Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie
March 27th, 2020
Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.
Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych bibliotek testów lentiwirusowych lub retrowirusowych w celu identyfikacji nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, średnio przepustowa i niedroga oraz że wykorzystuje sprzęt i odczynniki powszechnie dostępne dla większości badaczy. Aby rozszerzyć i oczyścić każdy wektor lentiwirusowy w bibliotece, najpierw dodaj 1,3 mililitra bulionu Luria uzupełnionego 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki głębokiej.
Zaszczepić każdą studzienkę dwoma mikrolitrami glicerolu do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obrotów na minutę. Następnego dnia przenieś każdą kulturę bakterii do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych do odwirowania. Oczyść każdy wektor za pomocą odpowiedniego zestawu do miniprepu bakteryjnego zgodnie z instrukcjami producenta.
Dla każdego wektora w przygotowanej bibliotece zasiej jedną studzienkę 24-dołkowej płytki z jednym razy 10 do piątych komórek 293FT i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną, która zostanie ustawiona dla każdego wektora w bibliotece, najpierw eluuj każdy wektor lentiwirusowy do końcowego stężenia 50 nanogramów na mikrolitr wodą wolną od nukleaz. Przenieść pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki PCR.
Wykonaj super mieszankę transfekcji, mieszając 1,25 mikrolitra razy x odczynnika do transfekcji jeden z 23,75 mikrolitra razy x wstępnie podgrzanego buforu do transfekcji. Inkubować super mieszankę transfekcji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 125 nanogramów razy x psPAX2 i 125 nanogramów razy x VSVG do super mieszanki, delikatnie pipetując.
Natychmiast podwielokrotność super mieszanki do każdej probówki paska PCR i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 25 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki rozcieńczonego wektora wirusowego. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 30 mikrolitrów każdej mieszaniny transfekcyjnej z każdej studzienki do odpowiedniego dołka składającego się z komórek o długości 293 stóp stopy na uprzednio przygotowanej płytce 24-dołkowej. Inkubować komórki przez 24 godziny przed zastąpieniem pożywki w każdym dołku 500 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej na kolejną 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Następnego dnia użyj pipety wielokanałowej, aby zebrać supernatant wirusa z każdej studzienki i podamuluj 220 mikrolitrów każdego supernatantu do dwóch dołków na nowej 96-dołkowej płytce, aby wygenerować ułożoną płytkę supernatantu wirusowego. Aby przygotować komórki A375 do infekcji, należy wysiać od jednej do 10 do piątej komórki na 24-dołkowej płytce w 0,5 mililitra kompletnej pożywki wzrostowej na dołek dla każdego wektora wirusowego w bibliotece. Dołącz dodatkową studzienkę, która nie zostanie zainfekowana, aby służyła jako kontrola przy wyborze leków.
Po 24-godzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych rozmrozić zamrożony supernatant lentiwirusowy ustawiony na temperaturę pokojową przed zastąpieniem pożywki wzrostowej z każdej studzienki przygotowanej płytki do hodowli komórkowej 200 mikrolitrami pożywki wzrostowej uzupełnionej 20 mikrogramami na mililitr polibrenu. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 200 mikrolitrów supernatantu wirusowego z każdego 96 dołków do każdego dołka 24-dołkowej. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 48 godzin.
Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę w każdym dołku 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej uzupełnionej puromycyną i włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 48 godzin. Po 48-godzinnej selekcji puromycyny posortuj komórki na trzy lub cztery grupy, tak aby wszystkie studzienki w jednej grupie miały podobną gęstość komórek i dodaj 200 mikrolitrów trypsyny-EDTA do jednego dołka reprezentatywnego z każdej grupy na pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę za pomocą 400 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej puromycyną i policz liczbę komórek z każdej trypsynizowanej studni.
Rozcieńczyć każdą zawiesinę komórkową do stężenia dwa razy 10 do piątego na mililitr pożywką wzrostową uzupełnioną puromycyną i zasiać 500 mikrolitrów komórek z każdej studzienki w tej samej pozycji dołka na nowej 24-dołkowej płytce. Po wykorzystaniu liczb z każdej reprezentatywnej studzienki do oszacowania liczby komórek w każdym pozostałym studzienku w każdej grupie, dodaj odpowiednią objętość trypsyny-EDTA do każdej studzienki, aby osiągnąć stężenie od jednego razy 10 do szóstego komórek na mililitr. Podczas trypsynizacji użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 400 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej puromycyną do odpowiednich dołków w nowej 24-dołkowej płytce.
Po odłączeniu komórek delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki i przenieś 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórek do odpowiedniego odpowiedniego dołka w nowej 24-dołkowej płytce. Następnie należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Aby transfekować komórki konstruktami reporterowymi podwójnej lucyferazy, należy przygotować mieszaninę rozcieńczania transfekcji, jak wskazano w tabeli.
Aby przygotować mieszaninę rozcieńczania reporterowego, należy wymieszać objętości każdego odczynnika pomnożone przez całkowitą liczbę transfekcji plus kilka dodatkowych objętości. Następnie wymieszać mieszaninę rozcieńczającą transfekcję z mieszaniną rozcieńczania reporterowego i inkubować otrzymany roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby uzyskać mieszaninę transfekcji. Podczas inkubacji przepłukać każdą studzienkę płytki do hodowli komórkowej 250 mikrolitrami PBS i dodać 447 mikrolitrów świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
Następnie za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadź 53 mikrolitry mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki płytki do hodowli komórkowej. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. Aby zmierzyć aktywność lucyferazy, rozcieńczyć 5X pasywny bufor do lizy z zestawu aktywności lucyferazy w rozcieńczeniu od jednego do pięciu wodą dejonizowaną i rozmrozić niezbędne objętości odczynnika A i buforu odczynnika B z zestawu.
Gdy odczynniki są gotowe, zastąpić supernatant w każdym dołku 75 mikrolitrami pasywnego buforu do lizy i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Podczas inkubacji rozcieńczyć 50-krotny substrat odczynnika B z zestawu do stężenia 1 do 50 za pomocą rozmrożonego buforu odczynnika B. Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów pasywnego buforu do lizy do czterech ślepych studzienek kontrolnych i przenieść 30 mikrolitrów lizatu z każdej studzienki do zduplikowanych studzienek 96-dołkowej białej płytki do oznaczania z płaskim dnem.
Gdy cały lizat zostanie platerowany, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 50 mikrolitrów odczynnika A do każdej studzienki i odczytać sygnał lucyferazy świetlika za pomocą czytnika płytek. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów odczynnika B do każdej studzienki i odczytaj sygnał lucyferazy Renilla za pomocą czytnika płytek. Zgodnie z oczekiwaniami, YAP2SA zwiększa aktywność lucyferazy świetlika, ale nie aktywność lucyferazy Renilla w porównaniu z wektorem kontrolnym.
W przeciwieństwie do tego, YAP2SA S94A nie zwiększa aktywności lucyferazy świetlików. Co ważne, YAP2SA nie zmienia aktywności minimalnego konstruktu promotorowego, który nie ma elementów wiążących MCAT TEAD. W komórkach transfekowanych konstruktem reporterowym YAP-TAZ-TEAD tandemowe krótkie spinki do włosów YAP i TAZ znacznie obniżyły poziom lucyferazy świetlika, ale kontrolna kontrola krótkiej spinki do włosów bez celowania nie.
W przeciwieństwie do tego, w komórkach transfekowanych minimalnym konstruktem reporterowym, krótki RNA spinki do włosów YAP-TAZ nie zmienia znacząco poziomów lucyferazy świetlika. Sygnał Renilla w każdym dołku nie jest również znacząco zmieniony przez kontrolę krótkiej spinki do włosów bez celowania lub RNA krótkiej spinki do włosów YAP-TAZ. Zgodnie z oczekiwaniami, krótkie RNA spinki do włosów ukierunkowane na kinazę YAP i TAZ, SARC lub PI3 znacznie zmniejszają aktywność YAP-TAZ-TEAD.
Krótkie spinki do włosów RNA ukierunkowane na ATM, CDH1, CSK, ERBB2 i żelsolinę zwiększały znormalizowane poziomy lucyferazy świetlika, zgodnie z opublikowanymi badaniami wykazującymi, że białka te były YAP i / lub TAZ. Pomimo ustalonych ról ATR, CCNE2 i ERBB4 w innych typach komórek, krótkie RNA spinki do włosów ukierunkowane na te geny nie zmieniają znacząco znormalizowanych poziomów lucyferazy świetlika w komórkach A375. Po tym ekranie należy zweryfikować identyfikację regulatorów przy użyciu innych odczytów pod kątem ich aktywności czynnika transkrypcyjnego.
Należy również potwierdzić skuteczne knockdown zidentyfikowanego regulatora za pomocą testu. Należy pamiętać o zachowaniu ostrożności i przestrzeganiu wytycznych bezpieczeństwa podczas pracy z zakaźnymi lentiwirusami, zwłaszcza jeśli wirusy są zakaźne dla ludzi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę do selekcjonowania ułożonych bibliotek lentiwirusowych lub retrowirusowych RNAi w celu znalezienia nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach rakowych. Jest to szybka, średnio przepustowa i ekonomiczna technika wykorzystująca powszechnie dostępne sprzęt i odczynniki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Regulacja transkrypcji
Tło
- Czynniki transkrypcyjne odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów.
- Identyfikacja ich regulatorów może dać wgląd w biologię raka.
- Interferencja RNA (RNAi) jest potężnym narzędziem do wyciszania genów.
- Selekcjonowanie dużych bibliotek może przyspieszyć odkrycie nowych regulatorów.
Cel badania
- Opracowanie metody selekcjonowania regulatorów czynników transkrypcyjnych.
- Wykorzystanie podwójnego testu luciferase do badań transkrypcyjnych.
- Zapewnienie niedrogiego rozwiązania dla naukowców.
Stosowane metody
- Przygotowanie lentiwirusowych lub retrowirusowych bibliotek RNAi.
- Wykorzystanie podwójnego testu luciferase do selekcjonowania.
- Zaszczepienie kultur bakteryjnych w celu oczyszczenia wektora.
- Zastosowanie zestawu do miniprzygotowania bakterii w celu ekstrakcji wektora.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych.
- Wykazanie efektywności i opłacalności metody.
- Walidacja testu podwójnego luciferase do celów selekcjonowania.
- Dostępność techniki dla większości badaczy.
Wnioski
- Opracowany protokół jest cennym narzędziem do badań nad czynnikami transkrypcyjnymi.
- Pozwola na szybkie selekcjonowanie wielu kandydatów.
- To podejście może ułatwić dalsze badania w dziedzinie biologii raka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying upstream regulators of transcription factors offers a more druggable alternative to direct targeting in oncology, reducing the risk of adverse effects in normal tissues. This medium-throughput screening approach enables rapid interrogation of hundreds of genes to de-risk target hypotheses and prioritize candidates with predictive confidence. The method supports early discovery workflows by providing quantitative, reproducible outputs that inform go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory networks to clarify pathway dependencies and validate functional targets in cancer models.
- Operational Value: Uses arrayed lentiviral libraries and dual-luciferase reporters to generate quantitative, normalized readouts for hit identification.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing direct regulators from indirect effects through orthogonal reporter constructs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces arrayed viral supernatants compatible with standardized infection workflows in 24-well formats.
- Quantitative Output: Dual-luciferase readout provides internal normalization via Renilla control to minimize well-to-well variability.
- Scalability: Medium-throughput design accommodates hundreds of genes per experiment using standard liquid handling and plate readers.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated in melanoma (A375) cells to identify regulators of YAP/TAZ, key effectors in Hippo pathway-driven tumorigenesis.
- Translational Continuity: Hits can be validated using orthogonal assays for transcription factor activity, supporting progression to preclinical models.
- Mechanistic Insight: Enables discrimination between transcriptional co-activator dependence and minimal promoter artifacts via TEAD-binding element reliance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis screening to lead identification, providing assay-ready biological systems and quantitative data for downstream chemistry and validation efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genetic perturbations to transcriptional output via luciferase reporters.
- Screening: Generates reproducible, normalized luciferase signals enabling comparison across library members.
- Analytics: Delivers firefly/Renilla ratios that quantify pathway-specific activity, facilitating hit selection and prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through confirmation of regulator knockdown and transcriptional impact.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to CRISPR, cDNA, or ORF libraries for sustained use across multiple transcription factor programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in transcriptional regulation by identifying upstream modulators with functional validation.
- Operational Value: Employs accessible reagents (bacterial miniprep kits, standard transfection reagents) and common instrumentation (plate readers, multichannel pipettes).
- Strategic Value: Improves target selection confidence, reducing late-stage failure risk from inadequate biological de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of transcription factor-modulating strategies over direct targeting approaches.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for library preparation and viral vector handling.
- Dependent on lentiviral production infrastructure and biosafety containment for infectious material.
- Necessitates standardization of transfection efficiency and puromycin selection across arrayed conditions.
- Adaptable to various cancer cell lines provided they support lentiviral transduction and reporter expression.
- Limited to transcriptional readouts; functional phenotypes require secondary validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Lentiviral Vector Library Preparation
1:24
Packaging of the Arrayed Lentiviral Library
3:35
Cell Infection for Screening
4:48
Cell Seeding for Transfection of Dual-Luciferase Reporter
6:27
Dual-Luciferase Reporter Transfection
7:35
Dual-Luciferase Activity Quantification
9:02
Results: Representative Arrayed Library Screening
10:47
Conclusion
