Dereplikacja antybiotyków przy użyciu platformy oporności na antybiotyki

Nasz protokół jest istotny, ponieważ pozwala zarówno na opłacalną, jak i terminową dereplikację znanych antybiotyków bez użycia specjalistycznego sprzętu. Główną zaletą tej techniki jest dostosowanie szablonu. Oznacza to, że dana osoba może dostosować, które geny oporności chce włączyć do swojego szablonu bibliotecznego w oparciu o pożądany poziom swoistości szerokiego lub wąskiego substratu.

Na przykład, matrycę E. coli z ekspresją beta-laktamu można przygotować, aby umożliwić wysoce specyficzną dereplikację beta-laktamów i ich różnych podklas. Stosując technikę septyczną, odpipetuj 500 mikrolitrów kationu wyregulowanego MHB ze sterylnego zbiornika do każdej studzienki sterylnej płytki o głębokości 96 studzienek. Za pomocą przygotowanych płytek szczepowych ARP lub MARP użyj aplikatora w sztyfcie, aby zaszczepić płytkę z 96 głębokimi dołkami zgodnie z mapą ARP lub MARP.

Umieść oddychającą membranę uszczelniającą na powierzchni płytki głębokiej studzienki i inkubuj ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 250 obr./min. Upewnij się, że nie ma zanieczyszczonych studni. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 mikrolitrów z każdej studzienki płytki głębokiej na sterylną 96-dołkową okrągłą płytkę denną.

Dodaj 100 mikrolitrów sterylnego 50% glicerolu do każdej studzienki i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę iw dół. Przygotuj co najmniej pięć tabliczek bibliotecznych. Przykryj płytki sterylnymi aluminiowymi uszczelkami i upewnij się, że każda studzienka jest indywidualnie uszczelniona.

Umieść pokrywkę płyty na aluminiowej uszczelce i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Za pomocą drewnianego patyczka do aplikatora delikatnie zeskrob zarodniki z powierzchni kolonii Streptomyces i przenieś je do probówki zawierającej jeden sterylny szklany koralik i trzy mililitry pożywki antybiotykowej Streptomyces. Zamknij luźno probówkę nakrętką, aby umożliwić napowietrzenie.

Używając tego samego drewnianego aplikatora w sztyfcie, nałóż smugę kontroli sterylności na szalce Petriego zawierającej agar Bennetta. Inkubować probówkę zawierającą kulturę nasion w temperaturze 30 stopni Celsjusza z napowietrzaniem przez sześć dni przy 250 obr./min, a płytkę kontrolną sterylności w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez sześć dni. Następnie na równej powierzchni przygotuj płytki dereplikacyjne

Zassać 23 mililitry ciepłego agaru Bennetta do pipety serologicznej i równomiernie rozprowadzić 20 mililitrów na powierzchni prostokątnej szalki Petriego, pozostawiając pozostałą część pożywki w pipecie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Przykryj talerz pokrywką. Delikatnie obracaj płytkę, aż podłoże pokryje wszystkie obszary płytki i nie przeszkadzaj jej, dopóki agar całkowicie nie stwardnieje.

Następnie przygotuj arkusze membrany nitrocelulozowej, używając prostokątnej pokrywki szalki Petriego jako szablonu do śledzenia, tak aby arkusze pasowały do powierzchni płytki dereplikacyjnej. Pokrój arkusze i sterylizuj je w autoklawie w sterylnej torebce. Teraz sprawdź płytkę kontrolną sterylności, aby upewnić się, że po sześciu dniach inkubacji nie ma żadnych zanieczyszczeń.

Jeśli jest wolna od zanieczyszczeń, zdjąć pokrywkę z prostokątnej szalki Petriego i odpipetować 200 mikrolitrów kultury nasiennej na powierzchnię agaru Bennetta w prostokątnym naczyniu. Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby równomiernie rozprowadzić kulturę na całej powierzchni płytki. Aby umieścić przygotowaną błonę nitrocelulozową na wierzchu kultury na powierzchni szalki Petriego, należy wyrównać dolną krawędź membrany z dolną krawędzią szalki Petriego i powoli nakładać membranę od dolnej krawędzi do górnej krawędzi płytki.

Użyj sterylnego bawełnianego wacika, aby wygładzić wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły powstać między interfejsem agaru membranowego, upewniając się, że membrana jest równo z agarem. Błona pozwala organizmom na zarodnikowanie na jej powierzchni, podczas gdy metabolity wtórne mogą być wydalane do pożywki poniżej. Załóż pokrywkę z powrotem na prostokątną szalkę Petriego i umieść ją do góry nogami w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.

Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez sześć dni. Po sześciu dniach wyjąć płytkę dereplikacyjną z inkubatora. Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie usuń membranę nitrocelulozową z powierzchni agaru Bennetta.

Upewnij się, że wokół krawędzi płytki nie ma tylko niewielkiego wzrostu zarodników, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia nakładki, która ma zostać dodana. Upewnij się, że powierzchnia robocza jest równa i użyj pipety serologicznej, aby zassać 23 mililitry ciepłego agaru MHB z regulacją kationową. Utwórz nakładkę, dozując 20 mililitrów równomiernie na powierzchni płytki do dereplikacji, pozostawiając pozostałą część agaru w pipecie, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.

Umieść pokrywkę na talerzu. Delikatnie obracaj płytkę, aż podłoże pokryje wszystkie obszary i nie przeszkadzaj jej, dopóki agar całkowicie nie stwardnieje. Po schłodzeniu i zestaleniu należy umieścić płytkę do dereplikacji z powrotem w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie i przechowywać ją do góry nogami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, co pozwala na dyfuzję metabolitów wtórnych do nakładki agarowej MHB.

Tego samego dnia należy zaszczepić świeżą matrycę ARP lub MARP, najpierw pipetując 100 mikrolitrów MHB z dostosowaniem do kationów do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Wyjmij zamrożoną płytę biblioteczną ARP lub MARP z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zdejmij aluminiową uszczelkę, zanim na jej spodniej stronie zacznie tworzyć się kondensacja.

Używając sterylnych 96-dołkowych narzędzi do przypinania, ostrożnie przypnij z zamrożonej płytki biblioteki ARP lub MARP i zaszczepij świeże MHB zawierające 96-dołkowe płytki. Aby zminimalizować zanieczyszczenie podczas dereplikacji, należy przygotować tyle płyt bibliotecznych ARP lub MARP, ile potrzeba do dereplikacji tylko dwóch do trzech płyt dereplikacji na jedną płytę biblioteczną. Po zakończeniu umieść nową sterylną aluminiową uszczelkę na zamrożonym szablonie i włóż go z powrotem do zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Umieścić zaszczepione 96-dołkowe płytki w luźno zamkniętej plastikowej torbie i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min przez 18 godzin. Wyjmij matrycę ARP lub MARP z inkubatora i upewnij się, że nie ma żadnych zanieczyszczeń, porównując płytkę z mapą matrycy ARP lub MARP. Usunąć płytki do dereplikacji z czterech stopni Celsjusza i pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej.

Jeśli dojdzie do kondensacji, otwórz pokrywki i pozostaw do wyschnięcia w sterylnym środowisku. Za pomocą sterylnych narzędzi do przypinania, przypiąć płytkę z biblioteki ARP lub MARP do powierzchni nakładki agaru MHB na płytkach dereplikacyjnych. Uważaj, aby nie przekłuć agaru.

Pozostawić inokulum szablonu do wyschnięcia na trzy do pięciu minut. Umieść zaszczepione płytki dereplikacyjne do góry nogami w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przeanalizuj wyniki dereplikacji, porównując wzrost na płytce dereplikacyjnej ze studzienkami, które odpowiadają mapie ARP lub MARP.

W tym przepływie pracy dereplikacji ARP lub MARP osiągnięto pozytywny wynik dereplikacji. Przy czym ekstrakt przygotowany dla szczepu WAC 8921 został zidentyfikowany jako producent chloramfenikolu. Brak wzrostu ARP wskazuje na obecność nieznanego antybiotyku lub rzadziej spotykanego antybiotyku, który nie został uwzględniony na tabliczce biblioteki ARP lub MARP.

Wzorzec wzrostu unikalny dla MARP powstał ze względu na wykorzystanie zarówno dzikich BW25113 E. coli, jak i hiperprzepuszczalnego i pozbawionego strumienia E. coli mutanta BW25113 bamB tolC. Wynik ten sugeruje obecność związku o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, który nie był w stanie przekroczyć nienaruszonej błony zewnętrznej. Ten wzorzec wzrostu E.coli sugeruje niewłaściwą sterylizację narzędzi do przypinania, co skutkuje przenoszeniem nieznanych szczepów E. coli przez nakładkę.

Przykładem zanieczyszczenia zamrożonych płytek z biblioteki ARP lub MARP są trzy odrębne kolonie E. coli wyhodowane na prostokątnej powierzchni szalki Petriego. Wynik ten wskazuje, że nakładka agarowa została przebita podczas dereplikacji. Zanieczyszczenie związane z nakładką MHB może również wystąpić podczas procesu dereplikacji, wykazując nieregularny wzór wzrostu na powierzchni nakładki.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas przestrzegania tego protokołu, jest stosowanie odpowiednich technik sterylizacji i aseptyki, aby upewnić się, że nie zostaniesz zatrzymany na żadnym kroku z powodu zanieczyszczenia. Obejmuje to przygotowanie membrany nitrocelulozowej tak, aby jak najdokładniej przylegała do powierzchni płytki agarowej Bennetta, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się zarodników podczas nalewania nakładki MHB. Dodatkowo, niezwykle ważne jest również, aby używać odpowiednio wysterylizowanego sprzętu do przypinania podczas zaszczepiania płytek bibliotecznych i dereplikacji w celu uzyskania najczystszego wyniku.

Oprócz dereplikacji znanych antybiotyków, metoda ta może być stosowana do identyfikacji adiuwantów, które mogą być stosowane w połączeniu z istniejącymi antybiotykami w celu ratowania ich aktywności. Chociaż dereplikacja antybiotyków nie jest nową techniką, jest znana z tego, że jest zasobożerna i czasochłonna. Platformy ARP i MARP pomagają rzucić światło na to, że dereplikacja antybiotyków nie musi być produkowana na dużą skalę, ale może być zakończona w ciągu dwóch tygodni przy użyciu minimalnej ilości sprzętu.