Name: Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę odwarstwiania komórek śródbłonka rogówki za pomocą lasera Nd:YAG na modelu świńskiego oka. Ta technika umożliwia badanie wczesnych stadiów rogówki pęcherzowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Christine Örün i Janowi A. M. Sochurek za pomoc w metodach eksperymentalnych.

Wszystkie procedury związane z tkankami zwierzęcymi są zgodne z wytycznymi lokalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki.
1. Przygotowanie hodowli narządowej i leczenie laserowe
<ol>
	<li>Pobrać świeżo wyłuszczone oczy świni z lokalnej rzeźni. Utrzymuj je w chłodzie (4 °C) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej L-glutaminą, pirogronianem sodu, penicyliną/streptomycyną (1%) i surowicą świńską (10%), zwaną dalej w tym artykule pełną pożywką.</li>
	<li>Usuń tkanki zewnątrzkomórkowe nożyczkami i namocz oczy w 5% roztworze okulistycznym z jodowidonem na 5 minut przed umieszczeniem ich w wysterylizowanym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do czasu użycia.</li>
	<li>Monitoruj oczy pod kątem głównych patologii przedniego odcinka, takich jak bliznowacenie rogówki, obrzęk i inne zmętnienia za pomocą urządzenia do optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej (tabela materiałów).</li>
	<li>Ustaw oczy przed lampą szczelinową wyposażoną w laser Nd:YAG (Tabela materiałów), który ma długość fali 1,064 nm i średnicę ogniska 10 μm w powietrzu. 
	UWAGA: Do optymalnego pozycjonowania używany jest wydrukowany w 3D aparat podtrzymujący, który został zaprojektowany tak, aby mocno trzymać oko, bez wywierania na nie zbyt dużego nacisku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Użyj 12-krotnego powiększenia i odchyl oświetlenie, aby uwidocznić poszczególne warstwy rogówki.</li>
	<li>Ustaw energię impulsu (np. 1.6 mJ) i punkt ostrości (np. 0.16 mm) do selektywnej ablacji komórek śródbłonka.</li>
	<li>Umieść przezroczystą paracentezę rogówki w pobliżu rąbka i wstrzyknij lepkosprężystość (tabela materiałów), aby ustabilizować przednią komorę.</li>
	<li>Wyciąć centralną rogówkę poddaną obróbce laserowej za pomocą trepanacji o średnicy 8 mm.</li>
	<li>Umieścić wyciętą rogówkę w studzience na 12-dołkowej płytce ze śródbłonkiem skierowanym do góry i inkubować próbkę w 3 ml pełnej pożywki w temperaturze 37 °C przez okres do 3 dni. 
	UWAGA: Na tym etapie do pożywki można dodać potencjalne środki cytoprotekcyjne.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do histologii
<ol>
	<li>Przygotować bufor Sorensena o pH 7,4 zawierający 19,6 ml 133 mM KH2PO4 i 80,4 ml 133 mM Na2HPO4.</li>
	<li>Usunąć pożywkę ze studzienki zawierającej rogówkę i utrwalić tkankę przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą paraformaldehydu bez metanolu (4%) w buforze Sorensena.</li>
	<li>Umieścić tkankę w 20% sacharozie w PBS, aż tkanka opadnie (1 godzina), a następnie w 30% sacharozie w PBS na noc w temperaturze pokojowej. Uważaj, aby uniknąć kontaktu z pęcherzykami i powierzchnią powierzchni. Zanurzyć tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Ciąć odcinki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu w temperaturze -27 °C. 
	UWAGA: Szczotka do włosów wielbłąda jest przydatna, aby pomóc w prowadzeniu wyłaniającej się części po ostrzu noża.</li>
	<li>Przenieś wycinek na szkiełko mikroskopowe, dotykając szkiełka do tkanki w ciągu 1 minuty od jej przecięcia, aby uniknąć liofilizacji tkanki. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Suszyć sekcje na powietrzu przez kilka minut, aby usunąć wilgoć.</li>
	<li>Barwienie przefiltrowaną 0,1% hematoksyliną Mayersa przez 10 minut w probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>W słoiku Coplin płucz w chłodnym działaniu ddH2O przez 5 minut i zanurz w 0,5% eozynie 10x.</li>
	<li>Zanurz w ddH2O, aż eozyna przestanie się smugać, a następnie zanurz w 50% (10x) i 70% (10x) EtOH.</li>
	<li>Zrównoważyć 95% EtOH (30 s) i 100% EtOH (60 s) przed kilkukrotnym zanurzeniem w ksylenie.</li>
	<li>Na koniec zamontuj i nakryj preparat przed wykonaniem zdjęć za pomocą mikroskopu świetlnego.</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyniki tego badania pilotażowego wskazują, że laser Nd:YAG może być używany do selektywnej ablacji komórek śródbłonka rogówki po wybraniu odpowiednich parametrów dawki energii i położenia punktu skupienia.
Ponieważ funkcja śródbłonka jest ważna dla przezroczystości rogówki i ochrony rogówki przed obrzękiem zrębu, modele dysfunkcji śródbłonka odgrywają ważną rolę w opracowywaniu leków przeciwobrzękowych lub zabiegów chirurgicznych. Istnieje kilka uznanych modeli in vitro do naśladowania sytuacj...

Przezroczystość rogówki jest niezbędna do transmisji światła do siatkówki i jej fotoreceptorów1. W związku z tym względny stan odwodnienia ma kluczowe znaczenie dla utrzymania prawidłowego wyrównania włókien kolagenowych w zrębie rogówki. Ta homeostaza jest utrzymywana przez komórki śródbłonka rogówki (CEC) znajdujące się na błonie Descemeta (DM)2. Śródbłonek jest najbardziej wewnętrzną warstwą rogówki. Pełni ważną funkcję bariery i pompy, która ma kluczowe znaczenie dla przezroczystości rogówki3. W przeciwieństwie do nabłonka, śródbłonek nie jest w stanie samoodnawiać się4. W związku z tym każde uszkodzenie komórek spowodowane chorobą lub urazem stymuluje pozostałe komórki śródbłonka do powiększania się i migracji, do pokrywania powstałych wad i utrzymania funkcjonalności rogówki5. Jeśli jednak gęstość CEC spadnie poniżej progu krytycznego, dekompensacja śródbłonka prowadzi do obrzęku, skutkującego niewyraźnym widzeniem i dyskomfortem, a nawet silnym bólem4. Pomimo dostępności leków łagodzących objawy, obecnie jedynym ostatecznym leczeniem w tych przypadkach jest przeszczep rogówki, który można wykonać w postaci przeszczepu pełnej grubości lub przeszczepu śródbłonka blaszkowatego. Ta ostatnia procedura jest dostępna jako keratoplastyka śródbłonka błony Descemeta (DMEK), a także automatyczna keratoplastyka śródbłonka Descemeta (DSAEK)6. Jednak ochrona pozostałych CEC i zwiększenie ich przeżywalności może być alternatywnym celem, który wymaga odpowiedniego modelu choroby do testowania potencjalnych leków terapeutycznych.
Obecne modele chorób utraty CEC koncentrują się na niszczeniu śródbłonka poprzez wstrzykiwanie środków toksycznych (np. chlorku benzalkoniowego) do przedniej komory lub przez mechaniczne ścieranie komórek przy użyciu inwazyjnej techniki descemetorhexis7,8. Chociaż modele te są dobrze ugruntowane, istnieją wady, takie jak ogólna reakcja zapalna i nieprecyzyjne uszkodzenia uboczne. Dlatego bardziej prawdopodobne jest, że modele te reprezentują końcowe etapy choroby, kiedy wyżej wymienione opcje chirurgiczne są nieuniknione.
Dzięki postępom w strategiach leczenia komórkowego, takich jak komórki macierzyste i terapia genowa, zastosowanie tych terapii komórkowych może być przydatne we wczesnych stadiach utraty CEC9. W związku z tym potrzebujemy modelu, który bardziej adekwatnie przedstawi te wcześniejsze stadia choroby. Pod tym względem modele hodowli komórkowych poprawiły się w ciągu ostatniej dekady, ale ich ważność jest nadal ograniczona, ponieważ komórki in vitro nie mogą zbliżyć się do replikacji złożonych interakcji, które zachodzą między różnymi typami komórek w obrębie rogówki10. W związku z tym modele chorób ex vivo i in vivo są nadal bardzo poszukiwane, a ulepszenie istniejących modeli jest niezwykle interesujące.
Nieinwazyjna, wewnątrzgałkowa chirurgia poprzez fotozakłócenia przy użyciu lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) stała się rutynową procedurą dla okulistów na całym świecie od czasu jego wprowadzenia pod koniec lat siedemdziesiątych11. Fotozakłócenia polegają na nieliniowej absorpcji światła prowadzącej do tworzenia plazmy, generowania akustycznych fal uderzeniowych i tworzenia pęcherzyków kawitacyjnych, gdy miejsce aplikacji znajduje się w środowisku płynnym12. Ogólnie rzecz biorąc, procesy te przyczyniają się do uzyskania zamierzonego efektu, jakim jest precyzyjne cięcie tkanek. Mogą jednak być również źródłem niepotrzebnych szkód ubocznych, ograniczając miejscowe ograniczenie chirurgii laserowej13.
Przewidywanie wynikających z nich efektów mechanicznych znacznie się poprawiło dzięki charakterystyce przebiegu rozchodzenia się fali uderzeniowej i kawitacji. Naszym celem jest celowanie w CEC z jak najmniejszymi uszkodzeniami otaczających tkanek, aby zapewnić nieinwazyjny, wspomagany laserowo eksperymentalny model choroby dla wczesnych stadiów utraty CEC. W tym celu konieczne jest określenie optymalnych energii impulsów i położenia ognisk lasera.

<table><tbody><tr><td>BARRON VACUUM TREPHINE</td><td>Katena</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium - high glucose</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na oko</td><td>Self</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Leica</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>Surowica świńska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna tomograf koherentny w domenie spektralnej</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis Płytka</td><td></td></tr><tr><td>do hodowli tkankowych 12-dołkowy</td><td>mikroskop dwufotonowy Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>Lepkosprężysty</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAG lasery są używane do wykonywania nieinwazyjnych operacji wewnątrzgałkowych, takich jak kapsulotomia już od kilkudziesięciu lat. Efekt sieczny opiera się na przebiciu optycznym w ognisku lasera. Generowane są akustyczne fale uderzeniowe i pęcherzyki kawitacyjne, które powodują pękanie tkanek. Rozmiary pęcherzyków i amplitudy ciśnienia różnią się w zależności od energii impulsu i położenia punktu ogniskowego. W tym badaniu wyłuszczone oczy świń umieszczono przed dostępnym na rynku laserem Nd:YAG. Badano zmienne energie impulsów, a także różne położenie ognisk za rogówką. Powstałe zmiany oceniano za pomocą mikroskopii dwufotonowej i histologii w celu określenia najlepszych parametrów dla wyłącznego odwarstwienia komórek śródbłonka rogówki (CEC) przy minimalnych uszkodzeniach ubocznych. Zaletami tej metody jest precyzyjna ablacja CEC, zmniejszenie szkód ubocznych, a przede wszystkim leczenie bezdotykowe.

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, poddaliśmy oczy działaniu lasera Nd:YAG, oceniając różne energie impulsów (1,0−4,6 mJ) oraz położenia punktów ogniskowania (odległość od tylnej powierzchni rogówki: 0,0−0,2 mm), aby wyznaczyć optymalne parametry. Dla każdej kombinacji parametrów laserowych (12 x 21) przeprowadzono wielokrotne powtórzenia (n = 3).
Oprócz wyżej wymienionego protokołu, preparat przeanalizowano za pomocą mikroskopu dwufotonowego przed utrwaleniem i barwieniem H&amp;E. W mikr...

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Obecne modele choroby utraty komórek śródbłonka rogówki koncentrują się na zniszczeniu śródbłonka i z większym prawdopodobieństwem reprezentują końcowe etapy choroby, gdy przeszczep rogówki jest nieunikniony. Obecnie dostępne są jednak nowe terapie wykorzystujące komórki macierzyste lub terapię genową, które mogą być bardziej przydatne we wczesnych stadiach choroby, dla których brakuje modeli. Nieinwazyjna chirurgia wewnątrzgałkowa poprzez fotozakłócenie przy użyciu lasera Nd:YAG stała się rutynowym zabiegiem dla okulistów.Po uzyskaniu świeżo wyłuszczonych oczu świń z lokalnej rzeźni, próbki należy umieścić w pożywce o temperaturze pełnej czterech stopni Celsjusza. Użyj nożyczek, aby usunąć tkanki zewnątrzkomórkowe i zanurz oczy w 5% roztworze okulistycznym jodu powidonu na pięć minut. Następnie zdezynfekowane próbki należy umieścić w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej.Za pomocą urządzenia do optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej przesiewaj oczy pod kątem głównych patologii przedniego odcinka, takich jak bliznowacenie rogówki, obrzęk i inne zmętnienia. Po badaniu przesiewowym należy ustawić oczy przed lampą poślizgową wyposażoną w laser Nd:YAG o długości fali 1 064 nanometrów i średnicy ogniska 10 mikrometrów w powietrzu. Wybierz 12-krotne powiększenie i odchyl oświetlenie, aby uwidocznić poszczególne warstwy rogówki.Po ustawieniu energii impulsu i skupieniu punktu na odpowiednie parametry do selektywnej ablacji komórek śródbłonka rogówki, należy przyłożyć do tkanki kilka strzałów laserowych. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym umieść przezroczystą paracentezę rogówki w pobliżu rąbka i wstrzyknij lepkosprężystość, aby ustabilizować przednią komorę. Następnie użyj ośmiomilimetrowej trepaniny, aby wyciąć środkową rogówkę potraktowaną laserowo i umieść izolowaną rogówkę w jednym dołku 12-dołkowej płytki śródbłonka do góry.Po zebraniu wszystkich rogówek dodaj trzy milimetry pełnej pożywki do każdej studzienki i inkubuj próbki przez okres do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zastąpić pożywkę w każdym dołku 4% paraformaldehydem wolnym od metanolu w buforze Sorensena na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umieścić utrwalone próbki w 20% sacharozie w PBS na około godzinę, aż rogówka opadnie.Przenieść próbki do 30% sacharozy w PBS przez noc przed osadzeniem tkanek w optymalnej temperaturze cięcia do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj kriostatu ustawionego na minus 27 stopni Celsjusza, aby uzyskać skrawki zamrożonych tkanek o grubości 10 mikrometrów, zbierając każdą sekcję na szkiełku mikroskopowym w ciągu jednej minuty od jej pozyskania. Następnie przechowuj szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu zabarwienia.W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną należy wysuszyć zamrożone sekcje na powietrzu przez kilka minut, aby usunąć wilgoć, a następnie zabarwić przefiltrowaną 0,1% hematoksyliną Mayera przez 10 minut w 50-mililitrowej probówce. Pod koniec inkubacji przepłukać szkiełka w wodzie podwójnie destylowanej przez pięć minut w kuwecie. Następnie zanurz szkiełka w 0,5% eozynie 10 razy, a następnie zanurz płukanie w podwójnie destylowanej wodzie, aż eozyna przestanie tworzyć smugi.Zanurz wypłukane szkiełka 10 razy w 50% etanolu i 10 razy w 70% etanolu. Po ostatnim zanurzeniu w 70% etanolu zrównoważ sekcje w 95% etanolu przez 30 sekund, a następnie 60 sekund w 100% etanolu przed kilkoma zanurzeniami w ksylenie. Następnie zamontuj próbki za pomocą szkiełka nakrywkowego przed uzyskaniem obrazów pod mikroskopem świetlnym.Dwa obrazy z mikroskopii fotonowej i świetlnej powinny być niezależnie oceniane jako brak uszkodzeń, zbyt duże uszkodzenia lub prawidłowa ilość uszkodzeń. Na podstawie tych ocen można następnie obliczyć mapę cieplną, aby wybrać odpowiednią konstelację parametrów lasera do selektywnej ablacji komórek śródbłonka rogówki przy minimalnym uszkodzeniu otaczającej tkanki. Poprzednia analiza wykazała, że ognisko lasera musi znajdować się co najmniej 0,15 milimetra za śródbłonkiem rogówki, aby uzyskać najniższą badaną energię impulsu.W przypadku energii impulsów wyższych niż 2,9 milidżula najdłuższa badana odległość ogniskowa jest nadal zbyt blisko śródbłonka. Różne środki cytoprotekcyjne mogą być testowane, gdy wycięte próbki znajdują się w hodowli. Jeśli okażą się skuteczne, można je dodać do roztworu irygacyjnego w celu leczenia.

development-noninvasive-laser-assisted-experimental-model-corneal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje nieinwazyjną procedurę wspomaganą laserem, która selektywnie uszkadza komórki śródbłonka rogówki w oku świni. Opracowany ex vivo model uszkodzenia komórek śródbłonka może być wykorzystany do badania chorób śródbłonka rogówki.

Selektywna ablacja wspomagana laserowo komórek śródbłonka rogówki świń: technika wywoływania skoncentrowanego uszkodzenia śródbłonka rogówki świni do badań ex vivo

Neowaskularyzacja (NV) rogówki może komplikować wiele patologii wzrokowych. Wykorzystując kontrolowany model uszkodzeń spowodowanych oparzeniami zasadowymi, można uzyskać wymierny poziom NV rogówki do mechanistycznego badania NV rogówki i oceny potencjalnych terapii zaburzeń neowaskularnych.

Model urazu neowaskularyzacji rogówki w oparzeniach zasadowych u myszy

W przeszczepie śródbłonka proponuje się całkowicie laserową procedurę. Technika chirurgiczna opiera się na wykorzystaniu lasera femtosekundowego do przygotowania tkanki dawcy. Następnie stosuje się technikę spawania laserowego, aby zabezpieczyć śródbłonek dawcy we właściwej pozycji.

"Całkowicie laserowy" przeszczep śródbłonka

Tutaj prezentujemy protokół neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem myszy (CNV), eksperymentalny model, który odtwarza naczyniowe cechy neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD). Po opanowaniu może niezawodnie i skutecznie indukować CNV jako system modelowy do testowania różnych środków eksperymentalnych.

Mysi model do neowaskularyzacji naczyniówkowej indukowanej laserem

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Poniższy artykuł przedstawia łatwą, powtarzalną technikę skutecznego tworzenia trwałego mysiego modelu niedoboru rąbków komórek macierzystych (LSCD). Ten model zwierzęcy jest przydatny w testowaniu i porównywaniu skuteczności leczenia chorób rąbkowych komórek macierzystych.

Prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy

Tutaj prezentujemy przydatność podłużnego obrazowania in vivo w obserwacji zmian morfologicznych wywołanej laserem neowaskularyzacji naczyniówkowej u myszy.

In vivo (in vivo) Multimodalne obrazowanie i analiza mysiego modelu neowaskularyzacji naczyniówki indukowanej laserem

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania i uprawy rozszczepionych guzików rogówki u świń. Ponieważ ten typowy dla organoorganizacji model hodowli narządów wykazuje wskaźnik umieralności komórek w ciągu 15 dni, porównywalny z ludzkimi rogówkami dawców, stanowi on pierwszy model umożliwiający długotrwałą hodowlę rogówek innych niż ludzkie bez dodawania toksycznego dekstranu.

Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

Poznaj nieinwazyjną metodę odwarstwiania komórek śródbłonka rogówki za pomocą lasera Nd:YAG na modelu świńskiego oka. Ta technika umożliwia badanie wczesnych stadiów rogówki pęcherzowej.

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Przeglądaj więcej filmów