Analiza przemieszczenia mechanicznej deformacji mięśnia sercowego (DIAMOND) ujawnia segmentalną heterogeniczność funkcji serca u embrionalnego danio pręgowanego
6 lutego 2020
Celem tego protokołu jest szczegółowe opracowanie nowatorskiej metody oceny segmentalnej funkcji serca u embrionalnych ryb danio pręgowanych, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych.
Diament jest pierwszą metodą open source do ilościowej oceny czterowymiarowej segmentalnej funkcji serca w zarodkach danio pręgowanego. Nasza metoda ma rozdzielczość mikrometryczną, która może określić ilościowo lokalną mechanikę serca w przestrzeni 3D. Żadne inne obecne podejście na to nie pozwala.
Diament odkrywa nowe wzorce urazów w toksyczności serca wywołanej doksorubicyną. Dlatego uważamy, że nasza metoda może być wykorzystana jako platforma do wysokoprzepustowych badań przesiewowych in vivo w kierunku toksyczności kardiologicznej wywołanej chemioterapią. Obecnie pracujemy nad przystosowaniem Diamond do serca ssaków.
Potrzebne są jednak dodatkowe prace, aby uwzględnić orientację włókien mięśnia sercowego ssaków oraz ruchy obrotowe i skręcające. Podczas próbowania tej metody bardzo ważne jest, aby użytkownik miał wyraźną wizualizację budowy anatomicznej serca danio pręgowanego, aby prawidłowo zidentyfikować osie poziome i pionowe oraz podzielić komorę. Aby zrekonstruować skurczowe i rozkurczowe serce 3D, zacznij od otwarcia folderu utworzonego przez algorytm postsynchronizacji, a następnie otwórz folder wyjściowy
.Znajdź pierwszą fazę skurczową i rozkurczową i zapisz numer klatki. Następnie otwórz folder danych wyjściowych według stanu i znajdź foldery, które mają takie same numery jak zarejestrowane numery ramek. Przekonwertuj obrazy w folderze na pliki 3D TIF i nazwij je rozkurczem.
TIF i systole.tif. Aby przeprowadzić segmentację komory, otwórz oprogramowanie do analizy obrazu, klikając plik i otwórz dane. Następnie załaduj rozkurcz.
tif i systole. tif i wprowadź rozmiar woksela zgodnie z ustawieniami obrazu. Kliknij panel segmentacji i ręcznie podziel na segmenty część komorową serca za pomocą wbudowanego narzędzia progowego.
Następnie należy usunąć kanał przedsionkowo-komorowy i drogę odpływu w segmentowanej komorze, ponieważ wpłynie to na analizę przemieszczenia. Po zakończeniu segmentacji kliknij panel projektu, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy plik diastole.labels. tif i systore.labels.
tif w konsoli i kliknij Eksportuj dane jako, aby zapisać dane jako pliki 3D TIF. Otwórz prepimage_1. m w środowisku programistycznym, upewnij się, że folder w programie InPath w wierszu piątym zawiera oryginalne i podzielone na segmenty pliki TIF, a następnie zmień wycinek w Live Four na liczbę wycinków plików TIF 3D.
Po uruchomieniu kodu zostanie wygenerowanych pięć nowych plików 3D TIF oraz dwa nowe foldery. Zaimportuj wszystkie pięć plików TIF 3D do oprogramowania do analizy obrazów. Przejdź do panelu wielopłaszczyznowego i wybierz opcję diastole_200.
tif jako dane podstawowe. Wyrównaj oś x z pionową osią długą komory, a oś z z poziomą osią długą komory. Następnie wybierz trzy losowe punkty z ukośnej płaszczyzny YZ w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i zapisz ich współrzędne położenia 3D.
Powtórz ten proces dla systole_200.tif. Kliknij panel projektu i utwórz obiekt plasterka dla diastole_200. TIF, klikając prawym przyciskiem myszy diastole_200.
tif i wyszukiwanie obiektu slice. Kliknij lewym przyciskiem myszy utworzony obiekt przekroju, zaznacz opcję ustaw płaszczyznę w opcjach panelu właściwości, wybierz trzy punkty w definicji płaszczyzny i wprowadź poprzednio zarejestrowane współrzędne. Kliknij prawym przyciskiem myszy diastole_200.
tif, wyszukaj Resample Transformed Image i utwórz obiekt. W panelu właściwości wybierz plasterek jako odniesienie i kliknij przycisk Zastosuj, co powinno spowodować wygenerowanie obiektu o nazwie diastole_200.transformed. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy diastole_200.
przekształcony, wyszukaj Resample i utwórz obiekt. Wybierz rozmiar woksela jako tryb i zmień go na x równa się jeden, y równa się jeden, a z równa się jeden w panelu właściwości. Kliknij przycisk Zastosuj, a następnie zapisz wygenerowane diastole_200.
ponownie próbkowany obiekt jako plik TIF 3D. Powtórz ten proces dla dialabel. tif, test.
tif, systole_200. tif, syslabel. tif i test.
tif zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Zaimportuj wszystkie sześć ponownie próbkowanych plików do ImageJ i zaznacz wycinek systole_200. Ponowne próbkowanie, w którym kanał przedsionkowo-komorowy jest wyraźnie uwidoczniony, upewniając się, że zapisano numer wycinka.
Użyj funkcji obracania obrazu transformacji, aby ustawić kanał przedsionkowo-komorowy w pionie. Zastosuj ten sam obrót do wszystkich plików, a następnie zamknij wszystkie okna i zapisz zmiany. Następnie przejdź systole_200.
Resampled, syslabel. Resampled i test2. Ponownie próbkowane do folderu resample_sys.
Przenieś diastole_200. ponownie próbkowany, dialabelowany. ponownie próbkowany i testuj.
Ponowne próbkowanie do folderu resample_dia. Otwórz divider_2_8_pieces. m i zmień InPath w wierszu piątym na katalog obrazu.
Zmień zmienny środek w wierszu 22 na numer przekroju, w którym kanał przedsionkowo-komorowy jest wyraźnie uwidoczniony. Powtórz ten proces dla diastole_200. Ponownie próbkowane na liniach 394 i 411.
Uruchom kod. Po wyświetleniu monitu kliknij raz środek komory i środek kanału przedsionkowo-komorowego. Aby zarejestrować skurczowe i rozkurczowe matryce obrazu, otwórz register_3.
m i zmień InPath w wierszu czwartym na ścieżkę do folderu obrazów. Następnie otwórz displacement_4. m i zmień InPath na ścieżkę folderu obrazów.
Uruchom program, aby wygenerować plik vector8. txt z macierzą osiem na cztery. Każdy wiersz macierzy zawiera wielkości składowej x, składowej y, składowej z oraz sumę wielkości wektora przemieszczenia określonego segmentu komory.
Wartości te można następnie przenieść do arkusza kalkulacyjnego. Protokół ten wykorzystano do odkrycia segmentowej heterogeniczności funkcji serca i podatności na uszkodzenie mięśnia sercowego wywołane doksorubicyną u danio pręgowanego. Po 24-godzinnym leczeniu doksorubicyną od trzech do czterech dni po zapłodnieniu porównano przemieszczenie segmentów komorowych między grupą kontrolną a grupą leczoną.
W warunkach kontrolnych segmenty podstawne pierwszy i szósty ulegają największym przemieszczeniom i są najbardziej podatne na uszkodzenie serca wywołane doksorubicyną. Przy sześciu dpf średnia norma L2 segmentowych wektorów przemieszczenia u ryb kontrolnych wahała się od 3,9 do 8% po normalizacji. Podstawowe segmenty pierwszy i sześć odzyskały przemieszczenie diamentu do poziomów kontrolnych sugerujących regenerację segmentową.
Tymczasem bezpośrednio po leczeniu doksorubicyną zaobserwowano pogorszenie podstawowego szczepu 2D z ujemnych 53 do minus 38%, po którym nastąpił powrót do poziomów kontrolnych 48 godzin później, potwierdzając wyniki wypierania Diamonda. Zaobserwowano również równoległe zmniejszenie i powrót do globalnej frakcji wyrzutowej lub EF w odpowiedzi na leczenie. Diament został następnie zastosowany podczas leczenia doksorubicyną i modulacji szlaku notch przy użyciu inhibitora notch DAPT i dalszych efektorów NICD i mRNA NRG1.
Mikroiniekcja mRNA uratowała zmniejszenie przemieszczenia Diamonda i EF po ostrym urazie wywołanym chemioterapią. Co więcej, zahamowanie szlaku karbowego po chemioterapii utrudniało odzyskanie przemieszczenia Diamonda segmentów podstawy i EF 48 godzin po leczeniu, ale hamowanie zostało uratowane przez efektory karbu za wycięciem. Wiadomo, że tradycyjna frakcja wyrzutowa jest niewrażliwym i opóźnionym wskaźnikiem uszkodzenia mięśnia sercowego.
Diament pozwala naukowcom określić ilościowo ogniskową funkcję serca i wspomóc niejednorodność uszkodzenia mięśnia sercowego w zarodkach danio pręgowanego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje nową metodę open-source o nazwie Diamond, służącą do oceny segmentowej funkcji serca u zarodkowych rybek danio pręgowanych. Metoda ta umożliwia wysokorozdzielczą analizę ilościową lokalnej mechaniki serca w przestrzeni 3D, co pozwala na identyfikację wzorców uszkodzeń w badaniach kardiotoksyczności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ocena funkcji serca
- Embrionalne modele zebrafish
- Analiza stanów patologicznych
Wprowadzenie
- Obecne metody nie pozwalają na ocenę lokalnej mechaniki serca w 3D.
- Kardiotoksyczność wywołana doksorubicyną jest istotnym problemem w chemioterapii.
- Wysokoprzepustowe badania przesiewowe in vivo są niezbędne do oceny toksyczności serca.
- Adaptacja metod dla serc ssaków jest celem na przyszłość.
Cel badania
- Wprowadzenie nowej metody oceny funkcji serca u embrionów rybek zebrafish.
- Umożliwienie kwantyfikacji mechaniki serca z rozdzielczością mikrometryczną.
- Zapewnienie platformy do przesiewowego badania kardiotoksyczności indukowanej chemioterapią.
Zastosowane metody
- Opracowywanie metod otwartoźródłowych
- Ilościowa ocena funkcji serca
- Trójwymiarowa analiza przestrzenna mechaniki serca
- Techniki przesiewowe in vivo
Główne wyniki
- Diamond umożliwia uzyskanie bezprecedensowej rozdzielczości w ocenie funkcji serca.
- Zidentyfikowano nowe wzorce uszkodzeń związane z toksycznością doksorubicyny.
- Wykazano potencjał w zastosowaniach wysokoprzepustowego screeningu.
- Trwają prace nad przyszłymi adaptacjami dla serc ssaków.
Wnioski
- Diamond stanowi znaczący postęp w ocenie funkcji serca.
- Posiada potencjalne zastosowania w badaniach przesiewowych toksyczności leków.
- Dalsze badania są niezbędne w celu przystosowania tej metody dla innych gatunków.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obecne testy funkcji serca nie posiadają rozdzielczości pozwalającej na wykrycie heterogeniczności segmentowej w modelach wczesnego stadium, co ogranicza wgląd w mechanizmy kardiotoksyczności indukowanej związkami chemicznymi. Metoda DIAMOND umożliwia ilościową, 3D analizę odkształceń segmentowych u embrionów zebrafish, zapewniając wczesną wartość prognostyczną dla dróg uszkodzenia mięśnia sercowego. Wspiera to walidację celów i identyfikację wiodących związków poprzez ujawnianie przestrzennie rozdzielonych zmian funkcjonalnych, zanim globalne wskaźniki, takie jak frakcja wyrzutowa, wykażą upośledzenie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie wzorców segmentalnych odkształceń mechanicznych in vivo.
- Wartość operacyjna: Wykazuje, że bazalne segmenty komór są wczesnymi biomarkerami uszkodzeń wywołanych doksorubicyną, co wyjaśnia podatność specyficzną dla danej ścieżki sygnałowej.
- Wartość naukowa: Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez powiązanie modulacji ścieżki Notch z segmentową regeneracją funkcjonalną.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wektory przemieszczenia dla każdego segmentu komory, umożliwiając wysokoprzepustowy screening fenotypowy związków kardiotoksycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odczyty 3D o rozdzielczości mikrometrycznej, które są powtarzalne pomiędzy replikami biologicznymi a warunkami traktowania.
- Wartość naukowa: Wykrywa wzorce uszkodzeń pomijane przez tradycyjną frakcję wyrzutową, zwiększając czułość testu na wczesne sygnały toksyczności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje użyteczność systemu w kontekście chorobowym poprzez modelowanie kardiotoksyczności indukowanej doksorubicyną oraz regeneracji w embrionach rybek danio (zebrafish).
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne śledzenie regeneracji segmentowej i powrotu funkcji po urazie.
- Wartość naukowa: Wspomaga walidację modeli przedklinicznych poprzez korelację interwencji molekularnych (np. NICD, NRG1) z funkcjonalnym ratowaniem tkanek na poziomie tkankowym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda DIAMOND wpisuje się w proces badawczy – od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną – dostarczając rozdzielczo przestrzenne odczyty funkcjonalne, które umożliwiają selekcję związków w oparciu o ich mechanizm działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez kwantyfikację wpływu zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych na segmentową mechanikę serca.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane wyniki gotowe do analizy (wartości przemieszczeń dla poszczególnych segmentów) w celu oceny bibliotek związków in vivo.
- Analityka: Generuje wielowymiarowe dane o przemieszczeniu (składowe x, y, z oraz wartość całkowita), umożliwiając statystyczne porównanie funkcji serca w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy modulację szlaków molekularnych (Notch) z funkcjonalnym powrotem do zdrowia w modelu kręgowca, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi adaptowalną platformę open-source do przesiewania kardiotoksyczności, która może zostać ustandaryzowana w ramach zespołów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez ujawnienie przestrzennie niejednorodnych odpowiedzi mięśnia sercowego.
- Wartość operacyjna: poprawia powtarzalność dzięki półautomatycznemu przetwarzaniu obrazów i standaryzowanej segmentacji komór na osiem segmentów.
- Wartość strategiczna: zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach poprzez wcześniejszą identyfikację potencjału kardiotoksycznego w procesie odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o segmentowe upośledzenie funkcji, a nie o opóźnione punkty końcowe o charakterze globalnym.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej z arkuszem światła oraz w obsłudze oprogramowania do analizy obrazów 3D.
- Zależna od procesów izotropowego próbkowania i rejestracji obrazów w celu dokładnego ilościowego określenia przesunięcia.
- Konieczna jest wyraźna wizualizacja anatomiczna w celu zdefiniowania osi i prawidłowej segmentacji komory.
- Obejmuje etapy manualnej segmentacji, które mogą wymagać przeszkolenia w celu spójnego definiowania granic komory.
- Ograniczona obecną adaptacją do rybek zebrafish; zastosowanie u ssaków wymaga uwzględnienia orientacji włókien oraz ruchu rotacyjnego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:13
Reconstruction of the 3D Systolic and Diastolic Heart and Segmentation of the Ventricle
2:41
Creation of Rectangular Parallelepipeds for Image Registration and Resampling of Systolic and Diastolic 3D Hearts Along the Short Axis Plane
5:01
Division of the Resampled Heart
6:20
Registration of Systolic and Diastolic Image Matrices and Output of Displacement Vectors
7:01
Results: Segmental Heterogeneity in Cardiac Function and Susceptibility to Chemotherapy-induced Injury
8:45
Conclusion
