Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Większość badań nad liposomami opiera się na odważnych technikach, które z natury rzeczy zakładają, że wszystkie liposomy są identyczne. Badając pojedyncze liposomy, można zaobserwować znaczne niejednorodności. Przedstawiona tutaj technika pojedynczego liposomu pozwala nam badać setki liposomów jednocześnie i wykrywać niejednorodności w ich wielkości i składzie.

Metodę tę można łatwo dostosować do badania innych systemów na poziomie pojedynczych liposomów, takich jak interakcje błony białkowej. Wszystko, czego potrzebujesz, to badany związek, który zostanie znakowany fluorescencyjnie. W tym filmie udostępniamy naukowcom narzędzie, w jaki sposób mogą przeprowadzać badania pojedynczego liposomu.

Mamy nadzieję, że jasne jest, że test można łatwo zmodyfikować w celu zbadania szeregu innych tematów naukowych. Na początek wymieszaj przygotowane lipidy ze 138 mikrolitrami POPC i 120 mikrolitrami cholesterolu w świeżej szklanej fiolce. Następnie dodaj po 500 mikrolitrów po dwa fluorescencyjnie znakowane lipidy i 50 mikrolitrów DSPE-PEG-biotyny.

Poluzować pokrywkę szklanej fiolki i zatrzaskowo zamrozić fiolkę w ciekłym azocie na jedną do dwóch minut. Liofilizuj zamrożoną mieszaninę lipidów przez noc w liofilizatorze. Rano dodaj jeden mililitr 200-milimolowego buforu D-sorbitolu do suchych lipidów.

Podgrzej mieszaninę do 45 stopni Celsjusza i poddaj mieszaniu magnetycznemu przez co najmniej godzinę. Następnie zamrozić zawiesinę lipidową, zanurzając fiolkę w ciekłym azocie i poczekać, aż zawiesina zostanie całkowicie zamrożona. Następnie zanurz zamrożoną zawiesinę w łaźni grzewczej o temperaturze 55 stopni Celsjusza, aż mieszanina całkowicie się rozmrozi

Poddać mieszaninę łącznie 11 cyklom zamrażania i rozmrażania. Następnie, za pomocą mini zestawu do wytłaczania, wytłacz zawiesinę liposomów raz przez filtr poliwęglanowy o długości 800 nanometrów. Wymieszaj 1, 200 mikrolitrów BSA i 120 mikrolitrów biotyny BSA.

Dodaj 300 mikrolitrów mieszaniny do każdego dołka w ośmiodołkowym szkiełku i inkubuj szkiełko przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Lekko przechylić szkiełko i od krawędzi każdej studzienki zassać podłoże. Natychmiast dodaj 300 mikrolitrów buforu HEPES do każdej studzienki w celu umycia.

Umyj każdą studzienkę w sumie osiem razy. Dodaj 250 mikrolitrów streptawidyny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz osiem prań zgodnie z wcześniejszym opisem.

Umieść szkiełko na mikroskopie i wyreguluj joystick mikroskopu, aby ustawić ostrość na powierzchni komory. Można to łatwo zrobić, wykorzystując jako wskazówkę zwiększony sygnał odbicia laserowego z interfejsu szklanego bufora. W probówce do mikrowirówek dodać 10 mikrolitrów rozcieńczonego wywaru liposomowego zawierającego 20 mikromolowych lipidów całkowitych.

Przenieś 100 mikrolitrów buforu z komory do probówki mikrowirówkowej, odpowiednio wymieszaj i przenieś 110 mikrolitrów z powrotem do komory. Umieść komorę pod mikroskopem i użyj podstawowego ustawienia mikroskopu zdolnego do wykrywania sygnału z fluoroforów liposomów, aby obserwować unieruchomienie liposomów na powierzchni. Ustaw mikroskop zgodnie z opisem w rękopisie.

Aby zobrazować zarówno ATTO488 DOPE, jak i fluorofory DOPE ATTO655 w liposomach, zobrazuj wiele kanałów. Upewnij się, że każdy kanał jest obrazowany sekwencyjnie, aby uniknąć wzbudzenia krzyżowego. Na przykład, najpierw zrób jedno zdjęcie, wzbudzając przy 488 nanometrach i odczytując emisję przy 495 do 590 nanometrach.

Następnie zmień ustawienia i zrób kolejny obraz, wzbudzając przy 633 nanometrach, ale odczytując emisję tylko przy 660 do 710 nanometrach. Analizować. Z menu obrazu wybierz kolor i użyj funkcji scalania kanałów, aby utworzyć kompozyt dwóch kanałów. Obserwuj, czy liposomy zobrazowane w dwóch różnych kanałach wykazują dobrą kolokalizację lub czy wystąpił widoczny dryf.

Aby wykryć cząsteczki, otwórz menu wtyczek, wybierz ComDet i kliknij wykryj cząsteczki. W ComDet sprawdź, czy ustawienia są poprawne i naciśnij OK. Po uruchomieniu analizy pojawiają się dwa wyskakujące okienka z wynikami i podsumowaniem. Tabela wyników zawiera stosunek intensywności między dwoma kanałami.

Wyeksportuj wyniki tabeli danych zawierające dane kolokalizacji. Dopasuj histogram współczynnika intensywności do funkcji Gaussa i wyodrębnij średnią i odchylenie standardowe. Średnia i odchylenie standardowe mogą być użyte do obliczenia stopnia niejednorodności.

Przygotuj preparat liposomowy, który został kilkakrotnie wytłoczony przez filtr o długości 50 nanometrów. Skalibruj rozmiar liposomów, porównując intensywność fluorescencji z danymi dotyczącymi wielkości z DLS. Przy tych samych ustawieniach mikroskopu eksperymentalnego, co poprzednio, zobrazuj liposomy kalibracyjne.

Wykreślić histogram intensywności pierwiastka kwadratowego intensywności fluorescencji liposomów kalibracyjnych. Dopasuj histogram do logarytmicznego rozkładu normalnego i wyodrębnij średnią intensywność fluorescencji liposomów kalibracyjnych jako średnią geometryczną. Aby określić zależność między intensywnością pierwiastka kwadratowego a wielkością liposomu, należy obliczyć współczynnik korekcyjny, dzieląc średnią średnicę liposomu uzyskaną z pomiarów dynamicznego rozpraszania światła przez średnią geometryczną intensywności pierwiastka kwadratowego.

Oblicz wartości intensywności pierwiastka kwadratowego dla liposomów w eksperymencie niejednorodności składu i przelicz te dwie średnice, mnożąc je przez współczynnik korekcyjny. Wykreślić wartość współczynnika intensywności w funkcji średnicy dla liposomów o niejednorodności składu, uzyskując w ten sposób niejednorodność w funkcji wielkości liposomu dla populacji liposomów o długości od około 50 nanometrów do 800 nanometrów. W tym protokole pomyślne unieruchomienie powierzchni liposomów było natychmiast widoczne po dodaniu roztworu liposomu do komory wskazanej przez plamki o ograniczonej intensywności dyfrakcji.

Zaleca się unieruchomienie wystarczającej ilości liposomów, aby osiągnąć gęstość od 300 do 400 liposomów na ramkę. Mniejsza gęstość sprawia, że analiza danych jest bardziej czasochłonna, podczas gdy wyższa gęstość utrudnia rozróżnienie pojedynczych liposomów. Jeśli całe pole view nie jest odpowiednio ostre, płytka próbki może się przechylać.

Ponadto, jeśli liposomy wydają się duże i rozmyte, oznacza to, że bufor w komorze mógł wyparować, a powierzchnia wyschła. Histogramy współczynnika intensywności zazwyczaj pokazują rozkład Gaussa wokół średniej wartości współczynnika. Jeśli zaobserwuje się silne odchylenia od rozkładu Gaussa, wskazuje to na problem z czułością detekcji, co sugeruje, że podzbiór liposomów wykazujących słabszy sygnał został wykluczony.

Po dopasowaniu histogramu współczynnika intensywności do funkcji Gaussa, stopień wartości niejednorodności wynoszący 0,23 został przeliczony na 32% populacji, różniąc się o ponad 23% od średniego stosunku molowego zespołu. Stwierdzono, że kwantyfikacja niepewności doświadczalnej wynosi 0,1. Test nigdy nie będzie lepszy niż materiały, których używasz, dlatego niezbędne są wysokiej jakości liposomy uniilaminarne.

Więc kiedy je przygotowujesz, nie idź na skróty, na przykład pomijając cykle zamrażania i rozmrażania. Słabe obrazy prowadzą do dużej niepewności eksperymentalnej i skłaniają do przeszacowania niejednorodności, dlatego poświęć trochę czasu na uzyskanie dobrych, ostrych obrazów. To, co zasadniczo robi test, to badanie gęstości powierzchniowej znacznika fluorescencyjnego.

Jeśli ta fluorescencyjna etykieta znajduje się na perkolowanym lipidie, to test ten można wykorzystać do badania jakości liposomów pod kątem dostarczania leków. Konfiguracja została zastosowana do zbadania, w jaki sposób peptydy wiążą się z błonami i wyczuwają krzywiznę. Dało to naukowcom unikalny wgląd w sygnały molekularne, które rządzą sposobem sortowania peptydów w komórkach.