Name: Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych w mikrofluidyce przy użyciu fotolizy do badania chemotaksji mikroorganizmów. Technika ta pozwala mierzyć odpowiedź populacji bakterii na niestacjonarne gradienty chemiczne w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują PIERWSZEMU zakładowi mikrofabrykacji na ETH Zurich. Praca ta została wsparta przez Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (dla D.R.B.), nagrodę Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (dla R.S.) oraz grant Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (dla R.S.).

<ol><li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArmitage%2C+JP+%22The+biology+of+the+chemotactic+response%22">The biology of the chemotactic response</a>. , Cambridge University Press. (1991).</li>
<li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li>
<li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+recyclers%3A+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li>
<li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+diversity+modulates+population+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895(2016).</li>
<li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+compounds%3A+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li>
<li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+of+caged+compounds%3A+New+tools+for+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li>
<li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA%2FDNA+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li>
<li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific%2C+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li>
<li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuBi-Glutamate%3A+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li>
<li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signal+integration+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li>
<li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li>
<li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li>
<li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985(2015).</li>
<li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li>
<li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irreversible%2C+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548(2010).</li>
<li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Marine+Research%22%5BJournal%5D)">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li>
<li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel%2C+fast+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li>
<li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm%3A+Photochemical+advantages%2C+localisation%2C+phototoxicity+and+methods+for+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li>
<li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T%3D298.15K%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Thermodynamics%22%5BJournal%5D)">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li>
<li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophysical+properties+of+seawater%3A+a+review+of+existing+correlations+and+data%5BTitle%5D)+AND+%22Desalination+and+Water+Treatment%22%5BJournal%5D)">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li>
<li>Nikon depth of field calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019).</li>
<li>Kiørboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates%3A+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li>
<li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li>
<li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231(2011).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li>
<li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta pozwala naukowcom badać chemotaksję bakteryjną pod kontrolowanymi, dynamicznymi gradientami w urządzeniach mikro- i miliprzepływowych, umożliwiając powtarzalne pozyskiwanie danych. Niemal natychmiastowe wytwarzanie impulsów chemicznych w mikroskali w procesie fotolizy ma na celu odtworzenie rodzajów impulsów odżywczych, które bakterie napotykają w naturze z różnych źródeł, na przykład dyfuzyjnego rozprzestrzeniania się pióropuszy za tonącymi cząstkami morskimi25 lub rozprzestrzeniania si...

Mikroby polegają na chemotaksji, procesie wykrywania gradientów chemicznych i modyfikowania ruchliwości w odpowiedzi1, aby poruszać się po krajobrazach chemicznych, zbliżać się do źródeł składników odżywczych i gospodarzy oraz uciekać przed szkodliwymi substancjami. Te procesy w mikroskali określają kinetykę interakcji między mikroorganizmami a ich środowiskiem2,3. Ostatnie postępy w mikrofluidyce i technologiach mikrowytwarzania, w tym miękka litografia4, zrewolucjonizowały naszą zdolność do tworzenia kontrolowanych mikrośrodowisk, w których można badać interakcje mikroorganizmów. Na przykład wcześniejsze eksperymenty badały chemotaksję bakteryjną poprzez generowanie wysoce kontrolowanych, stabilnych gradientów o średnich i wysokich stężeniach składników odżywczych5,6. Jednak w środowisku naturalnym gradienty chemiczne w mikroskali mogą być krótkotrwałe - rozpraszane przez dyfuzję molekularną - a warunki tła są często bardzo rozcieńczone7. Aby bezpośrednio zmierzyć odpowiedź chemotaktyczną populacji drobnoustrojów po raz pierwszy wystawionych na działanie niestabilnego środowiska chemicznego, opracowaliśmy i opisujemy metody łączenia technologii mikroprzepływowej z fotolizą, naśladując w ten sposób gradienty, które dzikie bakterie napotykają w naturze.
Technologia uncaging wykorzystuje światłoczułe sondy, które funkcjonalnie zamykają biomolekuły w nieaktywnej formie. Napromieniowanie uwalnia cząsteczkę w klatce, umożliwiając ukierunkowane zakłócenie procesu biologicznego8. Ze względu na szybką i precyzyjną kontrolę chemii komórkowej, którą zapewnia odblokowanie9, fotoliza związków w klatkach jest tradycyjnie stosowana przez biologów, fizjologów i neurobiologów do badania aktywacji genów10, kanały jonowe11, oraz neurons12. Niedawno naukowcy wykorzystali znaczące zalety fotolizy do zbadania chemotaksji13, do określenia dynamiki przełączania wici w poszczególnych komórkach bakteryjnych wystawionych na stopniowy bodziec chemoatraktantowy14,15, oraz do zbadania wzorców ruchliwości pojedynczych plemników w trójwymiarowych (3D) gradientach16.
W naszym podejściu, wdrażamy fotolizę aminokwasów w klatkach w urządzeniach mikroprzepływowych, aby badać reakcję behawioralną populacji bakterii na kontrolowane impulsy chemiczne, które stają się niemal natychmiast dostępne dzięki wydaniu zdjęć. Zastosowanie obiektywu o małym powiększeniu (4x) (NA = 0,13, głębokość ostrości około 40 μm) pozwala zarówno na obserwację agregacyjnej odpowiedzi tysięcy bakterii na poziomie populacji w dużym polu widzenia (3,2 mm x 3,2 mm), jak i na pomiar ruchu na poziomie pojedynczej komórki. Przedstawiamy dwa zastosowania tej metody: 1) uwolnienie pojedynczego impulsu chemicznego w celu zbadania dynamiki akumulacji i rozpraszania bakterii w oparciu o warunki jednorodne oraz 2i) uwolnienie wielu impulsów w celu scharakteryzowania dynamiki akumulacji bakterii w zmiennych w czasie, przestrzennie niejednorodnych warunkach chemoatraktantu. Metoda ta została przetestowana na bakteriach morskich Vibrio ordalii wykonujących chemotaksję w kierunku aminokwasu glutaminianu17, ale metoda ta ma szerokie zastosowanie do różnych kombinacji gatunków i chemoatraktantów, a także do procesów biologicznych poza chemotaksją (np. pobieranie składników odżywczych, ekspozycja na antybiotyki, quorum sensing). Podejście to może pomóc w wyjaśnieniu ekologii i zachowania mikroorganizmów w realistycznych środowiskach oraz w odkryciu ukrytych kompromisów, z jakimi borykają się poszczególne bakterie podczas poruszania się po efemerycznych gradientach dynamicznych.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>>98% czystości, wysoce toksyczna</td></tr><tr><td>probówka CELLSTAR Wirówka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td>50 ml</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>do usuwania zużytych pożywek z kultur bakteryjnych</td></tr><tr><td>Inkubatory cyfrowe Incu-Line</td><td>VWR-CH</td><td>390-0384</td><td>do pieczenia 3D master</td></tr><tr><td>Duster</td><td>VWR-CH</td><td>16650-22</td><td>do czyszczenia płytki i mikrokanalików</td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>VWR-CH</td><td>444-0601</td><td>do łączenia mikrokanalików</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki wirówkowe</td><td>LightSafe Sigma-Aldrich</td><td>Z688312</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>do analizy obrazu i śledzenia</td></tr> <tr><td>bakteriiProbówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>VWR-CH</td><td>631-1552</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse TiE</td><td>Nikon Instrumenty</td><td>MEA53100</td><td>ze zmotoryzowanym stolikiem</td></tr><tr><td>MNI-glutaminian</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1490</td><td>>98 % czystości, światłoczuły</td></tr><tr><td>Sprzęt do drukowania form</td><td>Stratasys</td><td></td><td>Objet30 3D drukarka</td></tr><tr><td>Usługa drukowania form</td><td>3D Printing Studios</td><td>Custom</td><td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a>Nanodrop</td></tr> <tr><td>One Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>do kalibracji odłączania</td></tr><tr><td>elementów NIS</td><td>Instrumenty Nikon Obrazowanie</td><td></td><td>mikroskopowe </td></tr><tr><td>Oprogramowanie Piekarnik Venti-Line</td><td>VWR-CH</td><td>466-3516</td><td>do pieczenia PDMS (z konwekcją wymuszoną)</td></tr><tr><td>Photoresist SU-8-3050</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU8-3050</td><td></td></tr><tr><td>Komora plazmowa Zepto</td><td>Diener Electronic</td><td>ZEPTO-1</td><td>do funkcjonalizacji powierzchni przed klejeniem</td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa</td><td>Sterlitech</td><td>PCT0447100</td><td>0,4 i mikro; m wielkość porów, 19 % otwarta przestrzeń, 24 i mikro; m grubość</td></tr><tr><td>Mikrorurki polietylenowe</td><td>Scientific Commodities</td><td>BB31695-PE/2</td><td>ID x OD: 0,015 "x 0,043" / 0,38 mm x 1,09 mm</td></tr><tr><td>Polistyrenowa płytka Petriego</td><td>VWR-CH</td><td>25373-100</td><td>dolna powierzchnia (90 mm x 15 mm) do łączenia urządzenia milifluidowego</td></tr><tr><td>Skala</td><td>VWR-CH</td><td>611-2605</td><td>do wagi mieszaniny PDMS</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS Andor Zyla</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>do mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji (max 100 kl./s)Sól</td></tr> <tr><td>morska</td><td>Instant Ocean</td><td>Nr produktu SS1-160p</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 2015</td><td>Dassault Systèmes, SolidWorks</td><td></td><td>Służy do zaprojektowania formy</td></tr><tr><td>Silnik świetlny Spectra X</td><td>Lumencolor</td><td></td><td>do LED 395 nm</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>110-41-155</td><td>PDMS Si Elastomer Zestaw; utwardzacz</td></tr><tr><td>Strzykawka (Luer-Lok)</td><td>B Braun Omnifix</td><td>4616308F</td><td></td></tr><tr><td>Igła do strzykawki</td><td>Agani</td><td>A228</td><td>od 10 do 30 ml</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa 11 Aparat Pico Plus Elite</td><td>Harvard</td><td>70-4506</td><td>Terumo Agani 23 miernik 5/8 cala (16 mm)</td></tr><tr><td>Podwójna pompa strzykawkowa</td> <td>VeroGrey</td><td>Stratasys</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Materiał formy</td></tr></tbody></table>

generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Pokazujemy metodę generowania kontrolowanych, dynamicznych impulsów chemicznych - gdzie miejscowy chemoatraktant staje się nagle dostępny w mikroskali - aby stworzyć mikrośrodowiska do eksperymentów z chemotaksją mikrobiologiczną. Aby wytworzyć impulsy chemiczne, opracowaliśmy system do niemal natychmiastowego wprowadzania źródeł aminokwasów poprzez fotolizę aminokwasów w klatkach w komorze mikroprzepływowej z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającej zawiesinę bakteryjną. Zastosowaliśmy tę metodę do bakterii chemotaktycznej, Vibrio ordalii, która może aktywnie wspinać się po tych dynamicznych gradientach chemicznych, będąc śledzoną za pomocą mikroskopii wideo. Aminokwasy, które stają się biologicznie obojętne ("uwięzione w klatce") w wyniku modyfikacji chemicznej fotousuwalną grupą ochronną, są jednolicie obecne w zawiesinie, ale nie są dostępne do spożycia aż do ich nagłego uwolnienia, które następuje w określonych przez użytkownika punktach w czasie i przestrzeni za pomocą skupionej wiązki LED o bliskim promieniowaniu UV-A. Liczbę cząsteczek uwalnianych w impulsie można określić za pomocą zależności kalibracyjnej między czasem ekspozycji a frakcją uncaging, gdzie widmo absorpcyjne po fotolizie jest charakteryzowane za pomocą spektroskopii UV-Vis. Membrana z nanoporowatego poliwęglanu (PCTE) może być zintegrowana z urządzeniem mikroprzepływowym, aby umożliwić ciągłe usuwanie przez przepływ związków nieumieszczonych w sadzkach i zużytych mediów. Silne, nieodwracalne wiązanie między membraną PCTE a strukturą mikroprzepływową PDMS uzyskuje się poprzez pokrycie membrany roztworem 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES), a następnie aktywację plazmową łączonych powierzchni. System sterowany komputerowo może generować zdefiniowane przez użytkownika sekwencje impulsów w różnych lokalizacjach i o różnej intensywności, tak aby tworzyć krajobrazy zasobów o określonej zmienności przestrzennej i czasowej. W każdym krajobrazie chemicznym można uzyskać dynamikę przemieszczania się bakterii w skali indywidualnej i ich akumulacji na poziomie populacji, co pozwala na ilościowe określenie wydajności chemotaktycznej i jej wpływu na agregacje bakterii w środowiskach istotnych z ekologicznego punktu widzenia.

Do badania profili akumulacji bakterii w dynamicznych warunkach odżywczych wykorzystaliśmy urządzenia mikrofluidyczne i millifluidyczne (Rysunek 1). Trajektorie bakterii wyekstrahowano z nagrań wideo uzyskanych za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej, rejestrujących dynamikę akumulacji i dyssypacji populacji bakterii po impulsie chemicznym wywołanym fotolizą (Rysunek 2 oraz Rysunek 3). Poprzez uśrednienie milionów trajektorii uzys...

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Metoda ta pozwala wyjaśnić ekologię i zachowanie mikroorganizmów poruszających się po dynamicznych gradientach chemicznych oraz odkryć ich ukryte kompromisy, kinetykę składników odżywczych i dynamikę populacji w mikrośrodowiskach istotnych z ekologicznego punktu widzenia. Łącząc technologię mikroprzepływową z fotolizą, generujemy kontrolowane impulsy chemiczne, w których zlokalizowany chemoatraktant staje się nagle dostępny w mikroskali, aby zmierzyć odpowiedź chemotaktyczną populacji drobnoustrojów po raz pierwszy wystawionych na niestabilne gradienty chemiczne. Zaprojektuj kanał za pomocą oprogramowania CAD i wydrukuj go na przezroczystej folii, aby utworzyć maskę fotograficzną.Wyprodukuj mistrza za pomocą miękkiej litografii w czystym pomieszczeniu, zgodnie z rękopisem. Przygotuj mieszaninę PDMS, łącząc elastomer z jego utwardzaczem w stosunku 10 do jednego w 40-mililitrowej zlewce. Za pomocą plastikowego noża energicznie mieszaj, aż płyn będzie jednorodny.Mieszaninę PDMS należy natychmiast odgazować w komorze próżniowej przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Aby przyspieszyć proces, okresowo uwalniaj próżnię, aby rozerwać pęcherzyki, które tworzą się na granicy faz. Usuń kurz z powierzchni mistrza za pomocą środka czyszczącego pod ciśnieniem.Następnie wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na mistrza i piecz w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Przetnij PDMS ostrzem wokół mikrostruktur w odległości około pięciu milimetrów, a następnie ostrożnie oderwij PDMS od wzorca. Przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot mikrokanału.Uszczelnij mikrokanalik taśmą klejącą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu. Zaprojektuj kształt 3D za pomocą oprogramowania do projektowania 3D i wydrukuj wzorzec formy PDMS za pomocą drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości. Po przygotowaniu i odgazowaniu mieszaniny PDMS, jak to miało miejsce wcześniej, należy oczyścić powierzchnię wzorca, przecierając go taśmą klejącą.Umieść mistrza na wadze. Następnie, omijając centralny obszar wzorca, wlej 23,4 grama nieutwardzonej mieszaniny PDMS, aby uzyskać pożądaną wysokość PDMS, dopasowując wysokość wzorca do 0,5 milimetra. Usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki za pomocą sprężonego powietrza.Umieść PDMS odlany na mistrzu w piekarniku w temperaturze 45 stopni Celsjusza, aby piec przez co najmniej 12 godzin. Następnie delikatnie oderwij utwardzoną warstwę PDMS i przebij otwory wlotowe i wylotowe do wstrzyknięcia zawiesiny bakteryjnej. Aktywuj zarówno powierzchnię szalki Petriego, jak i formę PDMS plazmą tlenową na dwie minuty.Przymocuj formę PDMS do szalki Petriego, delikatnie dociskając formę do szalki Petriego. Unikaj naciskania w miejscu, w którym znajdują się obiekty. Umieść szalkę Petriego połączoną z formą PDMS 3D w piekarniku w temperaturze 45 stopni Celsjusza na co najmniej 12 godzin, aby wzmocnić wiązanie chemiczne.Następnie aktywuj nanoporowatą membranę poliwęglanową w komorze plazmy tlenowej na jedną minutę w temperaturze pokojowej. Pod kapturem chemicznym rozcieńczyć komercyjny roztwór 3-aminopropylotrietoksysilanu w wodzie dejonizowanej do 1% objętości za pomocą rurki polipropylenowej. Przenieść rozcieńczony roztwór 3-aminopropylotrietoksysilanu na szalkę Petriego i zanurzyć aktywowaną błonę w roztworze 3-aminopropylotrietoksysilanu na 20 minut.Następnie usuń membranę z roztworu 3-aminopropylotrietoksysilanu za pomocą pęsety i umieść ją na chusteczce do czystego pomieszczenia do wyschnięcia. W celu wytworzenia kanałów mikroprzepływowych PDMS, które będą leżeć na membranie i umożliwią mycie areny bakteryjnej, powtórz wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego dla eksperymentu z pojedynczym impulsem chemicznym, jak to miało miejsce wcześniej. Aby połączyć kanały myjące PDMS z funkcjonalizowaną membraną, najpierw aktywuj zarówno kanał myjący PDMS, jak i membranę poliwęglanową za pomocą komory plazmy tlenowej na dwie minuty.Bezpośrednio po zabiegu plazmowym należy doprowadzić do kontaktu funkcjonalizowanej membrany i kanału myjącego PDMS, delikatnie dociskając kanał myjący PDMS do membrany. Ważne jest, aby delikatnie docisnąć do siebie PDMS i membranę, w przeciwnym razie membrana może zostać nieodwracalnie połączona z sufitem mikrokanału PDMS o wysokości 200 mikrometrów. Następnie aktywuj zarówno membranę poliwęglanową kanału myjącego PDMS z laminatu, jak i formę 3D PDMS wcześniej połączoną z szalką Petriego, umieszczając je w komorze plazmy tlenowej na dwie minuty.Umieść membranę między dwiema warstwami PDMS i dociśnij do siebie. Umieść szalkę Petriego przyklejoną do struktury kanapki w piekarniku w temperaturze 45 stopni Celsjusza na co najmniej 12 godzin, aby wzmocnić wiązanie chemiczne. Na początek utrzymuj komorę milifluidyczną w próżni przez 20 minut.Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą komorę milifluidyczną na stoliku mikroskopowym. Za pomocą pipety napełnić komorę poniżej membrany rozcieńczoną zawiesiną bakteryjną fluorescencyjnego Vibrio ordalii z GFP w jednomilimolowym roztworze L-glutaminianu 4-metoksy-7-nitroindolinylu w klatce w sztucznej wodzie morskiej. Po napełnieniu kanału zawiesiną bakteryjną należy odessać nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym, a wlot i wylot uszczelnić zatyczkami PDMS, delikatnie wciskając je w otwory.Napełnij strzykawkę sztucznym roztworem 4-metoksy-7-nitroindolinylowo-klatkowego L-glutaminianu 4-metoksy-7-nitroindolinylu w klatce i podłącz rurkę do wlotu i wylotu kanału myjącego nad membraną. Podłącz rurkę do zbiornika na odpady i upewnij się, że rurka jest całkowicie zanurzona w zbiorniku na odpady płynu, aby uniknąć wahań ciśnienia. Ustaw natężenie przepływu na pompie strzykawkowej na 50 mikrolitrów na minutę.Uruchomić pompę strzykawkową, aby ustalić przepływ w kanale myjącym nad membraną. Uruchom oprogramowanie sterujące wiązką LED i stolikiem mikroskopu i generuj zdefiniowane przez użytkownika sekwencje impulsów w różnych miejscach i o różnym natężeniu. Nagrywaj wideo za pomocą obiektywu 4x w regularnych odstępach czasu przez kilka godzin i w wielu sąsiadujących ze sobą lokalizacjach, aby pokryć dużą powierzchnię.W tym badaniu urządzenia mikroprzepływowe i miliprzepływowe wykorzystano do zbadania profili odpowiedzi chemotaktycznej i akumulacji bakterii w dynamicznych warunkach składników odżywczych. Projekcje maksymalnej intensywności pokazują pozycję bakterii, oznaczoną białymi śladami, w odstępie 0,5 sekundy bezpośrednio po uwolnieniu impulsu i 40 sekund po uwolnieniu impulsu. Trajektorie bakterii zostały również pokazane na czarno 60 sekund po uwolnieniu impulsu.Zacieniony obszar reprezentuje impuls chemiczny uwolniony w wyniku fotolizy w czasie zero sekundy w środku pola widzenia, który następnie uległ dyfuzji. Pokazano tutaj stężenie bakterii, a także czasową dynamikę prędkości dryfu radialnego po uwolnieniu impulsu w środku pola widzenia. Ujemne wartości prędkości dryftu odpowiadają skierowanemu ruchowi chemotaktycznemu w kierunku środka impulsu.Statystyki pływania są przedstawione tutaj dla populacji bakterii przy braku gradientów chemicznych. Trajektorie reprezentują dwuwymiarowe rzuty trójwymiarowego ruchu bakterii w mikrokanale. Rozkład prawdopodobieństwa zmierzonej prędkości pływania bakterii dopasowano do rozkładu gamma.Z trajektorii bakterii wyodrębniono rozkład prawdopodobieństwa czasu między kolejnymi reorientacjami. Wzorzec reorientacji, rozkład prędkości pływania i statystyki reorientacji organizmów wykorzystano do poinformowania o indywidualnym modelu. Metoda ta została przetestowana na bakteriach morskich Vibrio ordalii przeprowadzających chemotaksję w stosunku do aminokwasu glutaminianu, ale proponowana metodologia ma szerokie zastosowanie do różnych kombinacji gatunków i chemoatraktantów, a także do procesów biologicznych poza chemotaksją, takich jak dynamika populacji i społeczności w przestrzennie niejednorodnych i dynamicznych warunkach.Klasyczne techniki w ekologii mikrobiologicznej i mikrobiologii, takie jak wzrost w kulturach okresowych lub chemostaty, w dużej mierze ignorują czasoprzestrzenne cechy siedlisk mikrobiologicznych. Niemal natychmiastowe wytwarzanie impulsów chemicznych w mikroskali w procesie fotolizy ma na celu odtworzenie rodzaju impulsów odżywczych, które bakterie morskie napotykają w naturze z różnych źródeł, na przykład dyfuzyjnego rozprzestrzeniania się pióropuszy za tonącymi cząstkami organicznymi lub rozprzestrzeniania się składników odżywczych z lizowanych komórek fitoplanktonu. Roztwór aminosilu jest silnie toksyczny i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością.Pracujemy wyłącznie pod wyciągiem i nosimy sprzęt ochronny, taki jak fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice. Dbamy również o odpady, które wytworzyliśmy.

generating-controlled-dynamic-chemical-landscapes-to-study-microbial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano proces wytwarzania kanałów mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach służących do badania zachowań chemotaktycznych morskich drobnoustrojów w niejednorodnym środowisku nutrientowym (patchy nutrient seascape) oraz zachowań pływackich bakterii w przepływie ścinającym.

Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Opisujemy powstawanie ogrodów chemicznych za pomocą eksperymentów iniekcyjnych, które pozwalają na laboratoryjne symulacje naturalnych chemicznych systemów ogrodowych, które tworzą się w podmorskich kominach hydrotermalnych.

Ogrody chemiczne jako reaktory przepływowe symulujące naturalne systemy hydrotermalne

Wprowadzanie wielu zmian genomowych do cyjanobakterii jest niezbędnym narzędziem w rozwoju szczepów do celów przemysłowych i badań podstawowych. Opisano system generowania nieoznaczonych mutantów w modelowym gatunku sinic Synechocystis sp. PCC6803 oraz znakowanych mutantów w Synechococcus sp. PCC7002.

Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.

Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym

Przedstawiamy protokół urządzenia do ciągłej kultury mikrofluidalnej (MCCD), które umożliwia uprawę populacji bakteryjnych w stałych warunkach niskiego pożywienia (aż do setek nanomolarnych stężeń) lub czasowych fluktuacji składników odżywczych w skali minut.

Urządzenie mikrofluidyczne do ciągłej hodowli przeznaczone do badania Escherichia coli w warunkach niskich i wahających się stężeń składników odżywczych

Poznaj metodę generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych w mikrofluidyce przy użyciu fotolizy do badania chemotaksji mikroorganizmów. Technika ta pozwala mierzyć odpowiedź populacji bakterii na niestacjonarne gradienty chemiczne w czasie rzeczywistym.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Przeglądaj więcej filmów