Wysokowydajna metoda izolowania perycytów mózgowych od myszy

Ostatnio rola perycytów mózgowych stała się oczywista w zaburzeniach neurologicznych i funkcjonowaniu mózgu. Dlatego konieczne jest opracowanie niezawodnej metody hodowli tych komórek. Nasz protokół ekstrakcji mysich perycytów mózgowych stanowi niezawodne narzędzie do badań in vitro i zapewnia perycytom wysoką czystość i wydajność komórkową.

Procedurę z Anupriyą Mehrą zademonstruje Lucie Dehouck, technik z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia mózgu specyficznego, wolnego od patogenów cztero- lub sześciotygodniowego samca myszy C57BL/6 na sterylnej, suchej, niestrzępiącej się chusteczce i użyciu kleszczyków z zakrzywioną końcówką do usunięcia móżdżku, prążkowia i nerwów potylicznych. Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć wszystkie widoczne opony mózgowe i odwróć tkankę mózgową do góry nogami.

Otwórz płaty lekkimi ruchami na zewnątrz i usuń wszystkie widoczne naczynia krwionośne. Następnie umieść tkankę mózgową wolną od opon mózgowych na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 15 mililitrów zimnego buforu do mycia B.To homogenizacji tkanki, przenieś próbkę mózgu do probówki z moździerem do mielenia tkanek Dounce i dodaj trzy do czterech mililitrów buforu myjącego B do probówki. Użyj luźnego tłuczka, aby zmielić tkankę 55 razy, a następnie opłucz tłuczek buforem myjącym B i zmiel zawiesinę tkanek ciasnym tłuczkiem 25 razy.

Pod koniec homogenizacji równomiernie podzielić zawiesinę między dwie 50-mililitrowe probówki i dodać 1,5-krotność objętości zimnego 30% dekstranu albuminy surowicy bydlęcej. Następnie energicznie potrząśnij rurkami, aby wymieszać gnojowicę. Aby wyizolować frakcję naczyniową, należy osadzać komórki przez odwirowanie i przenieść supernatanty do dwóch nowych probówek.

Przechowywać granulki w buforze do mycia B na lodzie. Zawiesić granulki w trzech mililitrach buforu B do mycia na zimno na lodzie. Odwirować zebrane supernatanty i powtórzyć ten krok jeszcze raz.

Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić granulki w trzech mililitrach buforu myjącego B. Następnie połączyć ponownie zawieszone osady i doprowadzić końcową objętość połączonej zawiesiny komórek do 10 mililitrów za pomocą świeżego buforu do płukania na zimno B. Następnie odciąć komórki za pomocą 10-milimetrowej pipety sześć razy, aż nie będą widoczne żadne pozostałe grudki granulek i użyć zespołu filtra próżniowego i sitka z nylonowej siatki do przefiltrowania zawiesiny komórek. Umieścić sitko na szalce Petriego i oczyścić siatkę świeżym buforem do mycia B i zeskrobaniem w celu odzyskania wszelkich naczyń włosowatych. Następnie wykonaj drugą filtrację ze świeżym filtrem.

Podzielić filtrat równo między dwie probówki i zebrać komórki przez odwirowanie. Po odrzuceniu supernatantów, zebrać granulki w jednej probówce zawierającej wstępnie podgrzany bufor myjący B z enzymami i dodać do probówki wstępnie podgrzaną kolagenazę/dispasę. Umieścić probówkę w łaźni wodnej ze stołem wstrząsającym dokładnie na 33 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed zatrzymaniem reakcji za pomocą 30 mililitrów buforu do płukania na zimno B. Zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie wyrzucić supernatant.

Szybko, ale ostrożnie ponownie zawiesić osad w buforze płuczącym B sześć razy i ponownie odwirować zawiesinę. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 18 mililitrach kompletnego podłoża DMEM i wysiać dwa mililitry zawiesiny komórkowej w kompletnym DMEM w dziewięciu dołkach po trzy sześciodołkowe płytki pokryte Matrigelem. Umieść kultury komórkowe w sterylnym inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% na 24 godziny, a następnie ostrożnie usuń zanieczyszczenia z każdej studzienki i dodaj świeże podłoże DMEM.

Po 48 godzinach zmieniaj pożywkę w każdym dołku co 48 godzin. W ósmym do dziesiątym dniu, gdy komórki osiągną 100% zbieżności, należy przenieść komórki w pożywce do hodowli perycytów na nowe, sześciodołkowe płytki pokryte żelatyną i zwrócić komórki do inkubatora hodowli komórkowych na dodatkowe sześć do siedmiu dni z monitorowaniem. Następnie ponownie podziel komórki w 17 dniu w pożywce perycytowej na nowe płytki pokryte żelatyną.

Od przejścia zero do przejścia drugiego istnieją specyficzne cechy morfologiczne, dzięki którym można zidentyfikować komórki śródbłonka i wynikający z niego stopniowy wzrost perycytów. W hodowli pasażowej zero obfitość występuje w wydłużonych komórkach śródbłonka rozwijających się z mikronaczyń. Obfitość ta zmniejsza się po pierwszym przejściu i nie występuje po drugim pasażu.

Wręcz przeciwnie, perycyty pojawiają się jako rzadkie komórki czworoboczne we wczesnych hodowlach i stają się obfite przez pasaż drugi. Ocena ekspresji NG2, CD146 i PDGFR beta może być wykorzystana do oceny czystości kultury perycytów za pomocą ilościowego PCR, immunocytochemii i Western blot. Trawienie enzymatyczne jest kluczowym krokiem dla powodzenia protokołu.

Pamiętaj, aby ściśle monitorować stężenia enzymów i czas inkubacji.