Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Bionika na bazie hydrożelu GelMA staje się bardzo popularna w biodruku 3D. Jednak niska lepkość ogranicza jego drukowność. Tutaj dzielimy się strategiami drukowania GelMA w naszym laboratorium z innymi badaczami.

W tym filmie w pełni wykorzystujemy specjalne właściwości tego biomateriału i proponujemy kilka metod drukowania dla różnych struktur 3D, które mogą przyczynić się do dalszych zastosowań biomedycznych. Na przykład w przypadku uszkodzenia narządów, implikacje mogą być wykorzystane w odpowiedniej terapii poprzez wstrzykiwanie, osadzanie lub śledzenie wydrukowanych struktur GelMA. Nie jest łatwo całkowicie rozpuścić liofilizowany GelMA w krótkim czasie.

Aby przyspieszyć proces rozpuszczania, można użyć mieszalnika wirowego. Każdy biomateriał będzie wykorzystywał specjalne właściwości charakterystyczne dla GelMA. Zasugerowałem, że nowy chemer powinien odpowiednio zastanowić się nad tym, co jest krytyczne podczas drukowania.

Szczegóły operacji decydują o powodzeniu procedur drukowania. Dlatego wybieramy demonstrację wizualną, aby podzielić się nią z innymi badaczami. Aby wytworzyć mikrosfery, zacznij od połączenia dwóch metalowych elektrod pierścieniowych z biegunami uziemiającymi i dodatnimi.

Umieść metalową płytkę połączoną z wysokim napięciem poniżej elektrody pierścieniowej, a szalkę Petriego z olejem silikonowym na metalowej płytce jako odbiornik kropel. Przygotuj biotusz, rozpuszczając liofilizowane GelMA i LAP i DPBS, przefiltruj go przez filtr 0,22 mikrometra dla sterylności, a następnie podgrzej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Odłącz komórki MDA-MB-231 z trzema mililitrami 0,25% trypsyny i 0,02% roztworu EDTA na trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i odwiruj je w temperaturze 100 razy G przez pięć minut. Usuń supernatant i wymieszaj komórki z jednym mililitrem przygotowanego biotuszu, powoli pipetując w górę iw dół, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Odessać jeden mililitr mieszaniny biotuszu i komórek do sterylnej strzykawki o pojemności trzech mililitrów.

Nałóż biotusz siłą sprężonego powietrza i umieść strzykawkę na uchwycie. Włącz zasilanie wysokiego napięcia i ustaw napięcie na zero do czterech kilowoltów. Jednocześnie włącz światło o długości fali 405 nanometrów, aby usieciować kropelki GelMA w pięciu mililitrach oleju silikonowego.

Zdekantuj szalkę Petriego, aby pozbyć się większości oleju silikonowego i użyj łyżki, aby przenieść pozostały olej i mikrosfery do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodać pięć mililitrów DPBS i wstrząsnąć mieszaniną, odwirować probówkę pod ciśnieniem 100 razy G i usunąć supernatant. Przenieś mikrosfery na szalkę Petriego z DMEM i hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez trzy dni.

Po trzech dniach wyrzuć pożywkę i przemyj mikrosfery DPBS. Napraw je dwoma mililitrami czteroprocentowego PFA przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzuć PFA i powtórz pranie. Przeniknij komórki dwoma mililitrami 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wyrzuć środek powierzchniowo czynny i przemyj mikrosfery DPBS.

Następnie barwić komórki TRITC-falloidyną przez 30 minut, a następnie DAPI przez 10 minut w ciemności, odrzucając barwniki i myjąc kulki DPBS po każdym barwieniu. Zobrazuj mikrosfery za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Rozpuść wysterylizowany proszek alginianu sodu w wodzie dejonizowanej w dwuprocentowym stosunku masy do objętości.

Przygotuj sterylny roztwór biotuszu, jak opisano powyżej, a następnie podgrzej biotusz i alginian sodu w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Trypsynizować i odwirować bMSC zgodnie z wcześniej opisaną procedurą dla komórek MDA-MB 231, a następnie usunąć płyn supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 mililitrów biotuszu GelMA. Zassać dwa mililitry mieszaniny komórek bio-atramentu do 10-mililitrowej strzykawki i dwa mililitry mieszaniny alginianu sodu do innej strzykawki.

Nadawać roztwory za pomocą dwóch pomp strzykawkowych: biotuszu o szybkości 50 mikrometrów na minutę i alginianu sodu o szybkości 350 mikrometrów na minutę. Włącz światło o długości fali 405 nanometrów, aby napromieniować przezroczystą rurkę i usieciować włókna GelMA. Użyj szalki Petriego, aby otrzymać włókna i zbierz je łyżką.

Przenieś włókna do naczynia z DMEM/F12 i hoduj je przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Po wyhodowaniu komórek postępuj zgodnie z opisanymi wcześniej wskazówkami dotyczącymi obserwacji włókien pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym. Rozpuść liofilizowane GelMA i LAP oraz DPBS i dodaj do roztworu jadalny pigment magenta, aby poprawić dokładność drukowania.

Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 mikrometra w celu uzyskania sterylności i podgrzewaj go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Zbuduj modele 3D za pomocą oprogramowania CAD i zaimportuj dokumenty modelu do górnego oprogramowania zastosowanej biodrukarki DLP. Dodaj dziesięć mililitrów przygotowanego biotuszu do koryta biodrukarki.

Ustaw parametry drukowania zgodnie ze wskazówkami rękopisu, a następnie rozpocznij drukowanie. Po zakończeniu usuń wydrukowaną strukturę z biodrukarki i zanurz ją w DPBS na szalce Petriego. Odłączyć i zatopić ogniwa MDA-MB 231 zgodnie z wcześniejszym opisem.

Ponownie zawiesić je dwoma mililitrami DMEM i dodać zawiesinę do wydrukowanej struktury. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procent dwutlenku węgla przez trzy dni, a następnie przygotuj struktury do obserwacji za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego, jak opisano wcześniej. Przygotuj 10-procentowy roztwór GelMA do objętości i 0,5% masy do objętości, a następnie przefiltruj go przez filtr 0,22 mikrometra.

Sterylizuj żelatynę w proszku w świetle UV przez 30 minut i dodaj ją do roztworu GelMA LAP w pięcioprocentowym stosunku masy do objętości. Podgrzej mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Napełnij foremki przygotowanym biotuszem i umieść je w lodówce o czterech stopniach Celsjusza na 30 minut.

Za pomocą ostrza usuń częściowo usieciowane arkusze hydrożelu z form. Połącz formowane arkusze hydrożelu 2D i połącz je za pomocą GelMA, naświetlając go promieniowaniem o długości 405 nanometrów przez jedną minutę. Odłącz i peletuj HUVEC, wymieszaj komórki z dwoma mililitrami DMEM i wstrzyknij zawiesinę do mikrokanalika za pomocą dyszy i strzykawki.

Przez następne trzy godziny odwracaj chip do góry nogami co 15 minut, aby uzyskać równomierne i pełne osadzenie komórki. Hoduj chipsy na szalce Petriego przez trzy dni w DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla, a następnie przygotuj je do obserwacji morfologicznej. Kiedy kropelki GelMA wpadały do odbierającego oleju silikonowego, zachowywały standardowy kształt sferoidalny bez ogonków.

Zamknięte ogniwa, które poddały się działaniu pola elektrycznego o wysokim napięciu, zachowały zdolność rozprzestrzeniania się, co zweryfikowało biokompatybilność metody wytwarzania wspomaganego elektrycznie. Do wytwarzania struktur GelMA o bardziej złożonych kształtach, takich jak nos, ucho i wielokomorowa, wybrano drukarkę biologiczną DLP. Zasiewane HUVEC przyczepione do materiałów GelMA i rozprowadzane na powierzchni usieciowanych struktur GelMA, co pokazuje, że to zastosowanie ma potencjał dla inżynierii tkankowej.

Do wytworzenia mikroprzepływowych chipów mikroprzepływowych na bazie GelMA wykorzystano strategię dwukrotnego sieciowania. Chipy z różnymi mikrokanalikami zostały zbudowane poprzez zaprojektowanie różnych form na żądanie, a HUVEC zostały zasiane w kanałach i przymocowane do ścianki kanału, tworząc makroskopowy kształt naczynia. Źródło wysokiego napięcia jest stosowane podczas wytwarzania mikrosfer.

Naukowcy muszą wcześniej zbadać obwód i nie dotykać odsłoniętych milibarów, które chronią operatorów lub sprawiają, że ogniwa są uszkodzone przez zwarcie. Ultradźwiękowa baza wodna może być kolejnym wyborem, aby przyspieszyć zasłużoną prędkość. Zdecydowanie ten wkład podsumował metody biodruku 3D GelMA w naszym laboratorium.

Naukowcy mogą zapoznać się z filmem i ulepszyć lub rozszerzyć strategie drukowania, aby sprostać dalszym wymaganiom biomedycznym.