Name: Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa u myszy immunokompetentnych. Ta metoda umożliwia badanie patogenezy bakterii i interakcji gospodarz-patogen bez konieczności supresji immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wektor konstrukcji luminescencyjnej pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 był wspaniałym prezentem od J. Hardy'ego. Schematy zostały stworzone za pomocą BioRender.com. Dziękujemy laboratorium G. Gurtnera za porady dotyczące modelu zakażenia rany. Dziękujemy również T. Doyle'owi z Centrum Innowacji w Obrazowaniu In Vivo Uniwersytetu Stanforda za jego wiedzę techniczną. Praca ta była wspierana przez granty R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093 oraz granty ze Stanford SPARK, Falk Medical Research Trust i Cystic Fibrosis Foundation (CFF) dla P.L.B. C.R.D była wspierana przez T32AI007502. Stypendium Gabilan Stanford Graduate Fellowship for Science and Engineering oraz stypendium Lubert Stryer Bio-X Stanford Interdisciplinary Graduate Fellowship wspierane przez J.M.S.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Stanforda.
1. Przygotowanie i rozwój bakterii
<ol>
	<li>Wszystkie prace z P. aeruginosa i zwierzętami należy wykonywać z zachowaniem środków ostrożności BSL-2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego badacza i komitetu ds. wykorzystania zwierząt. Wszystkie opisane tutaj kroki z udziałem P. aeruginosa, w tym inokulację myszy, należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Luminescencyjny szczep PAO1:lux P. aeruginosa jest dostępny w naszym laboratorium na życzenie. Smuga PAO1, przechowywana jako zamrożony bulion glicerolowy, na agarze Lysogeny Bulion (LB). W przypadku luminescencyjnego szczepu PAO1:lux agar LB powinien zawierać selektywne antybiotyki (100 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml kanamycyny). Rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc w inkubatorze bakteryjnym.</li>
	<li>Wybierz izolowaną kolonię i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C w 3 ml pożywki LB o pH 7,4. W przypadku szczepów luminescencyjnych bulion powinien zawierać 100 μg/ml karbenicyliny. Rosną w wstrząsających, tlenowych warunkach.</li>
</ol>
2. Przygotowanie procedury
<ol>
	<li>Niech cały personel wykonujący operację nosi czysty fartuch/fartuch laboratoryjny, maskę na twarz, siatkę na włosy i rękawiczki.</li>
	<li>Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym nożyczki i kleszcze. Używaj techniki aseptycznej do sterylizacji narzędzi między zwierzętami.</li>
	<li>Oczyść stół operacyjny etanolem i przygotuj czyste pole operacyjne.</li>
</ol>
3. Depilacja
<ol>
	<li>Znieczulij 8-12-tygodniowe myszy C57BL/6J za pomocą 1%-3% izofluranu. Badacze powinni postępować zgodnie z wytycznymi personelu weterynaryjnego swojej instytucji dotyczącymi znieczulenia podczas stosowania izofluranu.
	<ol>
		<li>Rozpocznij znieczulenie od podania 1%-3% izofluranu i dostosuj natężenie przepływu tlenu do 1,5 l/min. Umieść mysz w komorze indukcyjnej.</li>
		<li>Ściśnij palec u nogi myszy, aby ocenić głębokość znieczulenia. Gdy mysz przestanie reagować na stymulację, wyjmij ją z komory indukcyjnej i połóż na stole operacyjnym z nosem w stożku nosowym z izofluranu.</li>
		<li>Nałóż lubrykant do oczu na oba oczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zważ mysz, aby uzyskać wyjściową masę przed zabiegiem.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej. Wstrzyknąć myszy podskórnie wstępnie podgrzany, sterylny 0,9% chlorek sodu w ilości 250 μl na każdym boku, co daje w sumie 500 μl.</li>
	<li>Ogol grzbietową część myszy za pomocą golarki elektrycznej. Golenie powinno odbywać się w innym miejscu niż stanowisko chirurgiczne, aby zapobiec zanieczyszczeniu rany włosami.</li>
	<li>Nałóż cienką warstwę balsamu do depilacji. Pozostaw balsam na 20–60 sekund. Usuń włosy i nadmiar balsamu za pomocą gazy zwilżonej ciepłą wodą. Po depilacji przystąp do procedury zranienia wycinającego.</li>
</ol>
4. Chirurgia wycinania ran pełnej grubości
<ol>
	<li>Buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu w dawce 0,6–1 mg/kg należy wstrzyknąć podskórnie za pomocą igły 25 G w środkową część grzbietu myszy. Buprenorfina o powolnym uwalnianiu zapewnia ulgę w bólu przez 48–72 godzin.</li>
	<li>Zdezynfekuj miejsce operowane. Przetrzyj powierzchnię grzbietową sterylnym wacikiem betadyny. Wytrzyj nadmiar betadyny sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem. Należy to wykonać 3 razy (na przemian z betadyną i alkoholem), pobierając wymaz, przesuwając się od środka w sposób okrężny do krawędzi. Pozostaw obszar do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Stwórz zasłonę otaczającą pole operacyjne za pomocą sterylnej gazy lub plastikowej folii spożywczej.</li>
	<li>Rozciągnąć skórę napiętą doogonowo. Użyj sterylnego stempla do biopsji skóry o średnicy 6 mm, aby wykonać wstępne nacięcie przez lewy naskórek grzbietowy. Powtórz na prawym naskórku grzbietowym.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby przymocować skórę od środka lewego zarysowanego obszaru rany. Wytnij warstwy naskórka i skóry właściwej za pomocą nożyczek. Powtórz tę czynność w zarysowanym po prawej stronie obszarze rany, aby utworzyć symetryczne rany wycinające.</li>
	<li>Przemyć rany 50 μl jałowego roztworu soli fizjologicznej. Pozostaw miejsce operowane i otaczającą skórę do wyschnięcia na powietrzu. Następnie przykryj rany i grzbiet przezroczystym opatrunkiem foliowym.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w czystej klatce. Dom 1 zwierzę w klatce.</li>
	<li>Umieść klatkę na poduszce grzewczej i monitoruj, aż mysz się obudzi.</li>
	<li>Wykonując powyższą operację na wielu zwierzętach, użyj gorącego sterylizatora kulkowego, aby wyczyścić wszystkie narzędzia chirurgiczne między zwierzętami.</li>
	<li>Odczekać 24 godziny, aby myszy doszły do siebie po zabiegu chirurgicznym i utworzyły tymczasową matrycę rany nad ranami przed przystąpieniem do inokulacji bakteriami.</li>
</ol>
5. Inokulacja P. aeruginosa
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przez noc kulturę PAO1:lux do OD600 = 0,05 w 75 ml pożywki LB zawierającej 100 μg/ml karbenicyliny i hodować bakterie, aż kultura znajdzie się we wczesnej fazie wykładniczej (OD600 ≈ 0,3). Powinno to zająć około 2-3 godzin.</li>
	<li>Rozcieńczyć PAO1:luks w PBS do stężenia (7,5 ± 2,5) x 102 jtk/ml. Należy upewnić się, że przygotowałeś nadmiar inokulum, aby zapewnić wystarczającą objętość i umożliwić posiew po eksperymencie. W przypadku transportu między obiektami (np. z laboratorium do wiwarium) należy użyć podwójnej hermetyzacji w szczelnym pudełku wyraźnie oznaczonym jako Biohazard.</li>
	<li>Wszystkie prace z P. aeruginosa i myszami należy wykonywać przy użyciu zatwierdzonych środków ochrony osobistej w szafie bezpieczeństwa biologicznego (BSC) zatwierdzonej przez poziom bezpieczeństwa biologicznego zwierząt 2 (ABSL-2). Sprzęt wielokrotnego użytku, taki jak waga, powinien być przykryty folią spożywczą, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Znieczulenie za pomocą 3% izofluranu, jak opisano powyżej. Zważ mysz i zapisz wagę. Wstrzyknąć myszy podskórnie wstępnie podgrzany, sterylny 0,9% chlorek sodu w ilości 250 μl na każdym boku, co daje w sumie 500 μl.</li>
	<li>Jeśli przezroczysty opatrunek filmowy myszy odpadł w ciągu nocy, ostrożnie usuń powstały strup i załóż nowy opatrunek.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki z nasadką zabezpieczającą tuberkuliny 27 G o pojemności 500 μl wstrzyknąć 40 μl zawiesiny PAO1:lux przez przezroczysty opatrunek do każdej rany. Do kontroli ran nieszczepionych/PBS należy używać różnych myszy, aby zapobiec zakażeniu krzyżowemu od strony przeciwnej.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce na poduszce grzewczej i monitoruj, aż się obudzi. Wszystkie myszy powinny być trzymane indywidualnie w oddzielnych klatkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
	<li>Zapewnij wysokokaloryczną pastę suplementu diety umieszczoną między granulkami żywności na podłodze klatki.</li>
	<li>Użyj pozostałego inokulum, aby pokryć płytkę agarową LB. Policz kolonie, aby potwierdzić liczbę podanych bakterii.</li>
</ol>
6. Obrazowanie in vivo zakażonych ran
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z protokołami hermetyczności BSL-2 dotyczącymi transportu myszy do i z instrumentu do obrazowania, w tym przy użyciu dodatkowego pojemnika. Należy uważać, aby nie przenieść ani nie upuścić żadnej ściółki zwierzęcej podczas przenoszenia myszy do komory indukcyjnej lub przyrządu do obrazowania.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie myszy za pomocą wziewnego 1%-3% izofluranu w komorze indukcyjnej, jak opisano w kroku 3.1.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy umieść ją w pozycji leżącej w komorze obrazowania optycznego systemu obrazowania z nosem w stożku nosowym izofluranu.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie.</li>
	<li>Parametry akwizycji będą się różnić w zależności od liczby zwierząt obrazowanych jednocześnie i intensywności bioluminescencji. Podstawowe parametry, które należy ustawić, to czas ekspozycji, binning, przysłona i pole widzenia (FOV). Nasze domyślne ustawienia początkowe to czas ekspozycji 30 sekund, binning low (2), f/stop 1.2 i FOV 25. Dostosuj te ustawienia w razie potrzeby w zależności od potrzeb badacza.</li>
	<li>Analizuj dane dotyczące luminescencji za pomocą programu do obrazowania (patrz tabela materiałów). Luminescencja będzie reprezentowana jako pseudokolorowy obraz nałożony na kolorową fotografię myszy.
	<ol>
		<li>Utwórz obszar zainteresowania (ROI) w miejscu rany i zmierz średni wykryty strumień (fotony/sekundę). Należy pamiętać, że dane mogą być również raportowane jako promieniowanie (fotony/sekunda/cm²/steradian), ale tak długo, jak odległość platformy obrazowania od kamery pozostaje stała między obrazowaniami, strumień jest wystarczający.</li>
		<li>Zmierz tło, tworząc zwrot z inwestycji w losowym obszarze na platformie obrazowania. Odejmij liczbę fotonów tła na sekundę.</li>
		<li>Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj obrazowanie zgodnie z powyższym opisem tak często, jak dziennie, aby śledzić postęp infekcji.</li>
</ol>
7. Postępowanie pooperacyjne
<ol>
	<li>Monitoruj myszy zgodnie z wytycznymi określonymi w protokole IACUC badacza. Monitorujemy wszystkie myszy codziennie przez pierwsze 4 dni, a następnie co drugi dzień, aż do końca eksperymentu. Waż myszy raz dziennie przez pierwsze 4 dni po operacji w BSC. Wstrzyknąć 250 μl 0,9% chlorku sodu podskórnie w 1. i 2. dniu po zakażeniu.</li>
	<li>Sprawdź, czy u myszy nie ma oznak bólu/niepokoju, w tym zgarbionej postawy, niechlujnej sierści, letargu, trudności w oddychaniu, grymasu twarzy i utraty wagi.</li>
	<li>Jeśli zwierzęta wykazują oznaki pogarszającego się stanu zdrowia, skonsultuj się z weterynarzem. Każda mysz, która wydaje się wykazywać pogarszające się oznaki bólu/niepokoju i utratę masy ciała o 20% lub więcej, powinna zostać poddana eutanazji.</li>
</ol>
8. Wycięcie rany
<ol>
	<li>Pod koniec eksperymentu należy złożyć myszy w ofierze za pomocą inhalacji CO2, a następnie zwichnąć szyjkę macicy. Zwłoki zwierzęce należy utylizować zgodnie z protokołami ABSL-2 instytucji.</li>
	<li>Wyciskaj łóżka ran za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy w BSC. Umieść każde łożysko rany w 1 ml sterylnego PBS w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml. Zmiel tkankę rany nożyczkami. Wszystkie rany powinny być traktowane jako ASBL-2, nawet jeśli nie są uważane za zakażone.</li>
	<li>Inkubować na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Wirować każdą probówkę przez 10 s i seryjnie rozcieńczać ścieki bakteryjne w PBS. Umieść rozcieńczone ścieki bakteryjne na agarze LB, aby wyliczyć obciążenie bakteryjne.</li>
	<li>Za zakażone rany należy rozważyć, jeśli sygnał luminescencyjny w ranie jest powyżej luminescencji tła i w ściekach z rany wykryto więcej bakterii niż w ranach zaszczepionych PBS jako kontrolą.</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa%3A+epidemiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li>
<li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Rice, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+life+cycle+and+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+dependent+on+a+filamentous+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage.</a> The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).</li>
<li>Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+lung+disease+with+transition+to+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection.</a> Scientific Reports. 6, 35838(2016).</li>
<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Opracowaliśmy nowatorski model zakażenia ran P. aeruginosa z opóźnioną inokulacją. Strategia opóźniania inokulacji bakteriami do 24 godzin po zranieniu wycinającym umożliwia ocenę zakażeń ran w okresie 1 tygodnia. Dzięki zastosowaniu luminescencyjnego szczepu P. aeruginosa możliwe jest śledzenie postępu infekcji przez cały przebieg infekcji. Dłuższy przebieg infekcji w porównaniu z innymi modelami zakażenia P. aeruginosa stworzy nowe możliwości badania interakcji gospodarz-patogen i nowych tera...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) to Gram-ujemna bakteria w kształcie pałeczki o rosnącym znaczeniu dla ludzkiego zdrowia i choroby. Jest odpowiedzialny za dużą zachorowalność i śmiertelność w warunkach szpitalnych, szczególnie w przypadku zakażeń ran u pacjentów z obniżoną odpornością1,2. Pojawienie się wielolekoopornych szczepów tego patogenu dostarczyło dalszych impulsów do badań nad czynnikami przyczyniającymi się do zjadliwości P. aeruginosa, mechanizmami oporności P. aeruginosa na antybiotyki oraz nowymi metodami zapobiegania i leczenia tej śmiertelnej infekcji3. W związku z tym zapotrzebowanie na modele zwierzęce przewlekłego zakażenia ran jako narzędzia do badania tych pytań badawczych nigdy nie było większe.
Niestety, wiele modeli zwierzęcych infekcji P. aeruginosa ma tendencję do symulowania ostrej infekcji z szybkim ustąpieniem infekcji lub gwałtownym spadkiem z powodu sepsy4,5, co nie symuluje odpowiednio często przewlekłej natury tych infekcji. Aby rozwiązać ten problem, niektóre modele wykorzystują implantację ciał obcych, takich jak kulki agarowe, implanty silikonowe lub żele alginianowe6,7,8. Inne modele wykorzystują myszy, które mają obniżoną odporność z powodu zaawansowanego wieku, otyłości lub cukrzycy, lub za pomocą środków farmakologicznych, takich jak neutropenia wywołana cyklofosfamidem9,10,11,12. Jednak użycie ciał obcych lub gospodarzy z obniżoną odpornością prawdopodobnie zmienia miejscowy proces zapalny, co utrudnia zrozumienie patofizjologii związanej z przewlekłymi infekcjami ran u gospodarzy o normalnym układzie odpornościowym.
Opracowaliśmy chroniczny model zakażenia ran P. aeruginosa u myszy, który obejmuje opóźnione zaszczepienie bakteriami po zranieniu wycinającym. Opóźniona inokulacja pozwala na eksperymenty oceniające obciążenie bakteryjne trwające co najmniej 7 dni. Model ten otwiera nowe możliwości badania zarówno patogenezy, jak i nowych metod leczenia przewlekłych zakażeń P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań</td><td>Hospira</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 sterylna igła</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 sterylna igła</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Wacik nasączony alkoholem</td><td>Oprogramowanie do</td> obrazowania <td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Aura</td><td>Instrumenty spektralne Obrazowanie</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Frederick Company</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>samce myszy C57BL/6J</td><td></td><td>Jednorazowy</td> dziurkacz do biopsji Jackson Laboratory 000664<td></td></tr>, <tr><td>6mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - Narzędzia naukowe z węglika wolframu</td><td></td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Suchy sterylizator z kulkami szklanymi</td><td>Aparat Harvard</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>Granulowany agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka grzewcza</td><td>Milliard</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z igłą 28 G</td><td>System</td> obrazowania BD <td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X</td><td>Instrumenty spektralne Obrazowanie</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>bulionu LB</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leur-Lok 1 mL strzykawka</td><td>Trymer do włosów BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mini Arco</td><td>Wahl Professional</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>Nair Balsam do depilacji z olejkiem dla niemowląt</td><td>Church i Dwight</td><td>n/a</td><td>Dostępne w każdej aptece</td></tr><tr><td>Kleszcze ośmiokątne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sokół</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Press and Seal Cling Wrap</td><td>Glad</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SafetyGlide Strzykawka insulinowa z igłą 30 G</td><td></td> Strzykawka insulinowa BD <td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW</td><td>Waga 305934</td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td></td><td>Ohaus Scout Pro</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Suplement diety</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>29908</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran pseudomonas aeruginosa

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) jest głównym patogenem szpitalnym o rosnącym znaczeniu dla ludzkiego zdrowia i chorób, szczególnie w przypadku przewlekłych infekcji ran u pacjentów z cukrzycą i hospitalizowanych. Istnieje pilna potrzeba stworzenia modeli przewlekłych infekcji, które pomogą w badaniu patogenezy ran i opracowywaniu nowych terapii przeciwko temu patogenowi. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje opóźnioną inokulację 24 godziny po zranieniu wycinającym na całej grubości. Zakażenie tymczasowej macierzy rany obecne w tym czasie zapobiega szybkiemu usuwaniu lub rozprzestrzenianiu się infekcji, a zamiast tego ustanawia przewlekłą infekcję trwającą 7–10 dni bez konieczności implantacji ciał obcych lub supresji immunologicznej. Protokół ten naśladuje typowy czasowy przebieg infekcji pooperacyjnej u ludzi. Zastosowanie luminescencyjnego szczepu P. aeruginosa (PAO1:lux) pozwala na ilościową codzienną ocenę obciążenia bakteryjnego infekcjami ran P. aeruginosa. Ten nowatorski model może być użytecznym narzędziem w badaniach patogenezy bakteryjnej i opracowywaniu nowych terapii przewlekłych zakażeń ran wywołanych przez P. aeruginosa.

Wykorzystując luminescencyjny szczep PAO1 z plazmidem kodującym system raportujący luxABCDE (PAO1:lux), wykonaliśmy u myszy rany wycinane, które 24 h później zaszczepiliśmy planktonicznymi P. aeruginosa, a następnie mierzyliśmy obciążenie bakteryjne w czasie (Rycina 1 i Rycina 2). Reprezentatywny obraz uzyskany za pomocą optycznego systemu obrazowania wykazuje, że model ten skutkuje wykrywalną luminescencją (<strong clas...

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ opisuje model przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa bez konieczności implantacji ciała obcego lub supresji immunologicznej. Opóźnione inokulacje Pseudomonas aeruginosa 24 godziny po zranieniu przez wycięcie pełnej grubości proteli powoduje szybkie usunięcie i rozprzestrzenienie się bakterii, powodując infekcję, która trwa od siedmiu do 10 dni. Ten unikalny model będzie użytecznym narzędziem do badań patogenezy bakterii, interakcji patogenów gospodarza oraz opracowywania nowych terapii przewlekłych zakażeń ran Pseudomonas aeruginosa.W demonstracji procedury będzie mi pomagał Dan Liu, student medycyny z Bollyky Laboratory. Przed rozpoczęciem zabiegu zważ znieczuloną mysz w wieku od ośmiu do 12 tygodni, aby uzyskać wagę wyjściową i umieść mysz w pozycji leżącej. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, wstrzyknij podskórnie myszy 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego sterylnego 0,9% chlorku sodu na każdą flankę.Użyj golarki elektrycznej, aby usunąć włosy z grzbietowej części myszy i nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na odsłoniętą skórę. Po 20 do 60 sekundach usuń włosy i nadmiar balsamu gazą zwilżoną w ciepłej wodzie. W przypadku operacji rany wycinającej o pełnej grubości, najpierw użyj igły o rozmiarze 25, aby wstrzyknąć podskórnie od 0,6 do jednego miligrama na kilogram buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu w środkowej części grzbietu myszy i przetrzyj miejsce operacji w okrężny sposób trzema alternatywnymi sterylnymi wacikami Betadine i nasączonymi alkoholem.Umieść plastikową folię spożywczą na polu operacyjnym i rozciągnij skórę doogonowo. Gdy skóra wyschnie, użyj sterylnego stempla do biopsji skóry o średnicy sześciu milimetrów, aby wykonać pierwsze nacięcie przez lewy naskórek grzbietowy, a następnie drugie nacięcie na prawym naskórku grzbietowym. Użyj kleszczy, aby namiotować skórę od środka lewego zarysowanego obszaru rany i użyj nożyczek, aby wyciąć warstwy naskórka i skóry właściwej.Po powtórzeniu nacięcia na prawym zarysowanym obszarze rany w celu utworzenia symetrycznych ran wycinających, należy przemyć obie rany 50 mikrolitrami sterylnej soli fizjologicznej. Gdy miejsce operacji i otaczająca go skóra wyschną, przykryj rany i grzbiet przezroczystym opatrunkiem filmowym i umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. 24 godziny po operacji ponownie zważyć znieczuloną mysz i wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego sterylnego 0,9% chlorku sodu w obie strony.Następnie załaduj 100 mikrolitrów luminescencyjnej zawiesiny szczepu P.aeruginosa do 500-mikrolitrowej strzykawki z tuberkulinową nakrętką wyposażoną w igłę o rozmiarze 27 i wstrzyknij 40 mikrolitrów zawiesiny bakterii przez przezroczysty opatrunek foliowy do każdej rany. Upewnij się, że zawiesina bakteryjna jest dobrze wymieszana, a przezroczysty opatrunek jest nienaruszony. Upewnij się, że przekłułeś przezroczysty opatrunek tylko raz ramką igły do góry.Następnie umieść mysz z powrotem w klatce na stronie grzewczej z monitorowaniem i podaj wysokokaloryczną pastę z suplementem diety umieszczoną między granulkami żywności na podłodze klatki. Umieść pozostały inokulum na płytce agarowej LB i policz kolonie, aby potwierdzić liczbę podanych bakterii. W przypadku obrazowania in vivo zakażonych ran należy postępować zgodnie z dwoma protokołami bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi transportu myszy do i z instrumentu do obrazowania i umieścić znieczuloną mysz w pozycji leżącej w komorze obrazowania.W oprogramowaniu do obrazowania ustaw czas ekspozycji, binowanie, przysłonę i pole widzenia odpowiednio do eksperymentu. Następnie utwórz obszar zainteresowania w miejscu rany i zmierz średni wykryty strumień w fotonach na sekundę. Aby zmierzyć tło, utwórz obszar zainteresowania na losowym obszarze na platformie obrazowania i odejmij liczbę fotonów tła na sekundę.Pod koniec eksperymentu, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby wyciąć łożyska ran i umieść każde łóżko w jednym mililitrze sterylnego PBS w 1,5-mililitrowej probówce polipropylenowej. Zmiel tkankę rany nożyczkami i inkubuj kawałki tkanki na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 300 obrotach na minutę przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji należy wirować każdą probówkę przez 10 sekund przed seryjnym rozcieńczeniem ścieków bakteryjnych w PBS i posianiem rozcieńczonych ścieków bakteryjnych na agarze LB w celu ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego.Ten reprezentatywny obraz uzyskany za pomocą systemu optycznego do obrazowania pokazuje, że model ten skutkuje wykrywalną luminescencją. W tym eksperymencie infekcja osiągnęła szczyt w trzecim dniu po inokulacji i utrzymywała się siedem dni po inokulacji w oparciu zarówno o bioluminescencję, jak i liczbę kolonii. Hodowla bakterii wyizolowanych z rany pokazuje ponadto, że ilościowo określone jednostki tworzące kolonie na ranę korelują z wykrytą luminescencją.Chociaż natychmiast po wstrzyknięciu następuje początkowa szybka utrata masy ciała, zastrzyki z soli fizjologicznej i dodatkowe odżywianie mogą przywrócić myszy do ich początkowej wagi. Obliczona dawka inokulacji, z której 50% ran zostanie znacznie zakażonych, została określona na około 7,7 razy 10 do drugiej jednostki tworzącej kolonię na mililitr. Dawki większe niż jeden razy 10 do czwartej jednostki tworzącej kolonię na mililitr powodują 100% wskaźnik infekcji.Po zabiegach ranienia i inokulacji można zastosować różne metody leczenia miejscowego i ogólnoustrojowego w celu zbadania nowych potencjalnych terapii Pseudomonas aeruginosa. Wszystkie prace z Pseudomonas aeruginosa i zakażonymi myszami powinny być prowadzone z zachowaniem środków ostrożności BSL-2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego i stosowania zwierząt przez badacza.

a-delayed-inoculation-model-chronic-pseudomonas-aeruginosa-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: de Vries, C. R., et.al. Model opóźnionej inokulacji przewlekłej infekcji rany Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje opóźnione szczepienie luminescencyjnego Pseudomonas aeruginosa u myszy noszącej dwie pełnogrube rany grzbietowe pokryte przezroczystym opatrunkiem foliowym. Ułatwia to powstawanie biofilmu i powstawanie przewlekłych infekcji. Regularne monitorowanie bioluminescencji umożliwia ilościowe określenie obciążenia bakteriami oraz śledzenie postępu infekcji...

Opracowywanie mysiego modelu przewlekłej infekcji skóry Pseudomonas aeruginosa 

Opisujemy metodę koralików agarowych w celu ustalenia trwałego, długotrwałego przewlekłego zakażenia dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.

Długotrwałe przewlekłe zakażenie dróg oddechowych Pseudomonas aeruginosa u myszy

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

Tutaj opisujemy nowy model myszy z cukrzycą, wykorzystujący bezwłose myszy do nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym infekcji ran biofilmu bioluminescencyjnych Pseudomonas aeruginosa. Metodę tę można zaadaptować do oceny infekcji innymi gatunkami bakterii i mikroorganizmami modyfikowanymi genetycznie, w tym biofilmami wielogatunkowymi, oraz do testowania skuteczności strategii zwalczania biofilmu.

Przejdźmy na jasną stronę mocy: monitorowanie in vivo zakażeń biofilmem Pseudomonas aeruginosa w ranach przewlekłych w modelu myszy bezwłosej z cukrzycą

Tutaj opisujemy protokół, który umożliwia analizę histologiczną i molekularną próbek skóry po śródskórnym wstrzyknięciu Candida albicans. Protokół ten utrzymuje integralność strukturalną skóry i pozwala na lokalizację komórek odpornościowych rezydujących w tkance lub nowo zrekrutowanych, a także dystrybucję patogenów.

Głęboka iniekcja skórna jako model zakażenia skóry Candida albicans do analiz histologicznych

Z tym artykułem związana jest aktualizacja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć aktualizację. Przewlekłe rany powstają z ostrych ran na mysim modelu cukrzycowym poprzez wywołanie wysokiego poziomu stresu oksydacyjnego po pełnej grubości rany skórnej. Rana jest leczona inhibitorami katalazy i peroksydazy glutationowej, co powoduje upośledzenie gojenia i rozwoju biofilmu przez bakterie obecne w mikrobiomie skóry.

Protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą

Infekcja stawu okołoprotezowego (PJI) spowodowana przez niebezpieczne patogeny jest powszechna w ortopedii klinicznej. Istniejące modele zwierzęce nie są w stanie dokładnie symulować rzeczywistej sytuacji PJI. W tym miejscu stworzyliśmy mysi model PJI związany z biofilmem Candida albicans, aby badać i opracowywać nowe terapie PJI.

Model zakażenia Candida albicans stawu okołoprotezowego u myszy

Przewlekłe rany, które są odporne na antybiotyki, stanowią poważne zagrożenie dla systemu opieki zdrowotnej. Infekcje biofilmem są uporczywe i wrogie i mogą powodować nieprawidłowe zamykanie się ran. Przedstawiamy klinicznie istotny model świń z przewlekłymi ranami pełnej grubości zakażonymi biofilmem. Model ten jest przydatny zarówno w badaniach mechanistycznych, jak i w testowaniu interwencji.

Świński model zakażenia biofilmem i niewidocznymi ranami

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Poznaj model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa u myszy immunokompetentnych. Ta metoda umożliwia badanie patogenezy bakterii i interakcji gospodarz-patogen bez konieczności supresji immunologicznej.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Przeglądaj więcej filmów