Name: Zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy i kwantyfikacja ekspresji genów w komórkach hodowli tkankowej zakażonych salmonellą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę pomiaru aktywacji NF-κB za pomocą reportera lucyferazy w komórkach HeLa zakażonych Salmonella Typhimurium. Protokół umożliwia szybkie badanie odpowiedzi zapalnej i analizę ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Keestra-Gounder są wspierane przez granty z NIAID NIH pod numerem nagrody R21AI122092 oraz z American Diabetes Association pod numerem nagrody 1-18-JDF-035.

<ol><li>Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+signaling+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB signaling in inflammation.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).</li>
<li>Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%3A+a+stress-regulated+switch+for+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).</li>
<li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651(2009).</li>
<li>Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+ICP27-dependent+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).</li>
<li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+protease+cleavage+of+inhibitor+of+kappaBalpha+triggers+host+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+effector+binding+to+ribosomal+protein+s3+subverts+NF-kappaB+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function.</a> PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708(2009).</li>
<li>Kravchenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+via+disruption+of+NF-kappaB+signaling+by+a+bacterial+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule.</a> Science. 321 (5886), 259-263 (2008).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+to+NF-kappaB+by+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).</li>
<li>Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Targeting+by+Enteropathogenic+Bacteria+T3SS+Effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors.</a> Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).</li>
<li>Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+NF-kappaB+is+activated%3A+the+role+of+the+IkappaB+kinase+%28IKK%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex.</a> Oncogene. , (1999).</li>
<li>Berti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+RT-PCR+analysis+of+inflammatory+gene+expression+associated+with+ischemia-reperfusion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).</li>
<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li>
<li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li>
<li>Renard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Research. 29 (4), E21(2001).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).</li>
<li>Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+NF-kappaB+Activation+in+TLR-Activated+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).</li>
<li>Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retention+of+IkappaBalpha+protects+it+from+signal-induced+degradation+and+inhibits+nuclear+factor+kappaB+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).</li>
<li>Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+endoplasmic+reticulum+stress+response+impacts+the+NOD1+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li>
<li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic-Dependent+Salmonella-Typhimurium+Are+Non-Virulent+and+Effective+as+Live+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li>
<li>Keestra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+small+Rho+GTPases+is+a+pathogen-induced+process+detected+by+NOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1.</a> Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).</li>
<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+characterization+of+NF-kappaB+binding+uncovers+non-canonical+motifs+and+advances+the+interpretation+of+genetic+functional+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits.</a> Genome Biology. 12 (7), R70(2011).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).</li>
<li>Cogswell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+regulates+IL-1+beta+transcription+through+a+consensus+NF-kappa+B+binding+site+and+a+nonconsensus+CRE-like+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site.</a> Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Heterodimeric+Cysteine+Protease+Is+Required+for+Interleukin-1-Beta+Processing+in+Monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym wkładem opisanego protokołu jest to, że zapewnia on szybką i łatwą metodę wykrywania aktywacji NF-κB w komórkach, co pozwala na wysokoprzepustową analizę wielu stanów stymulujących lub leków wpływających na aktywację NF-κB. W tym miejscu opisujemy protokół aktywacji NF-κB w komórkach HeLa zakażonych Salmonellą. Komórki te mogą być również wykorzystywane do infekcji innymi patogenami, a także do badania wpływu infekcji bakteryjnej na aktywację NF-κB. Ponadto zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy w komórka...

Rodzina białek czynnika jądrowego κB (NF-κB) jest ważnym aktywatorem transkrypcji, który reguluje ekspresję genów w różnych szlakach biologicznych. Aktywacja NF-κB indukuje transkrypcję docelowych genów, z których wiele jest ważnych dla odpowiedzi immunologicznej i zapalnej, proliferacji komórek, reakcji na stres i progresji raka1,2. NF-κB odgrywa integralną rolę we wczesnym etapie stanu zapalnego w celu usunięcia patogenu. Biorąc pod uwagę wiele procesów biologicznych, w których pośredniczy aktywacja NF-κB, zakłócenia w jego sygnalizacji mogą mieć poważne konsekwencje dla zdrowia i choroby. Mutacje powodujące utratę funkcji w sygnalizacji NF-κB są związane z kilkoma fenotypami niedoboru odporności, podczas gdy mutacje związane ze wzmocnieniem funkcji są związane z kilkoma typami nowotworów, w tym chłoniakami z komórek B i rakiem piersi3. Ponadto wykazano, że wiele patogenów bezpośrednio moduluje stan aktywacji NF-κB poprzez ekspresję czynników wirulencji4,5,6,7.
Aktywacja NF-κB jest znana jako konsekwencja wielu zmiennych bodźców, w tym produktów bakteryjnych, takich jak lipopolisacharydy (LPS), flagelina i peptydoglikany znane jako wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP). Te PAMP są wykrywane przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR), takie jak receptory Toll-podobne (TLR) i receptory podobne do Nod (NLR), co prowadzi do aktywacji NF-κB, a następnie ekspresji szeregu genów zapalnych zależnych od NF-κB8. Oprócz aktywacji PRR przez PAMP, inne produkty bakteryjne, takie jak bakteryjne białka efektorowe, mogą indukować aktywację NF-κB. Co ciekawe, bakterie wykazują również ekspresję białek efektorowych, które aktywnie osłabiają szlak NF-κB i zwiększają ich patogenność, co podkreśla znaczenie NF-κB jako niezbędnego mediatora odporności9.
Istnieje pięć różnych podjednostek, które tworzą dimery NF-κB; p50, p52, RelA (p65), RelB i cRel. Dwa główne heterodimery NF-κB to dimery p50:RelA i p52:RelB. Aktywowane dimery NF-κB wiążą się z miejscami DNA, znanymi jako miejsca κB, w regionach promotora i wzmacniacza różnych genów docelowych. W normalnych warunkach homeostatycznych NF-κB oddziałuje z rodziną białek inhibitorowych znanych jako białka IκB, pozostając nieaktywnymi. Po stymulacji IκB jest fosforylowany przez kinazę IκB (IKK), co pozwala na ukierunkowanie go na ubikwitynację, a następnie degradację. Degradacja IκB aktywuje NF-κB poprzez ujawnienie sygnału lokalizacji jądrowej. NF-κB następnie przemieszcza się do jądra, gdzie wiąże miejsca κB w regionie promotorowym genów docelowych i promuje transkrypcję10. Tak więc aktywacja NF-κB zwiększa ekspresję mRNA docelowych genów NF-κB, a zmianę tę można zmierzyć za pomocą testów kwantyfikacji RNA, takich jak RT-qPCR11.
Istnieje kilka metod, które są powszechnie używane do pomiaru aktywacji NF-κB, w tym testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), translokacji jądrowej i testy reporterowe genów. EMSA służy do wykrywania kompleksów białkowych z kwasami nukleinowymi. Stymulowane komórki są frakcjonowane w celu wyizolowania białek jądrowych, w tym translokowanego NF-κB, który jest następnie inkubowany z znakowanymi radioaktywnie nukleotydami zawierającymi domenę wiążącą NF-κB. Próbki są umieszczane w żelu i obrazowane za pomocą autoradiografii 32kwasów nukleinowych znakowanych P. Jeśli NF-κB jest obecny we frakcji białkowej, zwiąże nukleotydy, które będą wolniej migrować przez żel i będą obecne jako dyskretne prążki. Frakcje jądrowe komórek pozbawionych aktywowanego NF-κB (np. Niestymulowane komórki kontrolne) nie wytwarzają prążków, ponieważ nukleotydy migrują szybciej do końca żelu. Główną wadą tej metody jest to, że jest ona w dużej mierze ilościowa w sensie binarnym (tj. włączona lub wyłączona) i nie oddaje odpowiednio znaczących różnic w zdolności wiązania NF-κB. Ponadto metoda ta nie uwzględnia struktur chromatyny, które są funkcjonalnie ważne dla docelowych genów NF-κB12,13.
Podobnie jak w poprzedniej metodzie, istnieje test "bez przesunięcia", w którym płytki wielodołkowe są pokryte nukleotydami zawierającymi sekwencję wiążącą NF-κB. Po potraktowaniu komórek frakcjami jądrowymi białka, NF-κB zwiąże się z nukleotydami związanymi ze studnią. Następnie dodawane są przeciwciała anty-NF-κB, które będą oddziaływać ze związanym NF-κB i wytwarzać sygnał kolorymetryczny proporcjonalny do ilości NF-κB, wskazujący stopień aktywacji NF-κB. Metoda ta jest korzystniejsza w stosunku do EMSA, ponieważ nie wymaga znakowanych radioizotopowo kwasów nukleinowych i jest ilościowa. Jednak zastrzeżenie tej metody polega na tym, że ponownie nie różnicuje ona stanów chromatyny docelowych genów NF-κB14.
Inną metodą, za pomocą której można wykryć aktywację NF-κB, jest immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), dzięki której DNA i oddziałujące białka są sieciowane formaldehydem i immunoprecypitowane specyficznymi przeciwciałami anty-NF-κB. Specyficzne fragmenty nukleotydów są następnie oczyszczane i identyfikowane poprzez amplifikację PCR lub bezpośrednie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Wyniki uzyskane tą metodą dostarczają półilościowych wyników aktywności wiązania NF-κB z genami docelowymi. Jednak wyniki są w dużym stopniu zależne od warunków utrwalania i procesów oczyszczania na każdym etapie15.
W testach translokacji jądrowej komórki są stymulowane do wywołania aktywacji NF-κB, a następnie utrwalane. Przeciwciała anty-p65 są dodawane do utrwalonych komórek. Alternatywnie, sama podjednostka p65 może być oznaczona peptydem fluorescencyjnym, takim jak zielony zielony fluorescencyjny (GFP). W obu przypadkach immunofluorescencja pozwoli na obrazowanie lokalizacji p65 w celu określenia dystrybucji komórkowej. Mierząc proporcję białka zlokalizowanego cytozolowo i jądrowo, badacze mogą określić względny stan aktywacji NF-κB. Wadą tej metody jest to, że immunofluorescencja jest stosunkowo czasochłonna, wymaga drogich przeciwciał i wymaga stosunkowo większej wiedzy technicznej16.
Geny reporterowe są powszechnie używanymi narzędziami do badania wzorców regulacji i ekspresji interesującego genu. Zazwyczaj geny reporterowe są konstruowane z sekwencji promotorowej genu będącego przedmiotem zainteresowania połączonej z genem kodującym łatwo wykrywalne białko. Białka o aktywności enzymatycznej, fluorescencji lub właściwościach luminescencyjnych są powszechnie wybierane ze względu na ich zdolność do oznaczania i oznaczania ilościowego. W ten sposób odczyt (np. luminescencja, fluorescencja) służy jako sygnał do wykrywania ekspresji genu. Te konstrukty reporterowe można następnie wprowadzić do różnych typów komórek, takich jak komórki nabłonkowe lub makrofagi.
Opisane w protokole jest użycie sklonowanej linii komórkowej HeLa (HeLa 57A), która jest stabilnie transfekowana reporterem lucyferazy zawierającym trzy kopie konsensusu κB regionu promotora łańcucha κ immunoglobuliny17. Ekspresja lucyferazy jest zależna od aktywacji NF-κB, która następuje po stymulacji komórek. Stymulowane komórki są łatwo poddawane lizie za pomocą buforu do lizy komórek znajdującego się w zestawie do oznaczania lucyferazy. Część lizatu komórkowego jest następnie mieszana z buforem testowym lucyferazy, który zawiera lucyferynę. Lucyferyna jest substratem lucyferazy i jest niezbędna do wytwarzania światła w obecności lucyferazy. Po połączeniu buforu testowego z lizatem, roztwór będzie emitował światło w procesie znanym jako luminescencja. Ilość wytwarzanego światła, podawana w lumenach, jest proporcjonalna do ilości lucyferazy obecnej w lizacie i służy jako miara aktywacji NF-κB. Odczyty strumienia świetlnego są interpretowane w porównaniu z niestymulowanym wzorcem w celu uwzględnienia podstawowej aktywności NF-κB, a sam sygnał jest stabilny przez kilka minut, co pozwala na wiarygodny pomiar. Ponadto linia komórkowa HeLa 57A jest stabilnie transfekowana reporterem β-galaktozydazy niezależnym od NF-κB. Reporter β-galaktozydazy ulega konstytutywnej ekspresji, a aktywność β-galaktozydazy można zmierzyć w celu kontrolowania żywotności komórek lub zmienności liczby komórek17. Wartości lucyferazy można następnie dostosować do wartości β-galaktozydazy i podać jako wzrost krotności w stosunku do niestymulowanych komórek kontrolnych.
Ponieważ NF-κB jest czynnikiem transkrypcyjnym odpowiedzialnym za zwiększoną ekspresję genów docelowych zależnych od NF-κB, kolejnym eksperymentem mającym na celu kontrolę zwiększonej ekspresji genu zależnej od NF-κB jest ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). RT-qPCR jest bardzo czułą metodą, za pomocą której zmiany w ekspresji genów można określić ilościowo w kilku rzędach wielkości. Stymulowane i kontrolne komórki są zbierane na RNA poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową. Po rozdzieleniu faz RNA jest ekstrahowany jako główny składnik warstwy wodnej. RNA jest następnie wytrącane i przemywane w celu wytworzenia czystej osadki. Osad ten jest następnie odtwarzany i dalej oczyszczany z zanieczyszczonego DNA poprzez obróbkę DNazą. Czyste RNA jest następnie poddawane odwrotnej transkrypcji w celu utworzenia komplementarnego DNA (cDNA). To cDNA można następnie przeanalizować za pomocą ilościowych technik PCR, w których obfitość określonej sekwencji mRNA jest określana ilościowo w celu określenia ekspresji genów. Technika ta nie wyjaśnia kontroli translacyjnej, modyfikacji potranslacyjnej, obfitości białek ani aktywności białek. Jednak wiele genów, szczególnie tych zaangażowanych w procesy prozapalne, jest regulowanych przez NF-κB, a ich obfitość mRNA wskazuje na ich ekspresję.
Proponowana tutaj metoda wykorzystuje szybki i prosty sposób, dzięki któremu aktywacja NF-κB może być wykryta za pomocą testów luminescencyjnych lizatu komórkowego. RT-qPCR ekspresji docelowego genu NF-κB może być stosowany do ilościowego określania ekspresji poszczególnych genów, a także walidacji funkcjonalnej aktywności aktywacji NF-κB. Głównymi zaletami takiego systemu są jego prostota i szybkość, co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe w zakresie warunków, które modulują aktywację NF-κB. Protokół ten jest odpowiedni dla innych linii komórkowych wykazujących ekspresję reportera NF-κB::lucyferazy i został zademonstrowany w stabilnie transfekowanych komórkach RAW264.718. Czas potrzebny do obsługi próbek, począwszy od lizy komórek do wygenerowania sygnału luminescencyjnego, jest minimalny i zajmuje około godziny. Pomiar NF-κB wymaga jedynie podstawowego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak nieprzezroczyste płytki, czytnik płytek zdolny do pomiaru luminescencji oraz proste oprogramowanie do analizy danych, takie jak arkusz kalkulacyjny.

<table><tbody><tr><td>Folia samoprzylepna</td><td>VWR International</td><td>60941-070</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11665092</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do leczenia DNAzy</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818100</td><td>klasy molekularnej</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr>Komórki <td></td><td></td><td>HeLa 57A</td><td>Ref # 15</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Odczynniki Fishera</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Bioreaktory Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Rosół lizogeniczny</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>spektrofotometr</td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Promega</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Bufor do lizy komórek i substrat</td></tr> <tr><td>lucyferynyLosowy Hexamers</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr>Starter <td></td><td></td><td>do przodu GAPDH w czasie rzeczywistym</td><td>5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'Starter</td></tr> <tr><td>odwrotny</td><td></td><td></td> GAPDH w czasie rzeczywistym <td>5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'Starter</td></tr> <tr><td>do przodu</td><td></td><td></td> IL-23 w czasie rzeczywistym <td>5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'W</td></tr> <tr><td>czasie rzeczywistym Odwrócony starter IL-23</td><td>5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'Starter</td> naprzód IL-6 w czasie rzeczywistym 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'Starter odwrotny IL-6 w czasie rzeczywistym 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'Odwrotna transkryptaza Applied Biosystems 4308228 inhibitor RNAzy Thermo <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Naukowy</td><td>bufor EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RT</td><td>Promega</td><td>A3561</td><td></td></tr><tr><td>SL1344</td><td></td><td></td><td>Nr ref. # 17</td></tr><tr><td>SL1344 &Delta; sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039</td><td></td><td></td><td>Ref # 18</td></tr><tr><td>SL1344 &Delta; sopE &Delta; sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039</td><td></td><td></td><td>Ref # 18</td></tr><tr><td>SYBR zielony</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>2x mastermix</td></tr><tr><td>Tri-reagent</td><td>Centrum Badań Molekularnych</td><td>TR 118</td><td>tiocyjanian guanidyny</td></tr><tr><td>Trypsyna -EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td></tr><tr><td>Ultraczysta woda</td><td>Bioreagenty</td> <td>Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Płytka BP248450 dołkowa do PCR</td><td>VWR International</td><td>89218-294</td><td>Płytka 384-dołkowa</td></tr></tbody></table>

zależna od nf-κb aktywacja lucyferazy i kwantyfikacja ekspresji genów w komórkach hodowli tkankowej zakażonych salmonellą

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

Dimeryczny czynnik transkrypcyjny NF-κB reguluje wiele szlaków odpowiedzi komórkowych, w tym szlaki zapalne, indukując ekspresję różnych cytokin i chemokin. NF-κB ulega konstytutywnej ekspresji i jest sekwestrowany w cytozolu przez białkowy czynnik jądrowy białka hamującego wzmacniacza genu polipeptydu kappa light w inhibitorze limfocytów B, alfa (IκBα). Aktywacja NF-κB wymaga degradacji IκBα, która następnie uwidacznia sygnał lokalizacji jądrowej na NF-κB i sprzyja jego transportowi do jądra. Po dostaniu się do jądra NF-κB wiąże się z regionem promotora docelowych genów NF-κB, takich jak interleukina 6 (IL-6) i IL-23, aby promować ich ekspresję.
Aktywacja NF-κB następuje niezależnie od transkrypcji czy translacji. W związku z tym stan aktywacji NF-κB musi być mierzony albo poprzez ilościowe określenie NF-κB specyficznie w jądrze, albo poprzez ilościowe określenie ekspresji docelowych genów NF-κB. W tym protokole komórki stabilnie transfekowane konstruktem reporterowym NF-κB::lucyferazy są testowane pod kątem aktywacji NF-κB przy użyciu technik hodowli tkankowej in vitro. Komórki te są zakażone Salmonellą Typhimurium w celu aktywacji NF-κB, który przemieszcza się do jądra i wiąże się z miejscami κB w regionie promotorowym lucyferazy, indukując jego ekspresję. Komórki są poddawane lizie i analizowane za pomocą systemu testów lucyferazy. Ilość lucyferazy wytwarzanej przez komórki koreluje z intensywnością sygnału luminescencji, który jest wykrywany przez czytnik płytkowy. Sygnał luminescencyjny generowany przez tę procedurę zapewnia szybką i bardzo czułą metodę oceny aktywacji NF-κB w różnych warunkach. Protokół ten wykorzystuje również ilościową reakcję PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) do wykrywania względnych poziomów mRNA, które wskazują na ekspresję genów.

Opisany tutaj test skupia się na aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB przy użyciu zależnego od NF-κB reportera lucyferazy, który został stabilnie przetransfekowany do linii komórek HeLa. Aktywowany NF-κB przemieszcza się do jądra komórkowego, gdzie wiąże się z sekwencjami wiążącymi κB genów docelowych, w tym pro zapalnych cytokin IL6 oraz IL23. Ogólny przegląd aktywacji NF-κB przedstawiono na Rysunku 1. Gram-ujemna bakteria Salmonel...

Tutaj prezentujemy protokół do szybkiego i łatwego pomiaru czynnika jądrowego kappa-light-chain-enhancer aktywacji aktywowanych komórek B (NF-κB) w liniach komórkowych wyrażających NF-κB::lucyferazy reporterowe, poprzez pomiary luminescencji w lizacie komórkowym. Dodatkowo ekspresję genów określa się za pomocą RT-qPCR wyizolowanego z komórek zakażonych Salmonellą Typhimurium.

Zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy i kwantyfikacja ekspresji genów w komórkach hodowli tkankowej zakażonych salmonellą

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

Protokół ten jest przydatny do określania zmian w aktywacji NF-kappa-B w komórkach wyrażających reporter lucyferazy NF-kappa-B. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wysokoprzepustowe badanie przesiewowe czynników lub warunków, które prowadzą do zmian w aktywacji NF-kappa-B. NF-kappa-B jest czynnikiem transkrypcyjnym dla wielu różnych procesów komórkowych.Dobrze znaną funkcją NF-kappa-B jest indukcja reakcji zapalnych poprzez indukowanie ekspresji różnych cytokin i chemokin. Nasze laboratorium jest szczególnie zainteresowane indukcją NF-kappa-B indukowaną przez patogen Salmonella typhimurium. Tutaj używamy linii komórkowej HeLa, która jest stabilnie transfekowana plazmidem reporterowym lucyferazy NF-kappa-B.Inne bakterie, a nawet wirusy lub związki chemiczne mogą być wykorzystywane w tej linii komórkowej do badania aktywacji NF-kappa-B. Inne linie komórkowe mogą być również użyte, jeśli możesz wprowadzić taki plazmid reporterowy lucyferazy NF-kappa-B do tej linii komórkowej. Ktoś, kto robi to po raz pierwszy, może mieć problemy z prawidłowym wykorzystaniem sterylnej techniki, która jest wymagana do hodowli komórek i pracy z bakteriami.Na dzień przed stymulacją komór

nf-b-dependent-luciferase-activation-quantification-gene-expression

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

Ten film demonstruje metodę śledzenia infekcji wirusowych w modelach mysich przy użyciu rekombinowanego wirusa grypy A z ekspresją białka rekombinowanego i fluorescencji, wyrażającego bi-reporter. Metoda ta umożliwia prowadzenie badań zarówno in vivo, jak i ex vivo, umożliwiając naukowcom uzyskanie wglądu w dynamikę wirusa i efekty interwencji.

Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych

Ten film demonstruje test do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem poxvirus. Niezakażone i zakażone wirusem komórki były współtransfekowane mRNA kodującymi lucyferazy świetlika (Fluc) i lucyferazy Renilla (Rluc), przy czym mRNA Fluc zawierało sekwencję liderową 5' poli(A). Po dodaniu substratów bioluminescencyjnych na lizowanych komórkach, zmierz sygnał z obu lucyferazy, aby zidentyfikować przewagę translacyjną mRNA Fluc w komórkach zakażonych wirusem, przyznaną przez...

Test reporterowy lucyferazy do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych ospą

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Przedstawiono szczegółowy protokół mysiego modelu kolonizacji enterokwotocznej E. coli (EHEC) przy użyciu bakterii znakowanych bioluminescencyjnie. Wykrycie tych bioluminescencyjnych bakterii za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania in vivo u żywych zwierząt może poszerzyć naszą obecną wiedzę na temat kolonizacji EHEC.

Wykrywanie enterokrwotocznej kolonizacji Escherichia coli u mysiego gospodarza za pomocą nieinwazyjnego systemu bioluminescencji in vivo

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Wirusy grypy A (IAV) są zakaźnymi patogenami układu oddechowego, które powodują coroczne epidemie i sporadyczne pandemie. W tym miejscu opisujemy protokół śledzenia infekcji wirusowych in vivo przy użyciu nowej rekombinowanej lucyferazy i bi-reporterowego IAV z ekspresją fluorescencji (BIRFLU). Takie podejście zapewnia naukowcom doskonałe narzędzie do badania IAV in vivo.

Lucyferazy-fluorescencyjny wirus reporterowy grypy do obrazowania na żywo i ilościowego oznaczania infekcji wirusowej

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Poznaj metodę pomiaru aktywacji NF-κB za pomocą reportera lucyferazy w komórkach HeLa zakażonych Salmonella Typhimurium. Protokół umożliwia szybkie badanie odpowiedzi zapalnej i analizę ekspresji genów.

Zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy i kwantyfikacja ekspresji genów w komórkach hodowli tkankowej zakażonych salmonellą

Przeglądaj więcej filmów