Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Metoda ta pozwala wyjaśnić ekologię i zachowanie mikroorganizmów poruszających się po dynamicznych gradientach chemicznych oraz odkryć ich ukryte kompromisy, kinetykę składników odżywczych i dynamikę populacji w mikrośrodowiskach istotnych z ekologicznego punktu widzenia. Łącząc technologię mikroprzepływową z fotolizą, generujemy kontrolowane impulsy chemiczne, w których zlokalizowany chemoatraktant staje się nagle dostępny w mikroskali, aby zmierzyć odpowiedź chemotaktyczną populacji drobnoustrojów po raz pierwszy wystawionych na niestabilne gradienty chemiczne. Zaprojektuj kanał za pomocą oprogramowania CAD i wydrukuj go na przezroczystej folii, aby utworzyć maskę fotograficzną.

Wyprodukuj mistrza za pomocą miękkiej litografii w czystym pomieszczeniu, zgodnie z rękopisem. Przygotuj mieszaninę PDMS, łącząc elastomer z jego utwardzaczem w stosunku 10 do jednego w 40-mililitrowej zlewce. Za pomocą plastikowego noża energicznie mieszaj, aż płyn będzie jednorodny.

Mieszaninę PDMS należy natychmiast odgazować w komorze próżniowej przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Aby przyspieszyć proces, okresowo uwalniaj próżnię, aby rozerwać pęcherzyki, które tworzą się na granicy faz. Usuń kurz z powierzchni mistrza za pomocą środka czyszczącego pod ciśnieniem.

Następnie wlej odgazowaną mieszaninę PDMS na mistrza i piecz w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Przetnij PDMS ostrzem wokół mikrostruktur w odległości około pięciu milimetrów, a następnie ostrożnie oderwij PDMS od wzorca. Przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot mikrokanału.

Uszczelnij mikrokanalik taśmą klejącą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu. Zaprojektuj kształt 3D za pomocą oprogramowania do projektowania 3D i wydrukuj wzorzec formy PDMS za pomocą drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości. Po przygotowaniu i odgazowaniu mieszaniny PDMS, jak to miało miejsce wcześniej, należy oczyścić powierzchnię wzorca, przecierając go taśmą klejącą.

Umieść mistrza na wadze. Następnie, omijając centralny obszar wzorca, wlej 23,4 grama nieutwardzonej mieszaniny PDMS, aby uzyskać pożądaną wysokość PDMS, dopasowując wysokość wzorca do 0,5 milimetra. Usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki za pomocą sprężonego powietrza.

Umieść PDMS odlany na mistrzu w piekarniku w temperaturze 45 stopni Celsjusza, aby piec przez co najmniej 12 godzin. Następnie delikatnie oderwij utwardzoną warstwę PDMS i przebij otwory wlotowe i wylotowe do wstrzyknięcia zawiesiny bakteryjnej. Aktywuj zarówno powierzchnię szalki Petriego, jak i formę PDMS plazmą tlenową na dwie minuty.

Przymocuj formę PDMS do szalki Petriego, delikatnie dociskając formę do szalki Petriego. Unikaj naciskania w miejscu, w którym znajdują się obiekty. Umieść szalkę Petriego połączoną z formą PDMS 3D w piekarniku w temperaturze 45 stopni Celsjusza na co najmniej 12 godzin, aby wzmocnić wiązanie chemiczne.

Następnie aktywuj nanoporowatą membranę poliwęglanową w komorze plazmy tlenowej na jedną minutę w temperaturze pokojowej. Pod kapturem chemicznym rozcieńczyć komercyjny roztwór 3-aminopropylotrietoksysilanu w wodzie dejonizowanej do 1% objętości za pomocą rurki polipropylenowej. Przenieść rozcieńczony roztwór 3-aminopropylotrietoksysilanu na szalkę Petriego i zanurzyć aktywowaną błonę w roztworze 3-aminopropylotrietoksysilanu na 20 minut.

Następnie usuń membranę z roztworu 3-aminopropylotrietoksysilanu za pomocą pęsety i umieść ją na chusteczce do czystego pomieszczenia do wyschnięcia. W celu wytworzenia kanałów mikroprzepływowych PDMS, które będą leżeć na membranie i umożliwią mycie areny bakteryjnej, powtórz wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego dla eksperymentu z pojedynczym impulsem chemicznym, jak to miało miejsce wcześniej. Aby połączyć kanały myjące PDMS z funkcjonalizowaną membraną, najpierw aktywuj zarówno kanał myjący PDMS, jak i membranę poliwęglanową za pomocą komory plazmy tlenowej na dwie minuty.

Bezpośrednio po zabiegu plazmowym należy doprowadzić do kontaktu funkcjonalizowanej membrany i kanału myjącego PDMS, delikatnie dociskając kanał myjący PDMS do membrany. Ważne jest, aby delikatnie docisnąć do siebie PDMS i membranę, w przeciwnym razie membrana może zostać nieodwracalnie połączona z sufitem mikrokanału PDMS o wysokości 200 mikrometrów. Następnie aktywuj zarówno membranę poliwęglanową kanału myjącego PDMS z laminatu, jak i formę 3D PDMS wcześniej połączoną z szalką Petriego, umieszczając je w komorze plazmy tlenowej na dwie minuty.

Umieść membranę między dwiema warstwami PDMS i dociśnij do siebie. Umieść szalkę Petriego przyklejoną do struktury kanapki w piekarniku w temperaturze 45 stopni Celsjusza na co najmniej 12 godzin, aby wzmocnić wiązanie chemiczne. Na początek utrzymuj komorę milifluidyczną w próżni przez 20 minut.

Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą komorę milifluidyczną na stoliku mikroskopowym. Za pomocą pipety napełnić komorę poniżej membrany rozcieńczoną zawiesiną bakteryjną fluorescencyjnego Vibrio ordalii z GFP w jednomilimolowym roztworze L-glutaminianu 4-metoksy-7-nitroindolinylu w klatce w sztucznej wodzie morskiej. Po napełnieniu kanału zawiesiną bakteryjną należy odessać nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym, a wlot i wylot uszczelnić zatyczkami PDMS, delikatnie wciskając je w otwory.

Napełnij strzykawkę sztucznym roztworem 4-metoksy-7-nitroindolinylowo-klatkowego L-glutaminianu 4-metoksy-7-nitroindolinylu w klatce i podłącz rurkę do wlotu i wylotu kanału myjącego nad membraną. Podłącz rurkę do zbiornika na odpady i upewnij się, że rurka jest całkowicie zanurzona w zbiorniku na odpady płynu, aby uniknąć wahań ciśnienia. Ustaw natężenie przepływu na pompie strzykawkowej na 50 mikrolitrów na minutę.

Uruchomić pompę strzykawkową, aby ustalić przepływ w kanale myjącym nad membraną. Uruchom oprogramowanie sterujące wiązką LED i stolikiem mikroskopu i generuj zdefiniowane przez użytkownika sekwencje impulsów w różnych miejscach i o różnym natężeniu. Nagrywaj wideo za pomocą obiektywu 4x w regularnych odstępach czasu przez kilka godzin i w wielu sąsiadujących ze sobą lokalizacjach, aby pokryć dużą powierzchnię.

W tym badaniu urządzenia mikroprzepływowe i miliprzepływowe wykorzystano do zbadania profili odpowiedzi chemotaktycznej i akumulacji bakterii w dynamicznych warunkach składników odżywczych. Projekcje maksymalnej intensywności pokazują pozycję bakterii, oznaczoną białymi śladami, w odstępie 0,5 sekundy bezpośrednio po uwolnieniu impulsu i 40 sekund po uwolnieniu impulsu. Trajektorie bakterii zostały również pokazane na czarno 60 sekund po uwolnieniu impulsu.

Zacieniony obszar reprezentuje impuls chemiczny uwolniony w wyniku fotolizy w czasie zero sekundy w środku pola widzenia, który następnie uległ dyfuzji. Pokazano tutaj stężenie bakterii, a także czasową dynamikę prędkości dryfu radialnego po uwolnieniu impulsu w środku pola widzenia. Ujemne wartości prędkości dryftu odpowiadają skierowanemu ruchowi chemotaktycznemu w kierunku środka impulsu.

Statystyki pływania są przedstawione tutaj dla populacji bakterii przy braku gradientów chemicznych. Trajektorie reprezentują dwuwymiarowe rzuty trójwymiarowego ruchu bakterii w mikrokanale. Rozkład prawdopodobieństwa zmierzonej prędkości pływania bakterii dopasowano do rozkładu gamma.

Z trajektorii bakterii wyodrębniono rozkład prawdopodobieństwa czasu między kolejnymi reorientacjami. Wzorzec reorientacji, rozkład prędkości pływania i statystyki reorientacji organizmów wykorzystano do poinformowania o indywidualnym modelu. Metoda ta została przetestowana na bakteriach morskich Vibrio ordalii przeprowadzających chemotaksję w stosunku do aminokwasu glutaminianu, ale proponowana metodologia ma szerokie zastosowanie do różnych kombinacji gatunków i chemoatraktantów, a także do procesów biologicznych poza chemotaksją, takich jak dynamika populacji i społeczności w przestrzennie niejednorodnych i dynamicznych warunkach.

Klasyczne techniki w ekologii mikrobiologicznej i mikrobiologii, takie jak wzrost w kulturach okresowych lub chemostaty, w dużej mierze ignorują czasoprzestrzenne cechy siedlisk mikrobiologicznych. Niemal natychmiastowe wytwarzanie impulsów chemicznych w mikroskali w procesie fotolizy ma na celu odtworzenie rodzaju impulsów odżywczych, które bakterie morskie napotykają w naturze z różnych źródeł, na przykład dyfuzyjnego rozprzestrzeniania się pióropuszy za tonącymi cząstkami organicznymi lub rozprzestrzeniania się składników odżywczych z lizowanych komórek fitoplanktonu. Roztwór aminosilu jest silnie toksyczny i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością.

Pracujemy wyłącznie pod wyciągiem i nosimy sprzęt ochronny, taki jak fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice. Dbamy również o odpady, które wytworzyliśmy.