Zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy i kwantyfikacja ekspresji genów w komórkach hodowli tkankowej zakażonych salmonellą
12 stycznia 2020
Tutaj prezentujemy protokół do szybkiego i łatwego pomiaru czynnika jądrowego kappa-light-chain-enhancer aktywacji aktywowanych komórek B (NF-κB) w liniach komórkowych wyrażających NF-κB::lucyferazy reporterowe, poprzez pomiary luminescencji w lizacie komórkowym. Dodatkowo ekspresję genów określa się za pomocą RT-qPCR wyizolowanego z komórek zakażonych Salmonellą Typhimurium.
Protokół ten jest przydatny do określania zmian w aktywacji NF-kappa-B w komórkach wyrażających reporter lucyferazy NF-kappa-B. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wysokoprzepustowe badanie przesiewowe czynników lub warunków, które prowadzą do zmian w aktywacji NF-kappa-B. NF-kappa-B jest czynnikiem transkrypcyjnym dla wielu różnych procesów komórkowych.
Dobrze znaną funkcją NF-kappa-B jest indukcja reakcji zapalnych poprzez indukowanie ekspresji różnych cytokin i chemokin. Nasze laboratorium jest szczególnie zainteresowane indukcją NF-kappa-B indukowaną przez patogen Salmonella typhimurium. Tutaj używamy linii komórkowej HeLa, która jest stabilnie transfekowana plazmidem reporterowym lucyferazy NF-kappa-B.
Inne bakterie, a nawet wirusy lub związki chemiczne mogą być wykorzystywane w tej linii komórkowej do badania aktywacji NF-kappa-B. Inne linie komórkowe mogą być również użyte, jeśli możesz wprowadzić taki plazmid reporterowy lucyferazy NF-kappa-B do tej linii komórkowej. Ktoś, kto robi to po raz pierwszy, może mieć problemy z prawidłowym wykorzystaniem sterylnej techniki, która jest wymagana do hodowli komórek i pracy z bakteriami.
Na dzień przed stymulacją komórek usuń pożywkę wzrostową komórek HeLa 57A, które zostały wyhodowane do około 75% konfluencji. Umyj komórki jednym mililitrem 0,05% trypsyny EDTA. Zastąp kolejnym mililitrem trypsyny EDTA i przenieś kolbę do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na pięć minut.
Po odłączeniu komórek od kolby zawiesić je w 10 mililitrach pożywki wzrostowej. Połącz 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać, i przenieś 10 mikrolitrów na szkiełko licznika komórek. Policz komórki w zawiesinie za pomocą licznika komórek i użyj pożywki wzrostowej, aby rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do pięciu komórek na mililitr w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.
Przenieść 250 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 48-dołkowej płytki. Okresowo zakrywaj i obracaj stożkową rurkę, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Delikatnie postukaj w płytkę z boku, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozprowadzają się w studzienkach.
Przenieś płytkę do 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i pozwól komórkom przyczepić się i rosnąć przez noc. Umieść zamrożone zapasy Salmonelli na płytkach agarowych LB, aby wytworzyć pojedyncze kolonie. Przenieś płytki do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i pozwól na nocny wzrost.
Następnego dnia dodaj trzy mililitry LB do sterylnych probówek do hodowli bakterii i dodaj odpowiednie antybiotyki do pożywki. Używając sterylnej pętli inokulacyjnej, wybierz pojedynczą kolonię z prążkowanych kultur bakteryjnych i przyłóż pętlę do pożywki LB. Po zaszczepieniu zakryj probówki i wyrzuć pętlę.
Umieść probówki w inkubatorze wstrząsającym ustawionym na 37 stopni Celsjusza i 180 obr./min, a następnie pozwól bakteriom rosnąć przez noc. Rano pobierz z inkubatora nocne kultury bakterii. Przygotuj probówki do subkultury, dodając trzy mililitry świeżego LB i antybiotyków.
Przenieść 30 mikrolitrów nocnej kultury bakteryjnej do świeżo przygotowanej pożywki. Umieść probówki w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 stopni Celsjusza na trzy godziny. Po trzygodzinnej inkubacji przenieś jeden mililitr sterylnego bulionu LB do plastikowej kuwety, aby służyła jako półfabrykat.
Przenieść 900 mikrolitrów LB do innych kuwet, które mają być użyte do analizy próbki. Przenieś 100 mikrolitrów subkultury bakteryjnej do kuwety zawierającej 900 mikrolitrów LB i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Powtórzyć tę czynność dla każdej zawiesiny bakteryjnej.
Włącz spektrofotometr, aby zmierzyć gęstość optyczną kultur bakteryjnych na długości fali 600 nanometrów. Umieść ślepą próbę w spektrofotometrze. Zwróć uwagę na orientację.
Zamknij pokrywę i naciśnij pusty przycisk na spektrofotometrze, aby uzyskać absorbancję tła. Zastąp ślepą kuwetę próbną kuwetą w tej samej orientacji i naciśnij przycisk odczytu. Zapisz wartości OD600 w tych próbkach.
Pomnóż tę wartość przez 10, aby uwzględnić współczynnik rozcieńczenia. Rozcieńczyć zawiesinę w proporcji 1 do 10 w kuwecie i zmierzyć absorbancję, która powinna dać wartość około 0,1, co w przybliżeniu odpowiada 1 razy 10 do dziewięciu CFU na mililitr. W nowej probówce dodać odpowiednią objętość rozcieńczonej subkultury do świeżego LB, aby uzyskać zawiesinę jeden razy 10 do ośmiu CFU na mililitr, która ma być użyta jako inokulum.
Przygotować seryjne rozcieńczenia inokulum, przenosząc 50 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do probówki zawierającej 450 mikrolitrów sterylnego PBS, aż do uzyskania końcowego rozcieńczenia około 100 CFU na mililitr. Przenieść 100 mikrolitrów dwóch najniższych rozcieńczeń, 100 i 1000 CFU na mililitr, na dwie płytki agarowe LB i rozprowadzić zawiesinę za pomocą rozsiewacza komórek, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Przenieś te płytki do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc.
Następnego dnia policz kolonie i oblicz stężenie bakterii w początkowym inokulum, aby określić rzeczywiste stężenie inokulum. Tego samego dnia oznacz pokrywkę płytki zgodnie z warunkami infekcji, które będą stosowane dla każdej studzienki, przy czym każdy warunek należy wykonać w trzech egzemplarzach. Dodać 10 mikrolitrów inokulum do odpowiednich studzienek i dodać 10 mikrolitrów sterylnego LB do niezakażonych studzienek kontrolnych.
Aby zsynchronizować czas infekcji, umieść płytkę w wirówce stołowej i wiruj z prędkością 500 razy G przez pięć minut, upewniając się, że płytka jest zrównoważona. Następnie przenieś zainfekowane komórki do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Umieść stożkową probówkę o pojemności 15 mililitrów zawierającą podwielokrotność pożywki do hodowli komórkowych w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza do użycia w następnym kroku.
Godzinę po zakażeniu wyjmij 15-mililitrową stożkową probówkę zawierającą pożywkę do hodowli komórkowych z łaźni wodnej i przetrzyj zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Przenieść płytki do hodowli tkankowych z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Użyj sterylnych końcówek do zasysania pożywki ze studzienek i zastąp 250 mikrolitrami świeżej, ciepłej pożywki do hodowli komórkowych.
Włóż płytki do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkowe cztery godziny. Następnie wyjmij płytki z inkubatora dwutlenku węgla i odessaj pożywkę ze studzienek. Do analizy lucyferazy dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy komórek 1X do studzienek.
Przenieś płytkę do zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i inkubuj przez co najmniej 30 minut, aby zapewnić skuteczną lizę komórek. Następnie umieść płytkę zawierającą zamrożony lizat komórkowy na stole do rozmrożenia i przygotuj odczynniki substratu lucyferazy zgodnie z zaleceniami producenta. Pozwól, aby odczynniki substratu lucyferazy zrównoważyły się do temperatury pokojowej.
Następnie włącz czytnik płytek i otwórz odpowiedni program czytnika. Ustaw urządzenie tak, aby mierzyło luminescencję. Przenieś 10 mikrolitrów lizatu komórkowego do dołka na nieprzezroczystej 96-dołkowej płytce.
Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów odczynnika do oznaczania lucyferazy do każdego dołka nieprzezroczystej płytki. Delikatnie postukaj w płytkę z boku, aby dobrze wymieszać i upewnij się, że dolna powierzchnia jest pokryta płynem. Umieść tabliczkę w czytniku płytek i rozpocznij czytanie.
Skopiuj wartości luminescencji do arkusza kalkulacyjnego i wykreśl wyniki. Protokół ten koncentruje się na aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-kappa-B za pomocą zależnego od NF-kappa-B reportera lucyferazy, który jest stabilnie transfekowany do linii komórek HeLa. Rysunek ten przedstawia reprezentatywny eksperyment aktywacji lucyferazy zależnej od NF-kappa-B i ekspresji genu IL6 w komórkach HeLA 57A zakażonych szczepami Salmonella typhimurium.
Zakażenie dzikim szczepem SL1344 wywołało silny sygnał lucyferazy zarówno w ekspresji RLU, jak i IL6, który był zmniejszony w komórkach zakażonych potrójnym mutantem sopE2 sipA sopB i zredukowany do poziomów kontrolnych poczwórnym mutantem sipA sopB sopE2 sopE. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wykonywania seryjnych rozcieńczeń i powlekania. Zapewni to spójne inokulum we wszystkich szczepach.
Po zidentyfikowaniu czynników, które przyczyniają się do aktywacji NF-kappa-B i dalszych zmian w ekspresji mRNA, technika western blot może być wykorzystana do identyfikacji zmian w ekspresji białek. Protokół ten pozwolił naszemu laboratorium nie tylko ocenić aktywację NF-kappa-B indukowaną przez Salmonellę, ale także inne związki i białka biorące udział w aktywacji NF-kappa-B. Salmonella typhimurium jest ludzkim patogenem.
Podczas pracy z tymi bakteriami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół umożliwia szybkie ocena aktywacji NF-魏B w liniach komórkowych przy użyciu reportera NF-魏B::lucyferaza. Obejmuje również analizę ekspresji genów za pomocą RT-qPCR w komórkach zakażonych Salmonella Typhimurium.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Immunologia
- Mikrobiologia
Tło
- NF-魏B jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym zaangażowanym w różne procesy komórkowe.
- Odgrywa istotną rolę w reakcjach zapalnych poprzez regulację ekspresji cytokin i chemokin.
- To badanie koncentruje się na aktywacji NF-魏B wywołanej przez Salmonella Typhimurium.
- Linia komórkowa HeLa jest wykorzystywana w tym badaniu ze względu na jej stabilną transfekcję reporterem NF-魏B luciferase.
Cel badania
- Aby zmierzyć aktywację NF-魏B w odpowiedzi na różne bodźce.
- Aby zbadać wpływ Salmonella Typhimurium na sygnalizację NF-魏B.
- Aby ułatwić wysoko przepustowe przesiewowe badania czynników wpływających na aktywację NF-魏B.
Stosowane metody
- Pomiar luminescencji w lizatach komórkowych w celu oceny aktywacji NF-魏B.
- RT-qPCR do analizy ekspresji genów w zakażonych komórkach.
- Zastosowanie komórek HeLa stabilnie ekspresujących reporter NF-魏B::lucyferaza.
- Techniki wysoko przepustowe do oceny różnych warunków.
Główne wyniki
- Sukcesywne pomiary poziomów aktywacji NF-魏B w odpowiedzi na infekcję Salmonella.
- Identyfikacja kluczowych czynników modulujących ścieżki sygnałowe NF-魏B.
- Wykazanie skuteczności systemu reportera luciferase dla wysoko przepustowości badań.
- Dostarczenie informacji na temat roli NF-魏B w reakcjach zapalnych.
Wnioski
- Protokół oferuje niezawodną metodę badania aktywacji NF-魏B.
- Może być stosowany w różnych kontekstach badawczych dotyczących stanów zapalnych i infekcji.
- To podejście zwiększa nasze zrozumienie roli NF-魏B w reakcjach komórkowych na patogeny.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput assessment of NF-κB activation in response to infectious agents, supporting target validation in inflammatory disease pathways. By linking pathogen-induced signaling to luciferase reporter output, it provides a quantitative, reproducible readout for de-risking mechanistic hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target engagement and pathway modulation, particularly for anti-infective and immunomodulatory programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of NF-κB as a central node in inflammatory signaling cascades triggered by pathogen-associated molecular patterns.
- Operational Value: Provides a stable, luciferase-based reporter system for consistent, quantitative measurement of transcription factor activation across experimental conditions.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets upstream or downstream of NF-κB by correlating pathogen strain genetics with signal output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-responsive luminescence signals that reflect NF-κB nuclear translocation and transcriptional activity, enabling compound or strain screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats and standard luminometers, facilitating medium-to-high throughput screening of chemical libraries or microbial mutants.
- Assay Readiness: Produces a linear, luminescent readout that correlates with target gene expression, supporting assay standardization and inter-lab reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Measures NF-κB-dependent gene expression (e.g., IL-6) via RT-qPCR, aligning reporter output with endogenous biomarker induction in relevant infection models.
- Mechanistic De-risking: Allows discrimination between bacterial virulence factors (e.g., SopE, SipA) that modulate NF-κB, informing target selection for immunomodulatory interventions.
- Disease Relevance: Models host-pathogen interactions that drive inflammatory responses, applicable to sepsis, gastroenteritis, and mucosal immunity programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, where pathway activation is assessed prior to lead identification, enabling prioritization of targets based on functional relevance in immune activation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase inhibitors, adaptor proteins, or ubiquitin ligases that regulate IκB degradation and NF-κB nuclear translocation.
- Screening: Enables evaluation of compound libraries or pathogen mutants for modulatory effects on NF-κB activity in a controlled cellular context.
- Analytics: Delivers quantitative luminescence and mRNA expression data that allow normalization, statistical comparison, and EC50/IC50 estimation.
- Translational Research: Connects reporter activation to endogenous cytokine expression, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: The HeLa-NF-κB-luciferase platform can be reused across projects involving TLR signaling, inflammasome activation, or cytokine storm models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, real-time readout of transcription factor activation state.
- Operational Value: Standardizes NF-κB measurement across teams using a genetically encoded reporter, minimizing variability from antibody-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional pathway output in a pathogen-relevant context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on their ability to attenuate pathogen-induced NF-κB signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, bacterial pathogenesis, and biosafety level 2 practices for Salmonella handling.
- Dependent on luminometer access and compatible plate reader software for luminescence acquisition and data export.
- Necessitates standardization of MOI, infection timing, and lysis procedures to ensure reproducible signal across experiments.
- Adaptation to primary immune cells or alternative cell lines requires successful transfection or transduction of the NF-κB-luciferase reporter construct.
- Signal interpretation must account for potential cytotoxicity or non-specific luciferase induction, necessitating parallel viability controls.
