Name: Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek RNAi do identyfikacji regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych z wykorzystaniem reportera opartego na podwójnej lucyferazie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Emily Norton i Mikaelanowi Cucciarre-Stuligrossowi za pomoc w przygotowaniu wektorów shRNA. Praca ta została częściowo wsparta grantem Susan G. Komen Career Catalyst Grant, który został przyznany J.M.L. (#CCR17477184).

UWAGA: Schematyczne podsumowanie tego protokołu jest pokazane w Rysunek 1.
1. Przygotowanie biblioteki wektorów lentiwirusowych
UWAGA: Na zademonstrowanym ekranie użyto biblioteki shRNA zakupionej jako zapasy glicerolu na 96-dołkowych płytkach, ale biblioteki mogą być również tworzone ręcznie na podstawie listy kandydatów. Odpowiednie formanty powinny być brane pod uwagę i uwzględniane w każdej bibliotece. Obejmuje to kontrolne shRNA nieukierunkowane (shNTC), kontrolne shRNA ukierunkowane na badany czynnik transkrypcyjny oraz, jeśli to możliwe, shRNA ukierunkowane na lucyferazę świetlika.
<ol>
	<li>Dodaj 1,3 ml bulionu Luria (LB) (1% bakto-tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl, pH 7,5) zawierającego 100 μg/ml ampicyliny do każdego dołka 96-dołkowej płytki głębinowej. Zaszczepić każdą studzienkę 2 μl glicerolu i rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc, stale mieszając przy 225 obr./min.</li>
	<li>Przenieść każdą kulturę bakteryjną do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i osadzać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Oczyść każdy wektor za pomocą bakteryjnego zestawu do mini-przygotowania, postępując zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Określ stężenie każdego wektora za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Przechowywać plazmidy w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
</ol>
2. Pakowanie biblioteki lentiwirusowej z tablicą
UWAGA: Wszystkie prace związane z lentiwirusem, w tym pakowanie, infekcja i późniejsza hodowla zainfekowanych komórek, powinny ściśle przestrzegać zasad i przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Namnażanie komórek 293FT za pomocą kompletnych pożywek wzrostowych (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 4 mM L-glutaminę, 4500 mg / L glukozy i pirogronian sodu, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostek / ml penicyliny, 100 μg / ml antybiotyku streptomycyny i 2 mM L-glutaminy).</li>
	<li>Dla każdego wektora w bibliotece z kroku 1.4 zasiej jeden 24-dołkowy z komórkami 1 x 105 293FT. 
	UWAGA: Zaleca się, aby przed przejściem do kroku 3 zapakować kilka dodatkowych studzienek kontrolnego wektora wirusowego i użyć ich do zbadania miana wirusa (patrz poniżej).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny 
	UWAGA: Ogólny protokół pakowania lentiwirusa, który został opisany wcześniej14 został zmniejszony do 24 dołków dla tego protokołu. Wykorzystuje psPAX2 do pakowania lentiwirusa i VSVG jako białko płaszcza. Jeśli pożądany jest wirus ektropiczny, zamiast VSVG można użyć wektora dostarczającego Eco. Zdecydowanie zaleca się, aby ten protokół był zoptymalizowany w celu osiągnięcia miana wirusa, które daje od 30% do 70% skuteczności infekcji komórek docelowych (patrz Dyskusja). Tabela uzupełniająca 1 zawiera listę wszystkich użytych wektorów.</li>
	<li>Skonfiguruj mieszaninę transfekcyjną dla każdego wektora wirusowego z kroku 1.4, jak opisano poniżej. Każda transfekcja powinna zawierać 250 ng wektora wirusowego, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 μl odczynnika do transfekcji 1 i 23,75 μl buforu transfekcyjnego (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć każdy wektor lentiwirusowy do 50 ng / μl wodą wolną od nukleaz, a następnie przenieść 5 μl (250 ng) do dołka z 96-dołkową płytką PCR.</li>
		<li>Przygotować super mieszankę do transfekcji, mieszając 1,25 μl * X odczynnika do transfekcji 1 i 23,75 μl * X wstępnie podgrzanego buforu do transfekcji, gdzie "X" oznacza całkowitą liczbę transfekcji plus kilka dodatkowych w celu uwzględnienia utraty objętości podczas pipetowania.</li>
		<li>Inkubować super mieszankę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Dodaj 125 ng * X psPAX2 i 125 ng * X VSVG do probówki transfekcji super mix z kroku 2.4.3 i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Szybko przejdź do kroku 2.4.5.</li>
		<li>Natychmiast podwielokrotnić mieszaninę z kroku 2.4.4 do każdej probówki paska PCR, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 25 μl mieszaniny do każdej studzienki zawierającej wektor wirusowy z kroku 2.4.1.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Przenieść wszystkie 30 μl z każdego 96-dołkowego z kroku 2.4.6 do dołka z 24-dołkowym zawierającym 293 komórki FT z kroku 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny, a następnie zastąpić pożywkę w każdym dołku 24-dołkowej płytki 500 μl świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej zebrać supernatant wirusa z każdej studzienki i podać 220 μl (wystarcza na 1 infekcję w kroku 3 plus trochę dodatkowej objętości) do dwóch 96 dołków każdy. Są to ułożone w układ wirusowe płytki supernatantowe.</li>
	<li>Przechowywać ułożone w układ płytki supernatantu wirusowego w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zaleca się również przetestowanie części dodatkowego wirusa kontrolnego, który został umieszczony (patrz wyżej) na komórkach, które mają być zakażone, przed przejściem do Kroku 3. Ma to na celu zapewnienie, że miano jest wystarczające do osiągnięcia co najmniej 30% skuteczności infekcji.</li>
</ol>
3. Infekcja komórek na ekranie
UWAGA: Ludzkie komórki czerniaka (A375) zostały użyte do zademonstrowania tego podejścia, ale ta metoda może być zastosowana do wszystkich przylegających komórek, które infekują lentiwirusem. Jednak warunki hodowli komórkowej i posiewu powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej (patrz Dyskusja).
<ol>
	<li>Rozwiń komórki, które mają zostać zainfekowane, w kompletnej pożywce wzrostowej.</li>
	<li>Wysiewaj 24-dołkowe płytki z 1 x 105 komórek w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej na dołek. Wysiew jedną studzienkę dla każdego wektora wirusowego, który ma być badany (w tym kontrole) i dołącz dodatkową studzienkę, która nie zostanie zainfekowana, która posłuży jako kontrola przy wyborze leku w kroku 3.7.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Zainfekować każdą studzienkę z kroku 3.2 innym supernatantem wirusowym z zamrożonego supernatantu lentiwirusowego w układzie w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową, która zawiera 20 μg/ml polibrenu.</li>
		<li>Rozmrozić supernatanty biblioteki lentiwirusowej z krokiem 2.7 do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Odessać pożywkę wzrostową z 24-dołkowych płytek z kroku 3.2 i natychmiast dodać 200 μl pożywki wzrostowej zawierającej polibren do każdej studzienki.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 200 μl supernatantu wirusa z każdego 96-dołkowego z kroku 3.4.2 do 24 dołków z kroku 3.4.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 - 48 h. 
	UWAGA: Niektóre linie komórkowe mogą potrzebować więcej niż 24 godziny, aby wyrazić shRNA i stać się odpornymi na puromycynę. Zastosowany tutaj wektor wirusowy dostarcza Turbo-GFP-IRES-puroR z shRNA opartym na miR30 w 3'UTR puroR (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Skuteczność infekcji i ekspresję genu oporności na puromycynę oraz shRNA monitorowano za pomocą białka zielonej fluorescencji.</li>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową, która zawiera 2,5 μg/ml puromycyny. 
	UWAGA: Stężenie selekcyjne puromycyny różni się w zależności od linii komórkowych. Zaleca się wykonanie krzywej zabijania antybiotyków dla każdej linii komórkowej, która ma być oznaczona przed badaniem przesiewowym.</li>
	<li>Odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej puromycynę. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby dodać puromycynę do kontrolnej studni niezainfekowanej, którą można wykorzystać w kolejnych krokach, aby upewnić się, że wybór puromycyny jest kompletny.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 h. 
	UWAGA: Najlepiej jest wybierać przez 48 godzin, więc gęstość posiewu i miano wirusa powinny być zoptymalizowane tak, aby komórki nie były nadmiernie zlewające się przed 48 godzinami.</li>
	<li>Upewnij się, że zainfekowane komórki są zielone pod mikroskopem fluorescencyjnym i że komórki w grupie kontrolnej niezakażonej, dobrze potraktowanej puromycyną, są martwe przed przejściem do Kroku 4.</li>
</ol>
4. Komórki wysiewające do transfekcji reportera podwójnej lucyferazy
UWAGA: Należy przeprowadzić próbną transfekcję, aby określić optymalną gęstość wysiewu dla każdej nowej linii komórkowej.
<ol>
	<li>Trypsynizuj każdą studzienkę z kroku 3.9 i przenieś około 1 x 105 komórek do studzienek w odpowiednim miejscu na nowej 24-dołkowej płytce w następujący sposób. 
	UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony do badań przesiewowych bibliotek z setkami shRNA, więc nie jest możliwe policzenie każdej studni zainfekowanych komórek. W związku z tym poniższe kroki zostały wykorzystane do oszacowania liczby komórek w każdym dołku, aby zapewnić mniej więcej równą gęstość posiewu.
	<ol>
		<li>Pogrupuj studzienki z kroku 3.9 w 3-4 grupy, tak aby wszystkie studzienki w grupie miały podobną gęstość komórek.</li>
		<li>Trypsynizować 1 przedstawiciela z każdej grupy za pomocą 200 μl trypsyny-EDTA (1x PBS uzupełniony 0,5 mM EDTA i 0,1% trypsyny) przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zneutralizuj trypsynę-EDTA, dodając 400 μl puromycyny zawierającej kompletną pożywkę wzrostową.</li>
		<li>Policz każdą studzienkę reprezentatywną, aby określić całkowitą liczbę komórek i rozcieńczyć zawiesinę komórek z każdej studzienki reprezentatywnej do 2 x 105 komórek/ml przy użyciu kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Zasiać 0,5 ml (1 x 105 komórek) z każdej studzienki z etapu 4.1.3 do odpowiedniej pozycji na nowej 24-dołkowej płytce i inkubować tę nową 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
		<li>Dla każdej grupy z kroku 4.1.1 należy użyć całkowitej liczby komórek określonej w kroku 4.1.3, aby obliczyć objętość trypsyny-EDTA, którą należy dodać do każdej studzienki, tak aby wynikowa zawiesina komórek wynosiła 1 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Dodać odpowiednią objętość trypsyny-EDTA do każdego dołka i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: W przypadku większego ekranu zaleca się, aby płytki 24-dołkowe były trypsynizowane i ponownie powlekane w grupach, a nie wszystkie naraz, aby zapewnić żywotność komórek.</li>
		<li>Podczas powyższej inkubacji użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 400 μl kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej puromycynę do odpowiednich studzienek na nowej 24-dołkowej płytce.</li>
		<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórek (około 1 x 105 komórek) z każdej studzienki do odpowiedniego miejsca na nowych 24-dołkowych płytkach przygotowanych w kroku 4.1.7.</li>
		<li>Powtórz kroki od 4.1.6 do 4.1.8 dla wszystkich płyt zgrupowanych studzienek z kroku 4.1.1, po jednej płytce na raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
5. Transfekcja reportera podwójnej lucyferazy
<ol>
	<li>Transfekcja każdej studzienki z kroku 4.2 za pomocą reportera podwójnej lucyferazy tworzy się w następujący sposób. 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem tego testu należy określić całkowitą ilość DNA i optymalny stosunek wektora reporterowego lucyferazy świetlika do wektora kontrolnego lucyferazy Renilla. W tym przypadku użyto 400 ng mieszaniny DNA, która zawiera 20 części reportera lucyferazy świetlika i 1 część kontrolnej lucyferazy Renilla.
	<ol>
		<li>Mieszaninę rozcieńczającą do transfekcji (probówka A) i mieszaninę rozcieńczającą reporterową (probówka B) należy sporządzić mieszając wskazane objętości każdego odczynnika (tabela 1) przez całkowitą liczbę transfekcji (plus kilka dodatkowych). 
		UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem odczynnika do transfekcji 2 (patrz Tabela materiałów). Jeśli używany jest inny odczynnik do transfekcji, transfekcja powinna być zoptymalizowana przed tym krokiem.</li>
		<li>Mieszaninę rozcieńczającą do transfekcji (probówka A) zmieszać z mieszaniną rozcieńczającą reporterową (probówka B) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w celu uzyskania mieszaniny do transfekcji.</li>
		<li>Podczas powyższej inkubacji przepłukać każdą 24-studzienkę z etapu 4.2 0,25 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i dodać 447 μl kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki.</li>
		<li>Po 15 minutowej inkubacji za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 53 μl mieszanki transfekcyjnej do każdego dołka z 24-dołkowych płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja aktywności podwójnej lucyferazy
<ol>
	<li>Zmierz aktywność lucyferazy za pomocą czytnika płytek i zestawu do testowania reporterowego z podwójnym lucyferazy, jak opisano poniżej. 
	UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem wskazanego zestawu do oznaczania reporterowego (patrz Tabela materiałów) i jest zgodny z protokołem zalecanym przez producenta.
	<ol>
		<li>Przygotuj wystarczającą ilość 1x pasywnego buforu do lizy dla wszystkich studzienek plus kilka dodatkowych (potrzeba 75 μl na studzienkę), rozcieńczając 5x pasywny bufor do lizy (dostarczony w zestawie) od 1 do 5 wodą dejonizowaną. Rozmrozić również odczynnik A i bufor odczynnika B (dostarczone w zestawie, 100 μl każdego z nich jest potrzebne do każdej studzienki).</li>
		<li>Odessać pożywkę z każdej studzienki płytki 24-dołkowej z kroku 5.2.</li>
		<li>Dodaj 75 μl 1x pasywnego buforu do lizy do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, od czasu do czasu wstrząsając.</li>
		<li>Przygotować odczynnik B, rozcieńczając 50x substrat odczynnika B (dostarczony w zestawie) w stosunku 1:50 z rozmrożonym buforem odczynnika B.</li>
		<li>Dodać 30 μl 1x pasywnego buforu do lizy do 4 dołków w celu wygaszenia (patrz Tabela uzupełniająca 2).</li>
		<li>Przenieść 30 μl lizatu z etapu 6.1.3 do zduplikowanych studzienek 96-dołkowej białej płytki do oznaczania z płaskim dnem.</li>
		<li>Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 50 μl odczynnika A do każdej studzienki i odczytać sygnał lucyferazy świetlika za pomocą czytnika płytek.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl odczynnika B z kroku 6.1.4 do każdej studzienki i odczytać sygnał lucyferazy Renilla za pomocą czytnika płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzaj nieprzetworzone dane w następujący sposób (szczegółowy opis znajduje się w tabeli uzupełniającej 2).
	<ol>
		<li>Wyklucz próbki z bardzo niskim sygnałem lucyferazy Renilla, ponieważ niskie wartości wskazują, że konstrukt wirusa był toksyczny lub że oznaczono zbyt mało transfekowanych komórek. 
		UWAGA: Jak wyjaśniono w Dyskusji, znacznie "niski" sygnał lucyferazy Renilla może skutkować nietypowymi wynikami. W tym przypadku wykluczono studzienki, w których sygnał lucyferazy Renilla był większy niż 1 odchylenie standardowe poniżej średniej (patrz Tabela Uzupełniająca 2). Zostało to oparte na wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przy użyciu tego systemu reporterowego w tych komórkach14, ale może się różnić w innych liniach komórkowych.</li>
		<li>Znormalizuj wartość surowej lucyferazy świetlika w każdym dołku do surowej wartości lucyferazy Renilla w tym samym dołku, aby uzyskać stosunek świetlika/Renilli.</li>
		<li>Uśrednij stosunek świetlików/Renilla wszystkich powtórzonych studzienek kontrolnych, a następnie podziel stosunek świetlików/Renilla w każdym innym studzience przez tę liczbę, aby uzyskać zmianę krotności.</li>
		<li>Przypisz próbkę kontrolną i ustaw jej wartość stosunku świetlika/Renilli na 1.</li>
		<li>Uśrednić stosunek świetlika/Renilla zduplikowanych studni i wykreślić go z odchyleniem standardowym. 
		UWAGA: Odchylenie standardowe nie jest wykorzystywane do analizy statystycznej, ale jako środek do identyfikacji odwiertów, w których kontrpróby znacznie się różnią.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu demonstrujemy podejście do średnioprzepustowych badań przesiewowych macierzowych bibliotek wirusowych w połączeniu z testem reporterowym opartym na podwójnej lucyferazy, który można wykorzystać do identyfikacji i testowania nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych. Bardzo ważne jest, aby scharakteryzować i zoptymalizować system reporterowy dla każdej linii komórkowej przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek badania. Należy przeprowadzić doświadczenia w celu potwierdzenia, że osoba zgłaszająca reaguje na z...

Celem tego testu jest wykorzystanie bibliotek wirusowych do identyfikacji regulatorów czynników transkrypcyjnych w stosunkowo szybki i tani sposób. Nieprawidłowa aktywność transkrypcyjna jest związana z rakiem i przerzutami1,2,3,4,5,6, więc ukierunkowanie na czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych jest obiecującym podejściem terapeutycznym. Jednak czynniki transkrypcyjne są często trudne do farmakologicznego ukierunkowania7, a wiele z nich jest wymaganych do prawidłowego funkcjonowania komórek w tkankach dorosłych8,9,10. Celowanie w szlaki związane z rakiem, które nieprawidłowo aktywują czynniki transkrypcyjne w celu napędzania choroby, jest bardziej wykonalnym podejściem, które może mieć mniej poważne skutki uboczne. Komercyjna dostępność matrycowych lentiwirusowych i retrowirusowych RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA lub bibliotek ORF pozwala naukowcom przetestować znaczenie wielu genów w jednym eksperymencie. Wymagany jest jednak wiarygodny odczyt zmienionej aktywności transkrypcyjnej.
Tutaj opisujemy użycie testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazy transkrypcyjnej i uporządkowanych bibliotek lentiwirusowych do identyfikacji białek, które regulują czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych. W tym teście shRNA, które celują w geny związane z rakiem, są dostarczane do komórek raka ssaków poprzez transdukcję lentiwirusową, a komórki są selekcjonowane do stabilnej integracji za pomocą puromycyny. Komórki są następnie transfekowane konstruktem reporterowym, który wyraża lucyferazy świetlika napędzanej przez promotor specyficzny dla badanego czynnika transkrypcyjnego oraz konstruktem kontrolnym, który wyraża lucyferazy Renilla z konstytutywnie aktywnego promotora, który nie reaguje na badany czynnik transkrypcyjny. Demonstrujemy to podejście za pomocą ekranu potwierdzającego słuszność koncepcji dla regulatorów YAP i TAZ, krytycznych efektorów dalszych szlaków Hippo pathway8,10,11. Nieprawidłowa aktywność YAP i TAZ sprzyja kilku etapom kaskady przerzutów11 i jest obserwowana w wielu nowotworach11,12,13. Jednak sposób, w jaki YAP i TAZ stają się nieprawidłowo aktywowane w niektórych komórkach nowotworowych, nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. YAP i TAZ nie wiążą DNA, ale zamiast tego są rekrutowane do promotorów przez inne czynniki transkrypcyjne. Czynniki transkrypcyjne należące do rodziny domen TEA (TEAD) są głównymi partnerami wiążącymi YAP i TAZ oraz mają kluczowe znaczenie dla większości funkcji zależnych od YAP i TAZ. Nasz konstrukt reporterowy wyraża lucyferazy świetlika z promotora reagującego na YAP/TAZ-TEAD, a poprzednie badania wykazały, że wiernie wykrywa zmiany w aktywności transkrypcyjnej YAP-TEAD i TAZ-TEAD2,14,15.
Nasze podejście jest szybkie, o średniej przepustowości i nie wymaga urządzeń do selekcji, zautomatyzowanych robotów ani głębokiego sekwencjonowania bibliotek w puli. Koszty są stosunkowo niskie, a do wyboru jest wiele komercyjnie dostępnych bibliotek. Wymagany sprzęt i odczynniki są również stosunkowo standardowe w większości laboratoriów. Może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem regulatorów praktycznie każdego czynnika transkrypcyjnego, jeśli istnieje lub jest generowany reporter oparty na lucyferazy. Używamy tego podejścia do badań przesiewowych shRNA w komórkach nowotworowych, ale każda linia komórkowa, która może być transfekowana z rozsądną wydajnością, może być używana z dowolnym typem biblioteki macierzowej.

<table><tbody><tr><td>2,0 ml 96-dołkowa głęboka płytka polipropylenowa</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td>Do mikro-preparatu bakteryjnego</td></tr><tr><td>Trypsyna - 2,50%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Składnik trypsyny-EDTA</td></tr><tr><td>96-dołkowa biała płytka testowa z płaskim dnem</td><td>Corning</td><td>3922</td><td>Do testu podwójnej lucyferazy</td></tr><tr><td>Ampicylina - 100 mg / ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-10835242001-EA</td><td>Do mini-preparatu bakteryjnego</td></tr><tr><td>Bactoo-trypton - proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td>Składnik bulionu LB</td></tr><tr><td>System testów reporterowych z podwójną lucyferazy, który obejmuje odczynnik LAR II (odczynnik A), Stop & Glo substrate (substrat odczynnika B) oraz Stop & Bufor Glo (bufor odczynnika B) - Zestaw</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Do testu podwójnej lucyferazy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej - 9,6 g/L</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>Dla PBS</td></tr><tr><td>EDTA - 0,5 M</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Składnik etanolu trypsyna-EDTA</td></tr><tr><td>- 100%</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td>Do mini-preparatu bakteryjnego</td></tr><tr><td>Płod Surowica bydlęca - 100%</td> <td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Składnik kompletnych pożywek wzrostowych</td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny (Polybrene) - 8 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Na infekcję wirusową</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/Wysoka glukoza - 4 mM L-glutamina; 4500 mg/L glukozy; pirogronian sodu</td><td>GE Healthcare nauki przyrodnicze</td><td>SH30243.01</td><td>Składnik kompletnej pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Do testu podwójnej lucyferazy</td>L-Glutamina - 200 mM Gibco 25030-081 Składnik kompletnej pożywki wzrostowej Lipofectamine 3000 (odczynnik do transfekcji 2) - 100%Life technologies L3000008 Do transfekcji Biologia molekularna Woda - 100%VWR 02-0201-0500 Do rozcieńczania wektora shRNA do pakowania wirusów NaCl - proszek <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>Składnik bulionu LB</td></tr><tr><td>NanoDrop One Mikroobjętość Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Do pomiaru stężenia DNA wektora</td></tr><tr><td>Opti-MEM (bufor transfekcyjny) - 100%</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Do transfekcji</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna - 10 000 jednostek/ml (penicylina); 10 000 i mikro; g/ml (Streptomycyna)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Składnik kompletnej pożywki</td></tr><tr><td>hodowlanej PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K210010</td><td>Do minipreparatu bakteryjnego</td></tr><tr><td>Puromycyna - 2,5 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Do selekcji antybiotyków po infekcji</td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DNA X-tremeGENE 9 (Odczynnik do transfekcji 1) - 100%</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Do pakowania wirusów</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy - proszek</td><td>VWR</td><td>J850</td><td>Składnik bulionu LB</td></tr><tr><td>P3000 (odczynnik do transfekcji 3) - 100%</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Do transfekcji</td></tr></tbody></table>

identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Czynniki transkrypcyjne mogą zmieniać ekspresję wielu genów docelowych, które wpływają na różne dalsze procesy, co czyni je dobrymi celami dla terapii przeciwnowotworowych. Jednak bezpośrednie ukierunkowanie na czynniki transkrypcyjne jest często trudne i może powodować niepożądane skutki uboczne, jeśli czynnik transkrypcyjny jest niezbędny w jednej lub więcej dorosłych tkanek. Identyfikacja wcześniejszych regulatorów, które nieprawidłowo aktywują czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych, stanowi bardziej realną alternatywę, zwłaszcza jeśli białka te są łatwe do wyleczenia. W tym miejscu opisujemy protokół, który można wykorzystać do połączenia macierzowanych bibliotek lentiwirusowych na średnią skalę i testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazy w celu zidentyfikowania nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych. Nasze podejście oferuje szybki, łatwy i niedrogi sposób na przetestowanie setek genów w jednym eksperymencie. Aby zademonstrować zastosowanie tego podejścia, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe macierzowanej biblioteki RNAi lentiwirusa zawierającej kilka regulatorów białka związanego z Tak (YAP) i koaktywatora transkrypcji z motywem wiążącym PDZ (TAZ), dwóch koaktywatorów transkrypcji, które są dalszymi efektorami szlaku Hippo. Jednak podejście to można zmodyfikować w celu wykrycia regulatorów praktycznie dowolnego czynnika transkrypcyjnego lub kofaktora, a także można je wykorzystać do badań przesiewowych bibliotek CRISPR/CAS9, cDNA lub ORF.

Nasz konstrukt reporterowy YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) zawiera minimalny promotor SV-49 z 5 powtórzeniami kanonicznego elementu wiążącego TEAD (MCAT)15 sterującego ekspresją genu lucyferazy świetlikowej (Rycyna 1). Jest on współtransfekowany do komórek wraz z wektorem kontrolnym PRL-TK (Promega), który wykazuje ekspresję lucyfera...

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych bibliotek testów lentiwirusowych lub retrowirusowych w celu identyfikacji nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, średnio przepustowa i niedroga oraz że wykorzystuje sprzęt i odczynniki powszechnie dostępne dla większości badaczy. Aby rozszerzyć i oczyścić każdy wektor lentiwirusowy w bibliotece, najpierw dodaj 1,3 mililitra bulionu Luria uzupełnionego 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki głębokiej.Zaszczepić każdą studzienkę dwoma mikrolitrami glicerolu do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obrotów na minutę. Następnego dnia przenieś każdą kulturę bakterii do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych do odwirowania. Oczyść każdy wektor za pomocą odpowiedniego zestawu do miniprepu bakteryjnego zgodnie z instrukcjami producenta.Dla każdego wektora w przygotowanej bibliotece zasiej jedną studzienkę 24-dołkowej płytki z jednym razy 10 do piątych komórek 293FT i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Aby przygotować

identification-transcription-factor-regulators-using-medium

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Tutaj opisujemy metodologię przeprowadzania ukierunkowanego badania przesiewowego "ubikwitom" siRNA w celu zidentyfikowania nowych regulatorów ubikwityny i podobnych do ubikwityny odpowiedzi komórkowej na niedotlenienie, w której pośredniczy HIF1A. Można to dostosować do dowolnej ścieżki biologicznej, gdzie dostępny jest solidny odczyt aktywności reporterowej.

Badania przesiewowe siRNA w celu identyfikacji ubikwityny i regulatorów systemów podobnych do ubikwityny szlaków biologicznych w hodowanych komórkach ssaków

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Tutaj proponujemy strategię badania wpływu interesującego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA, korzystając z publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości z macierzy mikroRNA po transfekcji komórek z małą spinką do włosów (sh)RNA ukierunkowaną na interesujący czynnik transkrypcyjny.

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Opracowaliśmy metodę skutecznego usuwania, przetwarzania, cięcia i barwienia, w celu oceny histopatologicznej, tkanki sutka, która pierwotnie była utrwalona na szkiełkach jako całe wierzchowce. Metoda ta może sprzyjać gromadzeniu i ocenie całych wierzchowców gruczołu mlekowego w badaniach wytycznych dotyczących badań reprodukcyjnych i rozwojowych.

Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Poznaj metodę średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek RNAi do identyfikacji regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych z wykorzystaniem reportera opartego na podwójnej lucyferazie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Przeglądaj więcej filmów