zastosować do większości roślin dwuliściennych. Można go również wykorzystać do oceny wpływu nowych związków na wydajność fotosyntezy, na przykład poprzez pomiar fluorescencji chlorofilu.

identification-novel-regulators-plant-transpiration-large-scale

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Opisujemy stosunkowo szybką (30 min) i realistyczną metodę jednoczesnego pomiaru przewodności hydraulicznej liścia (Kleaf) oraz przewodności szparkowej (gs) dla transpirujących liści odciętych. Metodę tę można zmodyfikować w celu pomiaru odpowiedzi Kleaf oraz gs na światło i odwodnienie.

Pomiar przewodności hydraulicznej liści oraz przewodności szparkowej i ich odpowiedzi na natężenie promieniowania oraz odwodnienie z wykorzystaniem metody strumienia ewaporacyjnego (EFM)

Ten protokół został opracowany w celu przesiewania dużej kolekcji plazmy zarodkowej liściastej sałaty warzywnej (Lactuca sativa L.) pod kątem tolerancji na suszę, w celu zidentyfikowania małej puli kandydatów do wykorzystania w badaniach fizjologicznych, molekularnych i genetycznych w celu zidentyfikowania podstawowych cech tolerancji na suszę wraz z programami hodowlanymi.

Półwysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem potencjalnej tolerancji na suszę w kolekcjach plazmy zarodkowej sałaty (Lactuca sativa)

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala na wizualizację miejsc powstawania lodu i dróg rozprzestrzeniania się lodu w roślinach za pomocą termografii w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości (HRIT).

Wykorzystanie termografii w podczerwieni o wysokiej rozdzielczości (HRIT) do badania zarodkowania i propagacji lodu w roślinach

Metoda została opracowana w celu określenia właściwej pojemności cieplnej i przewodności cieplnej tkanki liścia za pomocą nieinwazyjnego, bezdotykowego sondowania laserowego w bliskiej podczerwieni, które wymaga mniej niż 1 minuty na próbkę.

Szybka metoda sondowania laserowego umożliwia nieinwazyjne i bezdotykowe określanie właściwości termicznych liści

Ta wysokoprzepustowa, telemetryczna, grawimetryczna metoda fenotypowania stosunków wodnych całej rośliny umożliwia bezpośrednie i jednoczesne pomiary w czasie rzeczywistym, a także analizę wielu cech fizjologicznych związanych z plonami, zaangażowanych w dynamiczne interakcje roślina-środowisko.

Telemetryczna, grawimetryczna platforma do fizjologicznego fenotypowania interakcji między roślinami a środowiskiem w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy prostą metodę bezpośredniej obserwacji i automatycznego pomiaru reakcji aparatów szparkowych na inwazję bakterii u Arabidopsis thaliana. Metoda ta wykorzystuje przenośne urządzenie do obrazowania aparatów szparkowych wraz z potokiem analizy obrazu przeznaczonym do obrazów liści zarejestrowanych przez urządzenie.

Bezpośrednia obserwacja i automatyczny pomiar reakcji aparatów szparkowych na Pseudomonas syringae pv. pomidor DC3000 w rzodkiewniku pospolitym (Arabidopsis thaliana)

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Wielkoskalowa immunodetekcja białek docelowych w całym mózgu naczelnych jest możliwa dzięki zastosowaniu nowatorskich metod zatapiania i krojenia tkanek w połączeniu z wykorzystaniem innowacyjnego urządzenia do masowego barwienia wielu wolnopływających skrawków jednocześnie.

Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Odkryj metodę identyfikacji związków regulujących transpirację roślin za pomocą obrazowania termicznego u Helianthus annuus. Technika ta umożliwia badanie aktywności aparatów szparkowych i efektywności wykorzystania wody.

Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

Przeglądaj więcej filmów