Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Obecne modele choroby utraty komórek śródbłonka rogówki koncentrują się na zniszczeniu śródbłonka i z większym prawdopodobieństwem reprezentują końcowe etapy choroby, gdy przeszczep rogówki jest nieunikniony. Obecnie dostępne są jednak nowe terapie wykorzystujące komórki macierzyste lub terapię genową, które mogą być bardziej przydatne we wczesnych stadiach choroby, dla których brakuje modeli. Nieinwazyjna chirurgia wewnątrzgałkowa poprzez fotozakłócenie przy użyciu lasera Nd:YAG stała się rutynowym zabiegiem dla okulistów.

Po uzyskaniu świeżo wyłuszczonych oczu świń z lokalnej rzeźni, próbki należy umieścić w pożywce o temperaturze pełnej czterech stopni Celsjusza. Użyj nożyczek, aby usunąć tkanki zewnątrzkomórkowe i zanurz oczy w 5% roztworze okulistycznym jodu powidonu na pięć minut. Następnie zdezynfekowane próbki należy umieścić w sterylnym PBS w temperaturze pokojowej.

Za pomocą urządzenia do optycznej koherentnej tomografii w domenie spektralnej przesiewaj oczy pod kątem głównych patologii przedniego odcinka, takich jak bliznowacenie rogówki, obrzęk i inne zmętnienia. Po badaniu przesiewowym należy ustawić oczy przed lampą poślizgową wyposażoną w laser Nd:YAG o długości fali 1 064 nanometrów i średnicy ogniska 10 mikrometrów w powietrzu. Wybierz 12-krotne powiększenie i odchyl oświetlenie, aby uwidocznić poszczególne warstwy rogówki.

Po ustawieniu energii impulsu i skupieniu punktu na odpowiednie parametry do selektywnej ablacji komórek śródbłonka rogówki, należy przyłożyć do tkanki kilka strzałów laserowych. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym umieść przezroczystą paracentezę rogówki w pobliżu rąbka i wstrzyknij lepkosprężystość, aby ustabilizować przednią komorę. Następnie użyj ośmiomilimetrowej trepaniny, aby wyciąć środkową rogówkę potraktowaną laserowo i umieść izolowaną rogówkę w jednym dołku 12-dołkowej płytki śródbłonka do góry.

Po zebraniu wszystkich rogówek dodaj trzy milimetry pełnej pożywki do każdej studzienki i inkubuj próbki przez okres do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zastąpić pożywkę w każdym dołku 4% paraformaldehydem wolnym od metanolu w buforze Sorensena na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umieścić utrwalone próbki w 20% sacharozie w PBS na około godzinę, aż rogówka opadnie.

Przenieść próbki do 30% sacharozy w PBS przez noc przed osadzeniem tkanek w optymalnej temperaturze cięcia do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj kriostatu ustawionego na minus 27 stopni Celsjusza, aby uzyskać skrawki zamrożonych tkanek o grubości 10 mikrometrów, zbierając każdą sekcję na szkiełku mikroskopowym w ciągu jednej minuty od jej pozyskania. Następnie przechowuj szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu zabarwienia.

W przypadku barwienia hematoksyliną i eozyną należy wysuszyć zamrożone sekcje na powietrzu przez kilka minut, aby usunąć wilgoć, a następnie zabarwić przefiltrowaną 0,1% hematoksyliną Mayera przez 10 minut w 50-mililitrowej probówce. Pod koniec inkubacji przepłukać szkiełka w wodzie podwójnie destylowanej przez pięć minut w kuwecie. Następnie zanurz szkiełka w 0,5% eozynie 10 razy, a następnie zanurz płukanie w podwójnie destylowanej wodzie, aż eozyna przestanie tworzyć smugi.

Zanurz wypłukane szkiełka 10 razy w 50% etanolu i 10 razy w 70% etanolu. Po ostatnim zanurzeniu w 70% etanolu zrównoważ sekcje w 95% etanolu przez 30 sekund, a następnie 60 sekund w 100% etanolu przed kilkoma zanurzeniami w ksylenie. Następnie zamontuj próbki za pomocą szkiełka nakrywkowego przed uzyskaniem obrazów pod mikroskopem świetlnym.

Dwa obrazy z mikroskopii fotonowej i świetlnej powinny być niezależnie oceniane jako brak uszkodzeń, zbyt duże uszkodzenia lub prawidłowa ilość uszkodzeń. Na podstawie tych ocen można następnie obliczyć mapę cieplną, aby wybrać odpowiednią konstelację parametrów lasera do selektywnej ablacji komórek śródbłonka rogówki przy minimalnym uszkodzeniu otaczającej tkanki. Poprzednia analiza wykazała, że ognisko lasera musi znajdować się co najmniej 0,15 milimetra za śródbłonkiem rogówki, aby uzyskać najniższą badaną energię impulsu.

W przypadku energii impulsów wyższych niż 2,9 milidżula najdłuższa badana odległość ogniskowa jest nadal zbyt blisko śródbłonka. Różne środki cytoprotekcyjne mogą być testowane, gdy wycięte próbki znajdują się w hodowli. Jeśli okażą się skuteczne, można je dodać do roztworu irygacyjnego w celu leczenia.