Name: Indukcja i wykrywanie apoptozy w pierwotnej hodowli komórek jelitowych ogórka morskiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj protokół hodowli pierwotnych komórek jelitowych z ogórka morskiego Apostichopus japonicus. Ta metoda umożliwia długoterminową kulturę z jednorodnym materiałem genetycznym do badań biologii morskiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować prof. Naaim Zhou z Uniwersytetu Zhejiang za jego porady techniczne i udostępnienie sprzętu jego laboratorium do użytku. Prace te były wspierane finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty o numerach 41876154, 41606150 i 41406137) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów i Instytutów Badawczych Prowincji Zhejiang [numer grantu 2019JZ00007].

1. Przygotowanie podłoża do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Preparat płynu celomicznego
	<ol>
		<li>Pobieranie płynu celomicznego: W sterylnych warunkach należy rozciąć zdrowy ogórek morski (mokra masa 85-105 g), pobrać płyn celomiczny i przechowywać go w sterylnej szklanej kolbie.</li>
		<li>Usuwanie komórek celomicznych: Odwirować płyn celomiczny w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml przy 1 700 x g przez 5 minut i przenieść supernatant do nowej sterylnej szklanej kolby; następnie zebrać bezkomórkowy płyn celomiczny z ogórka morskiego.</li>
		<li>Inaktywacja składników dopełniacza: Inkubować sterylną szklaną kolbę, zawierającą płyn celomiczny z ogórka morskiego, w łaźni wodnej o temperaturze 40–50 °C przez 20–40 minut, aby uzyskać płyn celomiczny inaktywowany składnikami dopełniacza.</li>
		<li>Usuwanie drobnoustrojów: Usuwanie bakterii i chlamydii poprzez filtrację przez filtry membranowe 0,22 μm. Następnie usuń mykoplazmę i inne drobne cząstki przez filtrację za pomocą filtrów membranowych 0,1 μm w celu uzyskania roztworu do wstępnej obróbki płynu celomicznego.</li>
		<li>Regulacja zasolenia: Dostosuj zasolenie roztworu do wstępnej obróbki płynu celomicznego do 30‰ (mierzonego za pomocą salinometru), dodając 20% wstępnie sterylizowanego i przefiltrowanego roztworu NaCl o wysokim stężeniu (rozcieńczonego wstępnie poddanym działaniu płynu celomicznego) lub DDW (podwójnie destylowanej wody). Przenieś płyn celomiczny z ogórka morskiego do sterylnej butelki, zamknij butelkę i przechowuj płyn w temperaturze 4 °C do dalszych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja pożywki L-15 firmy Leibovitz
	<ol>
		<li>Odważyć 5,05 g NaCl, 0,135 g KCl, 0,15 g CaCl2, 0,25 g Na2SO4, 0,975 g MgCl2, 0,25 g glukozy i 6,25 mg tauryny i rozcieńczyć je w 40 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Mieszaj probówkę na wytrząsarce przez 1 godzinę, aby upewnić się, że sole całkowicie się rozpuściły.</li>
		<li>Dodać 2,5 ml L-glutaminy (100 mg/ml) i 500 μl roztworu VE (1,75 mg/l) do wcześniej przygotowanej pożywki L-15 firmy Leibovitz i dalej przefiltrować pożywkę przez filtry membranowe 0,22 μm.</li>
		<li>Doprowadzić całkowitą objętość pożywki do 500 ml za pomocą świeżej pożywki L-15 firmy Leibovitz i 100 ml wcześniej przygotowanego płynu celomicznego; następnie dostosować pH do 7,6 za pomocą roztworu NaOH. Utrzymuj proces operacyjny w sterylnym środowisku. Stosunek mieszania płynu celomicznego może wynosić 10%–50%, a 20% jest wystarczające do hodowli komórek jelitowych A. japonicus.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek jelitowych
<ol>
	<li>Przetwarzanie jelit ogórka morskiego
	<ol>
		<li>Znieczulenie zdrowych ogórków morskich w pojemniku na lód. Wypreparuj i zbierz jelita przednie, a następnie przekrój próbki tkanek pionowo i usuń zawartość wewnętrzną.</li>
		<li>Próbki tkanek należy dwukrotnie przemyć w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i zdezynfekować je przez zanurzenie w wodnym roztworze etanolu (75% objętości) na nie dłużej niż 2 sekundy.</li>
		<li>Umyj próbki tkanek w PBS trzy razy, aby usunąć etanol i przenieś około 100 mg próbki tkanki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcja komórek
	<ol>
		<li>Dodaj 1,5 ml wstępnie zoptymalizowanej pożywki hodowlanej do bloku tkanki jelitowej ogórka morskiego i zmielić blok wysterylizowanymi nożyczkami chirurgicznymi, aż roztwór będzie mętny. 
		UWAGA: W przypadku opcjonalnego uproszczonego protokołu dodaj 0,5 ml wstępnie zoptymalizowanej pożywki hodowlanej do bloku tkanki jelitowej ogórka morskiego i pokrój blok wysterylizowanymi nożyczkami chirurgicznymi na 1 mm3. Bezpośrednio przenieść próbki do szalek hodowlanych, a następnie wykonać kolejne etapy inkubacji.</li>
		<li>Dodać 400 μl trypsyny (0,25%), wymieszać roztwór przez inwersję i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej; następnie przefiltrować roztwór za pomocą sitka do komórek 100 μm. 
		UWAGA: Dodanie trypsyny w celu dyspersji komórek jest opcjonalne podczas traktowania różnych próbek tkanek. Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) powinien być zawarty w roztworze trypsyny w celu zmniejszenia aktywności hamującej zCa2+ iMg2+ w pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Zebrać filtrat do nowej sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 2,0 ml, odwirować przy 1 700 x g przez 3 minuty, wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej (uzupełnionej antybiotykami) i przemyć go dwukrotnie. 
		UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować świeżą, wstępnie zoptymalizowaną pożywkę hodowlaną uzupełnioną 2% roztworem penicyliny i streptomycyny (10 000 U/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny) i 1% gentamycyny (4 mg/ml).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Nastawa inkubatora: Wstępnie ustawić inkubator do hodowli komórkowych i uruchomić go wcześniej na co najmniej 24 godziny w temperaturze 18 °C i wilgotności nasyconej. 
	UWAGA: Wprowadzić CO2 do inkubatora w zależności od właściwości pożywki do hodowli komórkowych; nie ma potrzeby dostarczania CO2 w przypadku korzystania z podłoża podstawowego L-15 firmy Leibovitz.</li>
	<li>Hodowla komórkowa w pierwszym etapie
	<ol>
		<li>Aby zahamować rozwój drobnoustrojów i promować proliferację w początkowej fazie hodowli komórkowej, dodaj 10 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (10 000 U/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny) i 0,5 ml gentamycyny (40 mg/ml) do każdych 500 ml wstępnie zoptymalizowanej pożywki hodowlanej. Ponadto co 500 ml pożywki hodowlanej należy uzupełnić 0,6 ml insuliny (10 mg/ml), 100 μl insulinopodobnego czynnika wzrostu (0,1 μg/μl) i 25 μl czynnika wzrostu fibroblastów (0,1 μg/μl).</li>
		<li>Zebrać komórki do probówek o pojemności 1,5 ml, zawiesić je ponownie przy użyciu 200 μl wskazanego podłoża i odpipetować do φ 4 cm szalkami.</li>
		<li>Hodować komórki w inkubatorze i po 6 godzinach dodać 2,0 ml wskazanej pożywki do szalek do hodowli komórek. Zmieniaj połowę pożywki co 12 godzin, aż do osiągnięcia następnego etapu. 
		UWAGA: Z wymianą podłoża należy obchodzić się delikatnie, ponieważ komórki nie są mocno przylegające do naczyń. Naczynia pokryte poli-D-lizyną mogą być używane do luźnego mocowania do komórek naczynia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugi etap hodowli komórkowej
	<ol>
		<li>Aby zmniejszyć niekorzystny wpływ antybiotyków na hodowane komórki, należy zmniejszyć stężenie wskazanych antybiotyków (penicyliny, streptomycyny i gentamycyny) w pożywce hodowlanej o połowę. 
		UWAGA: Stosowanie insuliny i czynników wzrostu zależy od warunków hodowli komórkowej i jest opcjonalne.</li>
		<li>Wymień pożywkę do hodowli komórkowych; przeprowadzaj zmiany pożywki co dwa do trzech dni, w zależności od gęstości komórek. 
		UWAGA: Codziennie obserwuj hodowane komórki pod mikroskopem i rejestruj warunki wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie komórek 
	UWAGA: Pasaż i subkultura komórek, gdy pierwotna gęstość komórek osiągnie 60%.
	<ol>
		<li>Umyj wyhodowane komórki dwukrotnie za pomocą PBS w temperaturze pokojowej. Dodaj 200 μl roztworu trypsyny (0,25%) do każdego naczynia i ręcznie wymieszaj naczynie, upewniając się, że całe dno jest przykryte. Wyrzuć roztwór trypsyny i inkubuj komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przemyć komórki 1,0 ml świeżej pożywki hodowlanej, pipetując i ponownie zawieszając komórki. Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórkowej do nowego naczynia, dodać 1,5 ml świeżej pożywki i inkubować komórki w temperaturze 18 °C. 
		UWAGA: Skrobaki do komórek mogą być używane do zbierania komórek, gdy roztwór trypsyny nie trawi i nie odrywa komórek od naczyń (niektóre linie komórkowe są zbyt adhezyjne). Nie należy jednak wykonywać obu metod jednocześnie.</li>
		<li>Po 12 godzinach należy zmienić podłoże i obserwować komórki pod mikroskopem, aby ocenić warunki. Hodować komórki do dalszych testów eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Indukcja i wykrywanie apoptozy w komórkach jelitowych A. japonicus
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa i leczenie deksametazonem
	<ol>
		<li>Przygotuj komórki jelitowe zgodnie z wcześniej wprowadzonym protokołem i dodaj komórki kroplami do 12-dołkowej płytki o objętości komórek 2 x 106 na dołek.</li>
		<li>Po trzech dniach w hodowli, postępując zgodnie z etapami "pierwszego etapu hodowli komórkowej", umyj komórki trzykrotnie PBS i zastąp pożywkę zoptymalizowaną pożywką (bez antybiotyków i czynników wzrostu).</li>
		<li>Rozcieńczyć deksametazon (DXMS) w pożywce hodowlanej, aby przygotować świeże roztwory DXMS 2 μM i 200 μM przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
		<li>Dodaj roztwory DXMS w różnych stężeniach do hodowanych komórek hodowanych z tą samą objętością pożywki hodowlanej; ustaw trzy grupy eksperymentalne, w tym kontrolną (CTL), 1 μM i 100 μM DXMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie Hoechst 
	<ol>
		<li>Przemyć komórki PBS trzy razy po inkubacji z/bez DXMS przez wskazane okresy czasu (0 h, 24 h i 48 h).</li>
		<li>Dodać 300 μl roztworu Hoechst 33258 na basenik do płytki 12-dołkowej i inkubować w temperaturze 18 °C przez 30 minut. Delikatnie poruszyć płytkę, aby pokryć wszystkie komórki, zapewniając ich zabarwienie.</li>
		<li>Usuń roztwór barwiący Hoechst i utrwal komórki, dodając 300 μl 4% roztworu paraformaldehydu (w PBS) do każdej studzienki. Delikatnie mieszać przez 15 min. 
		ostrożność: Paraformaldehyd jest umiarkowanie toksyczny w kontakcie ze skórą lub wdychaniu i jest określany jako prawdopodobny czynnik rakotwórczy dla ludzi. Podczas ważenia i obchodzenia się z paraformaldehydem należy używać dygestoriów chemicznych, wentylowanych komór wagowych lub innych środków ochronnych.</li>
		<li>Umyj utrwalone komórki trzykrotnie w PBS. Nie wyrzucaj PBS po umyciu, aby komórki były przykryte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza mikroskopii fluorescencyjnej
	<ol>
		<li>Włącz sprzęt mikroskopu fluorescencyjnego, w tym moc lampy rtęciowej, moc światła fluorescencyjnego i komputer. Zaloguj się na konto systemu operacyjnego, uruchom oprogramowanie i sprawdź jego konfigurację.</li>
		<li>Umieść przygotowaną płytkę na stoliku mikroskopu. Umieścić próbkę nad soczewką obiektywu za pomocą sterownika stolika.</li>
		<li>Znajdź interesujące Cię komórki pod mikroskopem świetlnym, przełącz się na mikroskopię fluorescencyjną i uchwyć obrazy, dostrajając parametry. 
		UWAGA: Aby zaobserwować sygnał fluorescencyjny Hoechst 33258 związany z DNA jąder, należy przeprowadzić mikroskopię fluorescencyjną ze wzbudzeniem i emisją odpowiednio przy około 352 nm i 461 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatnich dziesięcioleciach podjęto szeroko zakrojone wysiłki badawcze w celu ustalenia linii komórkowych, jednak nadal trudno jest poczynić postępy w zakresie długoterminowej hodowli komórek bezkręgowców morskich14,22. Doniesiono, że hodowane komórki z regenerujących się tkanek holothurian były zdolne do życia przez długi okres czasu, a wysoką aktywność proliferacji można wykryć w określonych komórkach17,23<...

Hodowla komórek w sztucznie kontrolowanych warunkach, a nie w ich naturalnym środowisku, dostarcza jednolitego materiału doświadczalnego do badań biologicznych, szczególnie dla gatunków, które nie mogą być łatwo hodowane w środowisku laboratoryjnym. Bezkręgowce morskie stanowią ponad 30% wszystkich gatunków zwierząt1 i dostarczają licznych materiałów biologicznych do prowadzenia badań nad mechanizmami regulacyjnymi określonych procesów biologicznych, takich jak regeneracja2,3, stress response4, oraz environmental adaptation5,6.
Ogórek morski, Apostichopus japonicus, jest jednym z najlepiej zbadanych gatunków szkarłupni zamieszkujących umiarkowane wody wzdłuż północnego wybrzeża Pacyfiku. Jest dobrze znany jako gatunek ważny komercyjnie i uprawiany na dużą skalę w Azji Wschodniej, zwłaszcza w Chinach7. Liczne pytania naukowe dotyczące A. japonicus, w tym mechanizmy regulacyjne leżące u podstaw regeneracji jelit po wypatroszeniu8 i degeneracja w aestivation9, kontrola metaboliczna10,11, oraz odpowiedź immunologiczna12,13 pod wpływem stresów termicznych lub patogennych, przyciągnęły uwagę badaczy. Jednak w porównaniu z dobrze zbadanymi zwierzętami modelowymi, badania podstawowe, zwłaszcza na poziomie komórkowym, są ograniczone przez wąskie gardła techniczne, takie jak brak zaawansowanych metod hodowli komórkowych.
Badacze poświęcili wiele wysiłku na stworzenie linii komórkowych, ale również napotkali wiele wyzwań i nie ustalono jeszcze żadnej linii komórkowej od jakiegokolwiek morskiego bezkręgowca14. Jednak pierwotne hodowle komórkowe bezkręgowców morskich poczyniły postępy w ostatnich dziesięcioleciach15,16 i stworzyły okazję do eksperymentów na poziomie komórkowym. Na przykład, regenerująca się intesyna z A. japonicus została wykorzystana jako źródło komórek do długoterminowych hodowli komórkowych, co zapewniło praktyczną metodę pierwotnej hodowli komórkowej bezkręgowców morskich17. W protokole tym połączono i zoptymalizowano podejścia do hodowli komórek bezkręgowych oraz opracowano szeroko odpowiednią metodę hodowli pierwotnej ogórka morskiego lub innych bezkręgowców morskich.
Apoptoza to wewnętrzny program samobójstwa komórek wywołany przez różne bodźce egzogenne i endogenne. Skoordynowana apoptoza ma kluczowe znaczenie dla wielu systemów biologicznych18,19 i została zaangażowana w regresję jelitową ogórka morskiego podczas estywacji9. Aby zbadać proces apoptozy w organizmach będących przedmiotem zainteresowania, opracowano szereg metod, w tym barwienie Hoechst i testy mikroskopowe, które zostały z powodzeniem zastosowane20. Tutaj przeprowadziliśmy indukcję i detekcję apoptozy w pierwotnych hodowanych komórkach jelitowych ogórka morskiego, aby ocenić przydatność komórek pierwotnych w badaniach biologicznych bezkręgowców morskich. Deksametazon, jeden z powszechnie stosowanych syntetycznych glikokortykosteroidów21, został użyty do wywołania apoptozy w hodowanych komórkach jelitowych z ogórka morskiego, a znaczący sygnał Hoechst 33258 został pomyślnie wykryty w barwionych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

<table><tbody><tr><td>0,1 &mu; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtr</td><td>Milipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filtr</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia 4 cm</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>4% roztwór paraformaldehydu</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm 80096618</td> w <td></td><td></td></tr><tr><td>wirówkach stołowych</td> PBS <td>Beckman</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>BeyoClick EdU-488 zestaw</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator stałotemperaturowy</td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna termostatyczna łaźnia wodna</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Etanol Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>80176961</td><td>75%</td></tr> <tr><td>czynnika wzrostu fibroblastów (FGF)</td> <td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>Garamycin</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny 63005518</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258 Roztwór do barwienia</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny do insuliny</td><td>Sinopharm</td><td></td><td></td>XW1106168001</tr><tr><td>Insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF)</td><td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina L-15 GNM41300</td><td></td><td></td><td>Genom</td> firmy Leibovitz</tr><tr><td>(100 mg / ml)</td><td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td></td><td></td>XW77863031</tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny 10019718</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Genom</td><td></td> <td>penicyliny-streptomycyny</td><td></td>GNM15140</tr><tr><td>miernik pH</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>Seebio</td><td>185791</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i wykrywanie apoptozy w pierwotnej hodowli komórek jelitowych ogórka morskiego

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Pierwotne hodowane komórki są używane w różnych dyscyplinach naukowych jako wyjątkowo ważne narzędzia do funkcjonalnej oceny substancji biologicznych lub charakteryzowania określonych aktywności biologicznych. Jednak ze względu na brak powszechnie stosowanych pożywek i protokołów do hodowli komórkowych, dobrze opisane metody hodowli komórkowych organizmów morskich są nadal ograniczone. Tymczasem powszechnie występujące zanieczyszczenie mikrobiologiczne i właściwości politropowe komórek bezkręgowców morskich dodatkowo utrudniają opracowanie skutecznej strategii hodowli komórkowej bezkręgowców morskich. Tutaj opisujemy łatwą w obsłudze metodę hodowli komórek jelitowych z ogórka morskiego Apostichopus japonicus; Dodatkowo podajemy przykład indukcji i wykrywania apoptozy in vitro w pierwotnych hodowanych komórkach jelitowych. Co więcej, eksperyment ten dostarcza szczegółowych informacji na temat odpowiedniej pożywki hodowlanej i metody pobierania komórek. Opisany protokół jest kompatybilny z wieloma powszechnie dostępnymi próbkami tkanek organizmów morskich, w tym Echinodermata, Mollusca i Crustacea, i może zapewnić wystarczającą ilość komórek do wielu zastosowań eksperymentalnych in vitro. Technika ta umożliwi naukowcom skuteczne manipulowanie pierwotnymi kulturami komórkowymi bezkręgowców morskich oraz ułatwi ocenę funkcjonalną docelowych materiałów biologicznych na komórkach.

W niniejszej pracy ustanowiliśmy pierwotną hodowlę komórek jelita A. japonicus i przeprowadziliśmy pasażowanie komórek. Rysunek 1 przedstawia okrągłe komórki w różnych stadiach hodowli. Analizy z użyciem barwienia EdU dostarczyły bezpośrednich dowodów na aktywność proliferacyjną tych okrągłych komórek w późniejszym stadium (Rysunek 2). Nieznacznie zmodyfikowaliśmy również protokół, hodując rozdrobnione bloki tkanki zamiast przefiltrowanych komórek; pona...

Ten protokół zapewnia łatwą w obsłudze metodę hodowli komórek jelitowych z ogórka morskiego Apostichopus japonicus i jest kompatybilny z wieloma powszechnie dostępnymi próbkami tkanek organizmów morskich, w tym Echinodermata, Mollusca i Crustacea.

Indukcja i wykrywanie apoptozy w pierwotnej hodowli komórek jelitowych ogórka morskiego

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Protokół zapewnia łatwą w obsłudze i szeroko kompatybilną metodę pierwotnej hodowli komórkowej bezkręgowców morskich. Technika ta daje naukowcom sposób na hodowlę komórek bezkręgowców morskich przez stosunkowo długi czas. Hodowla komórek powinna mieć zapewnione spójne tło genetyczne dla różnych dalszych biologicznych zastosowań eksperymentalnych w badaniach biologii morskiej.Biorąc pod uwagę nowe badania w tej dziedzinie, uważamy, że wskazany uproszczony protokół powinien być dobrym wyborem do wykonania. Po znieczuleniu należy wypreparować i pobrać jelita przednie, a następnie przeciąć próbki tkanek pionowo i usunąć zawartość wewnętrzną. Próbki tkanek należy dwukrotnie przemyć w PBS i zdezynfekować przez zanurzenie w 75% roztworze etanolu na czas nie dłuższy niż dwie sekundy.Następnie umyj próbki tkanek w PBS trzykrotnie, aby usunąć etanol i przenieś około 100 miligramów próbki tkanki do sterylnej mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów. Dodaj 1,5 mililitra wstępnie zoptymalizowanej pożywki hodowlanej do bloku tkanki jelitowej ogórka morskiego i zmiel blok wysterylizowanymi nożyczkami chirurgicznymi, aż roztwór będzie mętny. Dodaj 400 mikrolitrów 0,25% trypsyny.Wymieszaj roztwór

apoptosis-induction-detection-primary-culture-sea-cucumber-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Opracowany jest przepływ pracy wykorzystujący cytometrię przepływową lub wirowanie różnicowe do wykrywania, ilościowego oznaczania i izolowania ciał apoptotycznych z próbki apoptotycznej do wysokiej czystości.

Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych oraz analizy skuteczności efferocytozy i specyficznego blokowania apoptotycznych tymocytów za pośrednictwem inhibitorów. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w usuwaniu innych cząstek, w tym sztucznych kulek i bakterii, za pośrednictwem komórek.

Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Prezentowany protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określenia liczby proliferujących i martwych komórek w hodowanych enteroidach myszy. Metoda ta jest pomocna w ocenie wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację organoidów i przeżycie.

Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół opisuje prostą i opłacalną metodę badania i ilościowego określania śmierci komórek w organoidach ludzkiego jelita grubego w odpowiedzi na cytotoksyczne zaburzenia, takie jak cytokiny. Podejście to wykorzystuje fluorescencyjny barwnik śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopię fluorescencyjną na żywo i oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym w celu ilościowego określenia odpowiedzi pojedynczych organoidów na bodźce cytotoksyczne.

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Poznaj protokół hodowli pierwotnych komórek jelitowych z ogórka morskiego Apostichopus japonicus. Ta metoda umożliwia długoterminową kulturę z jednorodnym materiałem genetycznym do badań biologii morskiej.

Indukcja i wykrywanie apoptozy w pierwotnej hodowli komórek jelitowych ogórka morskiego

Przeglądaj więcej filmów