Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

Protokół ten wykorzystuje obrazowanie termiczne do identyfikacji nowych związków zdolnych do regulowania transpiracji roślin. Technika ta jest wszechstronna pod względem gatunków roślin, które można testować, charakteru związku i rodzaju obrazowania. Aby przygotować rośliny do uprawy, najpierw dodaj warstwę drobnego wermikulitu o grubości czterech centymetrów do standardowych tacek na rośliny o wymiarach 10 na 20 cali bez otworów i umieść w tacach uchwyty na nasiona w odległości dwóch centymetrów od siebie.

Napełnij pojemniki na nasiona wermikulitem i umieść jedno ziarno słonecznika szpiczastym końcem w dół w każdym uchwycie, tak aby połowa nasion pozostała odsłonięta. Kiedy wszystkie nasiona zostaną platerowane, przykryj je dodatkowymi dwoma centymetrami drobnego wermikulitu i spryskaj wodą od góry. Po godzinie przykryj tace pokrywkami i umieść rośliny w komorze wzrostowej w szklarni.

Aby skonfigurować system hydroponiczny, napełnij pojemnik odpowiedniej wielkości odpowiedni do hydroponicznej uprawy roślin wodą destylowaną i dodaj ogólny nawóz hydroponiczny zgodnie ze wskazaniami producenta. Następnie użyj pomp powietrza i wody, aby napowietrzyć powstały roztwór hydroponiczny przy ciągłym ruchu. Aby przygotować pływaki hydroponiczne, przyciąć arkusz styropianu o grubości dwóch centymetrów do wymiarów pojemnika i za pomocą narzędzia do spalania drewna wykonać otwory w piance o średnicy od jednego do dwóch centymetrów.

Następnie umieść pływaki w systemie hydroponicznym. Pięć dni po posadzeniu delikatnie wyciągnij sadzonki z wermikulitu. Natychmiast umieść sadzonki w pojemniku z wodą na 30 minut, aby usunąć nadmiar wermikulitu i zmiękczyć pozostałe owocnie.

Gdy pojawią się korzenie pierwotne, w razie potrzeby usuń owocnie ręcznie. Przenieś sadzonki w uchwytach na nasiona do przygotowanych pływaków z pianki polistyrenowej w systemie hydroponicznym. Uprawiaj rośliny w hydroponice przez dwa dni.

Pozwól, aby chemikalia z małej biblioteki związków rozmroziły się w temperaturze pokojowej. Oznaczyć sześć beznasadkowych dwumililitrowych mikroprobówek do leczenia kontrolą ujemną, trzy probówki do leczenia ABA i końcowe 60 probówek do analizy skutków 20 substancji chemicznych będących przedmiotem zainteresowania w trzech egzemplarzach. Dodaj 10 mikrolitrów każdej substancji chemicznej do każdej z probówek, 10 mikrolitrów 10-milimolowego ABA i dimetylosulfotlenku do trzech probówek ABA i 10 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do sześciu probówek.

Następnie ostrożnie wymieszaj 990 mikrolitrów 10-milimolowego wodorotlenku potasu MES z każdą probówką. Umieść probówki w stojaku na probówki z kontrolą dodatnią i ujemną oraz probówkami eksperymentalnymi równomiernie rozmieszczonymi w stojaku, aby uwzględnić odchylenie związane z położeniem. Aby skonfigurować kamerę termowizyjną, najpierw zamontuj kamerę na podstawce do kopiowania i podłącz wszystkie do laptopa.

Włącz kamerę przed włączeniem laptopa i otwórz oprogramowanie do analizy termowizyjnej. Aby dostosować parametry nagrywania, najedź myszką na przycisk nagrywania, aby umożliwić wybór ikony klucza w obszarze Ustawienia nagrywania i wybierz odpowiedni tryb i opcje nagrywania. W celu zaprawienia sadzonek ostrożnie podnieś uchwyt na nasiona i szybko zanurz korzeń w płytkim naczyniu zawierającym wodę.

Odetnij główny korzeń każdej sadzonki pod wodą 0,8 do jednego centymetra poniżej najbardziej podstawowego końca uchwytu na nasiona, aby zapobiec główieniu i włóż świeżo ściętą roślinę do jednej tubki z chemikaliami. Po przeniesieniu wszystkich sadzonek umieść rośliny pod kamerą termowizyjną i upewnij się, że wszystkie rośliny znajdują się w polu widzenia kamery. Aby ustawić ostrość aparatu na powierzchni liścieni, naciśnij Control Alt A i kliknij przycisk Nagraj film.

Otworzy się nowe okno potwierdzające nagranie. Po jednej do dwóch godzin zatrzymaj nagrywanie. W celu analizy danych otwórz odpowiednie pliki sekwencyjne i wstrzymaj odtwarzanie filmu.

Kliknij ikonę dodawania obszaru zainteresowania kursora pomiaru trzy na trzy piksele i przesuń kursor myszy na środek liścienia pierwszej rośliny. Kliknij lewym przyciskiem myszy obraz, aby oznaczyć liścienie. Oznacz drugi liścień pierwszej rośliny w ten sam sposób.

Gdy wszystkie rośliny zostaną oznaczone dwoma kursorami, kliknij ikonę edycji obszarów zainteresowania i kliknij lewym przyciskiem myszy, przytrzymaj i przewiń, aby zaznaczyć wszystkie obszary zainteresowania. Następnie najedź myszką na ikonę przeglądarki statystyk i wybierz wykres czasowy. Otworzy się nowe okno.

Uruchom film, wykres wypełni się danymi. Następnie w oknie wykresu kliknij podwójną strzałkę, aby otworzyć nowe menu i kliknij ikonę zapisywania, aby zapisać dane. Zastosowanie czerwonego barwnika erytrozyny B wykazuje zdolność substancji chemicznych do widocznego wchłaniania przez ścięty korzeń do liścieni sadzonki słonecznika w ciągu 10 minut.

Kiedy rośliny są traktowane ABA, w ciągu 30 minut wykrywa się wzrost temperatury liści w liścieniach słonecznika, co wiąże się ze zmniejszeniem otworu szparkowego i przewodnictwa szparkowego. Ponadto podwyższoną temperaturę liści obserwuje się 15 minut po zastosowaniu 10 mikromolowych ABA i 20 minut po zastosowaniu pięciu mikromolowych ABA, co pokazuje, że pomiar temperatury liści za pomocą obrazowania termicznego jest dobrym wskaźnikiem zastępczym do pomiaru apertury i przewodności aparatów szparkowych. W tym reprezentatywnym eksperymencie standardowe leczenie statystyczne oparte na punktacji pozwala na identyfikację substancji chemicznych, które sprzyjają zamykaniu lub otwieraniu aparatów szparkowych.

Aby zmierzyć wpływ związków na transpirację, ważne jest, aby uprawiać rośliny w optymalnych warunkach światła, wilgotności i temperatury. Ten protokół można zastosować do większości roślin dwuliściennych. Można go również wykorzystać do oceny wpływu nowych związków na wydajność fotosyntezy, na przykład poprzez pomiar fluorescencji chlorofilu.