Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Korzystając z tego protokołu, naukowcy mogą zidentyfikować nowy egzom lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe i mikrokomórkowe oparte na tkankach dla zaawansowanego raka prostaty. Wyizolowanie RNA zarówno z tkanek F-F-B, jak i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jest często trudne, ponieważ większość z nich jest albo tworzona, albo w ograniczonej ilości. Ta cząstka omówi różne metody optymalizacji wejść R-N-A i bibliotek C-D-N-A w celu uzyskania najbardziej specyficznych wolnych i wysokiej jakości danych do sekwencjonowania nowej generacji. Sekwencjonowanie nowej generacji oferuje najbardziej wszechstronną platformę do zrozumienia zmian molekuł w guzie, które leżą u podstaw progresji guza

Optymalizacja bibliotek C-D-N-A z materiału o niskim nakładzie wejściowym jest kluczowym krokiem dla udanego sekwencjonowania, dlatego bardzo ważne jest generowanie wysokiej jakości bibliotek C-D-N-A, aby uzyskać dokładne wyniki. Po wykonaniu mikrosekcji tkanek, jak to wcześniej zrobiono, przystąp do izolowania rzędów rozmrażania E-V pochodzących z surowicy próbek surowicy pacjenta w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś 110 mikrolitrów rozmrożonej próbki surowicy do probówki i wiruj dwa tysiące razy G przez trzydzieści minut.

Wybierz super naden do późniejszej izolacji E-V lub egzosomu i wyrzuć osad debree. Przy 30 mikroletach odczynnika do izolacji egzosomów surowicy do super natentu. Inkubuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzydzieści minut.

Wiruj dziesięć tysięcy razy G przez dziesięć minut. Ostrożnie wybierz nadent EV, nie naruszając osadu w osobnej tubie o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj minus 80 stopni Celsjusza do przyszłej analizy. Następnie ponownie zawiesić granulat E-V w 70 mikrolitrach PBS przygotowanych w wodzie wolnej od nukleaz.

Po wyizolowaniu całkowitego R-N-A z mikro wypreparowanych tkanek i oczyszczeniu E-V za pomocą komercyjnych zestawów, wykonaj przygotowanie biblioteki do pięciu mikrolitrów znormalizowanej próbki o napięciu czterdziestu nanogramów na mikrolitr na mikrolitr R-N-A w jednym mikrolitrze trzech głównych adapterów. Podgrzej termocykler do 70 stopni Celsjusza i inkubuj próbkę przez dwie minuty. Natychmiast przenieść próbki na lód.

W osobnej probówce wymieszaj dwa mikrolitry buforu ligacyjnego, jeden mikrolitr inhibitora RNazy i jeden mikrolitr ligazy T4 RNA dwa, mutanta delecji. Wymieszaj pościel z ciasta pożegnalnego w górę iw dół. Następnie dodaj cztery mikrolitry mieszanki do probówki z adapterem R-N-A 3 prime na lodzie.

Rozgrzej termocykler do 28 stopni Celsjusza. I umieść probówkę w termocyklerze, aby inkubować przez godzinę. Następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu zatrzymującego do probówki, trzymając próbkę na termocyklerze.

Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez kolejne 15 minut. Następnie natychmiast wyjmij rurkę i trzymaj na lodzie. W osobnej tubie dodaj jeden mikrolitr pięciu adapterów głównych.

Przenieś do termocyklera, który został podgrzany do 70 stopni Celsjusza. I inkubować przez dwie minuty. Natychmiast umieść rurkę na lodzie, aby zapobiec ponownemu wyżarzaniu adapterów.

Dodaj jeden mikrolitr dziesięciomilimolowego A-T-P do probówki adaptera D natured five prime. Wymieszaj paskie ciasto i dodaj do mieszanki jeden mikrolitr ligazy T4 R-N-A. Wymieszaj pie do widzenia.

Przenieść trzy mikrolitry tej mieszanki do probówki zawierającej trzy główne łączniki ligowane R-N-A. Umieść probówkę na termocyklerze, który został wstępnie podgrzany do 28 stopni Celsjusza i inkubuj przez godzinę. Następnie natychmiast przenieś probówkę na lód i albo kontynuuj pobieranie próbek, albo przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Do wykonania R-T-P-C-R należy użyć sześciu mikroligerów każdego adaptera ligowanego R-N-A i dodać do niego jeden mikro liger startera R-N-A R-T. Przenieś probówkę do termocyklera nagrzanego do 70 stopni Celsjusza i inkubuj przez dwie minuty. Przenieś probówkę do lodu.

W osobnej probówce wymieszaj dwa mikrolitry 5X, bufor nici, 5 mikrolitrów 12,5 milimolera DNTP, jeden mikrolitr 100 milimolowych DTT, jeden mikrolitr inhibitora R-N-A i jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy. Dodaj pięć mikrolitrów tej mieszanki do zligowanego RNA adaptera i przenieś go do termocyklera, który został wstępnie podgrzany do 50 stopni Celsjusza, aby inkubować przez godzinę. Po godzinie przenieś adapter podwiązane uzupełniające DNA natychmiast do lodu.

W osobnej probówce wymieszaj 25 mikrolitrów mieszanki PCR, dwa mikrolitry startera RNA PCR, dwa mikrolitry wskaźnika startera RNA PCR i 8,5 mikrolitrów wolnej wody RNA. Dodaj 37,5 mikrolitra tej mieszanki do 12,5 mikrolitrów podwiązanego adaptera CDNA. Przenieś rurkę do termocyklera, który został wstępnie podgrzany do 98 stopni Celsjusza.

Zaprogramuj termocykler zgodnie z sugestią w protokole producenta ze zmodyfikowanym numerem cyklu na 15. Po zakończeniu utrzymuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Kontynuuj lub przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Aby oczyścić ligowany komplementarny DNA, dodaj dziesięć mikrolitrów barwnika ładującego DNA do każdej uzupełniającej próbki DNA. I do dziesięciu mikrolitrów tego ostatniego o wysokiej rozdzielczości i niestandardowego RNA tego ostatniego. Uruchom 30 mikrolitrów każdej próbki na dwóch oddzielnych torach przylegających do siebie w sześcioprocentowym żelu poliakrylamidowym TBE.

W przypadku niestandardowego RNA i drugiego o wysokiej rozdzielczości, przestrzeni pośredniej między dwiema różnymi próbkami. Uruchom żel w jednym buforze X TBE pod napięciem 145 V przez około 30 do 40 minut. Śledź dolny niebieski przód barwnika załadowczego.

Przerwij elektroforezę, gdy zbliży się do dna żelu. Przenieść żel do jednego buforu X TBE z 5 mikrogramami na milimetr bromku etydyny. Zwizualizuj żel w transiluminatorze i przetnij żel dokładnie między znacznikami 145 par zasad i 160 par zasad oraz nieco powyżej znacznika pary zasad 145, aby uniknąć zanieczyszczenia ściemniaczem adaptera.

Krytycznym krokiem jest oczyszczanie ligowanego CDNA, które odbywa się poprzez precyzyjne cięcie żelu, ponieważ dimery adapterów działają bardzo luźno w stosunku do pożądanej marki. Przenieś kawałki żelu do probówek rozbijających DNA trzymanych w dwumilimetrowych probówkach zbiorczych. Wiruj 20 tysięcy razy G przez dwie minuty.

I dodaj trzysta mikrolitrów wody wolnej od RNaz i pozwól jej delikatnie obracać się na kołysku przez noc w temperaturze pokojowej. Aby wykonać wytrącanie DNA, następnego dnia przenieś zawartość probówki do probówek filtracyjnych o średnicy 5 mikronów. Zakręć 600 razy G przez ściśle dziesięć sekund.

Następnie dodaj dwa mikrolitry glikogenu, trzydzieści mikrolitrów trzech molowych octanu sodu, 1X farbę w postaci granulek i 975 mikrolitrów 100-procentowego etanolu do eluowanego DNA. Wiruj z prędkością 17 000 razy G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 20 minut. Wyrzuć supernatant i dodaj 75 procent etanolu, aby umyć osad.

Po wirowaniu z prędkością 17 tysięcy razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, wyrzuć supernatant i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku termicznym, całkowicie odparuj etanol. Ponownie zawiesić osad za pomocą 12 mikrolitrów 10-milimolowego chlorku trykieru o pH 8,5. Następnie przeprowadź kontrolę jakości biblioteki, rozcieńczając oczyszczone i uzupełniające DNA dziesięć razy i używając jednego mikrolitra rozcieńczonego CDNA do uruchomienia na bioanalizatorze.

Upewnij się, że rozmiar komplementarnego produktu DNA odpowiada zakresowi małego RNA w elektroferogramie między 136 a 160 parami zasad. Obliczyć całkowitą molowość dla każdej próbki. Znormalizować każdą próbkę do 2 nanomolowców za pomocą chlorowodorku tris o pH 8,5.

Trzymaj biblioteki, mieszając równe objętości każdej próbki nanomolowej w jednej dwustu mikrolitrowej probówce do PCR. Denaturacja i sekwencjonowanie zgodnie z krokami opisanymi w manuskrypcie. W tym badaniu biblioteka została przygotowana po wyizolowaniu RNA i przeprowadzono kontrolę jakości.

Rozmiar produktu dla mikro Rnazy ligowanej adapterem odpowiadał około 136 do 160 parom zasad dla każdej próbki. Podświetlone sekcje pokazują zakres żelu, który został precyzyjnie wycięty do małej biblioteki RNA preparatu. Ten rysunek przedstawia elektroforezę żelową i elektroferogramy dla oczyszczonej biblioteki komplementarnego DNA.

Mikro wypreparowana tkanka FFPE i EV pochodzące z surowicy. Reprezentatywne wskaźniki z małego sekwencjonowania RNA pokazują oczekiwaną gęstość klastra, wynik Q, procent filtra przechodzącego klaster oraz szacowaną wydajność i wskaźniki błędów dla mikrowypreparowanych tkanek FFP i EV pochodzących z surowicy. Wynik Q w obu próbkach wykazał wartość powyżej trzech, co wskazuje na 99,9 procent podstawowej dokładności wywołania.

A wszystkie poziomy błędów były poniżej jednego. Każdy etap przygotowania biblioteki powinien być starannie wykonany, a probówki powinny być natychmiast przenoszone do lodu po każdej inkubacji. Krytycznym krokiem w protokole jest precyzyjne przecięcie żelu, aby upewnić się, że masz adapter wolny od dimerów i czystą bibliotekę CDNA.

Generowanie biblioteki CDNA wymaga optymalizacji pod kątem wysokiej jakości przebiegu sekwencjonowania. Zrozumienie tego protokołu pomoże widzom w ekstrapolacji tych drobnych szczegółów na inne biblioteki sekwencjonowania, przygotowanie z ograniczonych próbek źródłowych sugeruje surowicę i pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. Ta technika pomogła nam w zidentyfikowaniu nowych mikronaz, które są związane z agresywnością nowotworów i opornością na terapię u pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty.

Techniki te można ekstrapolować na inne typy chorób, które mogą pomóc w odkryciu nowych biomarkerów. Ponieważ technika ta wykorzystuje materiały biologiczne, takie jak surowica i próbki tkanek pochodzące z prążkowania, należy podjąć odpowiednie środki ostrożności. Co więcej, bromek etydyny jest znanym czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim bardzo ostrożnie przy użyciu tego protokołu.