Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego
January 29th, 2020
Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.
Immunohistochemia całego wierzchowca jest stosunkowo szybką i prostą techniką, która pozwala na przestrzenną i czasową obserwację białek bezpośrednio w tkance lub organizmie za pomocą znakowanych przeciwciał. Użyteczność tej techniki polega na tym, że pozwala ona na barwienie nienaruszonej tkanki lub organizmu bez konieczności jej uprzedniego cięcia, a mikroskopia konfokalna może być wykorzystana do wygenerowania trójwymiarowej reprezentacji wzorca ekspresji białka. Immunohistochemia jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych w celu zrozumienia etiologii i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw choroby.
Jest to również cenne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji guzów w próbkach patologicznych. Na początek przygotuj zbiorniki tarłowe wypełnione wodą systemową i z siatką lub szczelinową wkładką. Umieść dorosłe pary mieszanej płci danio pręgowanego w grupach w zbiornikach na noc.
Stosuj 14-godzinny/10-godzinny cykl światła/ciemności ze światłami włączającymi się o 9 rano. Następnego ranka, przy włączonych światłach, wymień wodę w zbiorniku tarłowym na świeżą wodę systemową, aby usunąć kał. Po złożeniu jaj przywróć dorosłe osobniki do zbiorników domowych.
Zbierz jaja, pobierając je za pomocą pipety transferowej. Przenieś 50 jaj na każdą szalkę Petriego wypełnioną do połowy pożywką dla zarodków. Usuń wszelkie nieprzezroczyste i mętne jaja, które są martwe lub nie udało się podzielić.
Wysiaduj naczynie z jaj w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza do 23 godzin po zapłodnieniu. Jeśli zarodki są starsze niż 24 godziny po zapłodnieniu, za pomocą pipety przenieś zarodki do 200 mikromolowego PTU w pożywce zarodkowej, aby zapobiec melanogenezie. Pod mikroskopem stereoskopowym zdechorionuj niewyklute zarodki za pomocą ultracienkich kleszczy.
Używając polerowanych ogniowo pipet Pasteura, aby zminimalizować uszkodzenia, przenieś je na szklane lub plastikowe szalki Petriego pokryte 1-2% agarozą rozpuszczoną w pożywce zarodkowej. Następnie przenieś zarodki do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych za pomocą plastikowej lub polerowanej ogniowo pipety. Usunąć podłoże z zarodków za pomocą mikropipety.
Pozostaw tylko tyle płynu, aby przykryć zarodki. Utrwal zarodki w 4% PFA na jedną do dwóch godzin, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Następnie umyj zarodki trzy razy w 1X PBS i 1% PBTriton przez pięć minut.
Zarodki należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. W celu długotrwałego przechowywania należy odwodnić i przechowywać zarodki w 100% metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby ponownie nawodnić zarodki, należy wykonać seryjne inkubacje po pięć minut w temperaturze pokojowej ze zmniejszającymi się ilościami metanolu oraz PBS i PBTriton do końcowego płukania.
Kontynuuj przygotowanie zarodka zgodnie z rękopisem. Należy wybrać roztwór blokujący pasujący do drugorzędowych gatunków przeciwciał gospodarza, na przykład 10% surowicy koziej w PBTriton z lub bez dwóch miligramów na mililitr BSA. Dodaj 0,5 mililitra roztworu blokującego do probówki zawierającej zarodek i umieść probówkę na kołysce na jedną do trzech godzin w temperaturze pokojowej.
Następnie inkubuj zarodek w pierwotnym przeciwciałie rozcieńczonym w roztworze blokującym i PBTriton przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, kołysząc się. Rano umyj zarodek pięć razy w PBTriton przez 10 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania. Następnie wybierz przeciwciało drugorzędowe na podstawie gatunku gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego i żądanej długości fali przy 488 nanometrach.
Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym do probówki zawierającej zarodek. Przykryj probówkę folią aluminiową i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej podczas kołysania. Następnie umyj zarodki trzy razy w PBTriton przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej, przykryte folią aluminiową i kołysząc.
Za pomocą pipety przenieść zarodki do 50% roztworu glicerolu w PBS na łożu 2% agarozy w pożywce dla zarodków. Aby usunąć żółtko, przenieś 200 mikrolitrów 1X PBS na szkiełko wgłębieniowe lub zwykłe szkiełko podstawowe. Użyj plastikowej pipety do transferu, aby przenieść jeden lub więcej zarodków do kropli PBS.
Użyj ultracienkich kleszczyków i szpilek do owadów z podwójnym zerem, aby rozbić żółtko i bardzo delikatnie zeskrobać granulki żółtka z brzusznej powierzchni zarodka. Usuń granulki żółtka i w razie potrzeby uzupełnij PBS. Po zamontowaniu umieść próbkę na stoliku mikroskopu.
Zlokalizuj interesujący Cię obszar, wybierając stosunkowo jasny przykład. Dostosuj ekspozycję i wzmocnienie aparatu tak, aby sygnał był wystarczająco jasny bez nasycenia. Porównując eksperymentalne zarodki znakowane przeciwciałami i zarodki kontrolne z przeciwciałami, należy stosować te same ustawienia ekspozycji.
Ten protokół immunohistochemii całej góry jest cennym narzędziem do badania przestrzennej i czasowej ekspresji białek przy użyciu rozwoju danio pręgowanego. Podjednostka GluN1 receptora glutaminianu typu NMDA ujawniła ekspresję podjednostek receptora glutaminianu w rozwijających się mięśniach danio pręgowanego w 23 godziny po zapłodnieniu. Zamrożone skrawki zarodków po 72 godzinach od zapłodnienia umieszczono na szkiełkach i wybarwiono immunologicznie pod kątem fosfo-H3, markera proliferujących komórek.
W kilku komórkach stwierdzono ekspresję fosfo-H3, a ekspresja ta była najbardziej zauważalna w strefach komorowych. Mysie przeciwciało kontrolne IgG i wykluczające przeciwciała pierwszorzędowe wykazały niski poziom niespecyficznej ekspresji. Ważne jest, aby wybrać odpowiednie roztwory blokujące i przeciwciała drugorzędowe w oparciu o pierwszorzędowe przeciwciała gatunków gospodarza, aby zapewnić wykrywanie i zminimalizować niespecyficzne barwienie.
Immunohistochemia musi zostać zweryfikowana, aby upewnić się, że obserwowany sygnał jest rzeczywiście białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Eksperymenty uzupełniające zwykle obejmują wykorzystanie organizmów modyfikowanych genetycznie lub środowiskowo. Immunohistochemia daje naukowcom możliwość obserwacji białek in situ, co znacznie przyspiesza nasze zrozumienie wielu systemów zarówno w biologii podstawowej, jak i stosowanej, szczególnie podczas rozwoju zarodka.
Metanol i formaldehyd są toksyczne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Odpady muszą być zbierane i utylizowane zgodnie z procedurami instytucjonalnymi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do wykrywania białek za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał w całych preparatach zarodków i larw daniosa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Imunohistochemika
Tło
- Imunohistochemika całego preparatu to technika wizualizowania białek w tkankach.
- Umożliwia przestrzenne i czasowe obserwacje bez konieczności cięcia.
- Mikroskopia konfokalna może tworzyć trójwymiarowe reprezentacje wzorców białek.
- Ta metoda jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych i diagnostyce.
Cel badania
- Aby dostarczyć szczegółowy protokół wykrywania białek u daniosów.
- Aby ułatwić zrozumienie ekspresji białek w biologii rozwojowej.
- Aby zwiększyć możliwości badawcze w badaniu mechanizmów chorobowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zbiorników do tarła z wodą systemową.
- Zastosowanie oznaczonych przeciwciał do wykrywania białek.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wykonywania obrazów.
- Technika całego preparatu do obserwacji nietkankowych tkanek.
Główne wyniki
- Skuteczne uwidocznienie ekspresji białek w zarodkach i larwach daniosów.
- Wykazanie skuteczności immunohistochemii całego preparatu.
- Stworzenie trójwymiarowych obrazów lokalizacji białek.
- Wgląd w molekularne mechanizmy rozwoju.
Wnioski
- Protokół poprawia badania dynamiki białek w żywych organizmach.
- Służy jako cennym narzędziem dla badaczy w biologii rozwojowej.
- Imunohistochemika całego preparatu jest efektywną metodą analizy białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae enables direct spatial and temporal protein expression analysis in intact tissues, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides predictive confidence by allowing researchers to observe protein localization without sectioning artifacts, facilitating go/no-go decisions in therapeutic hypothesis interrogation. The method supports translational continuity from discovery through preclinical stages by generating reproducible, quantitative imaging data for pathway clarification and biological de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of protein expression patterns in developing zebrafish tissues.
- Operational Value: Supports biological de-risking by confirming target presence and localization in disease-relevant developmental systems.
- Predictive Value: Provides spatial and temporal data that aids in portfolio triage and mechanistic understanding of target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems suitable for downstream compound screening and target engagement studies.
- Quantitative Outputs: Generates fluorescence-based readouts compatible with confocal microscopy for standardized, reproducible protein detection.
- Platform Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for evaluating antibody specificity and signal-to-noise ratios across multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying developmental processes and molecular mechanisms underlying congenital disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining consistent protein detection methodologies across intact and sectioned tissues.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables early-stage validation of target expression patterns, reducing ambiguity in later-stage preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in zebrafish-based disease models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by enabling direct visualization of protein expression in intact embryos and larvae.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support assay standardization and compound evaluation readiness.
- Analytics: Provides spatial and temporal protein localization data that helps teams compare experimental and control conditions.
- Translational Research: Supports continuity from whole mount to sectioned tissue analysis, ensuring consistent detection strategies across developmental stages.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for antibody validation, target confirmation, and pathway analysis across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct protein observation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via optimized fixation, blocking, and antibody incubation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing clear spatial expression data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed expression in disease-relevant developmental systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, immunohistochemistry, and confocal microscopy.
- Dependent on access to fluorescence microscopes, agarose embedding materials, and antibody validation resources.
- Necessitates cross-team standardization of blocking solutions, antibody dilution protocols, and washing procedures.
- Involves adaptation considerations for different developmental stages, including PTU treatment for melanogenesis inhibition and glycerol-based mounting.
- Limited by the need for species-specific antibody validation and optimization of blocking agents to minimize non-specific staining.
