Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Protokół ten jest istotny, ponieważ opisuje model przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa bez konieczności implantacji ciała obcego lub supresji immunologicznej. Opóźnione inokulacje Pseudomonas aeruginosa 24 godziny po zranieniu przez wycięcie pełnej grubości proteli powoduje szybkie usunięcie i rozprzestrzenienie się bakterii, powodując infekcję, która trwa od siedmiu do 10 dni. Ten unikalny model będzie użytecznym narzędziem do badań patogenezy bakterii, interakcji patogenów gospodarza oraz opracowywania nowych terapii przewlekłych zakażeń ran Pseudomonas aeruginosa.

W demonstracji procedury będzie mi pomagał Dan Liu, student medycyny z Bollyky Laboratory. Przed rozpoczęciem zabiegu zważ znieczuloną mysz w wieku od ośmiu do 12 tygodni, aby uzyskać wagę wyjściową i umieść mysz w pozycji leżącej. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania, wstrzyknij podskórnie myszy 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego sterylnego 0,9% chlorku sodu na każdą flankę.

Użyj golarki elektrycznej, aby usunąć włosy z grzbietowej części myszy i nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na odsłoniętą skórę. Po 20 do 60 sekundach usuń włosy i nadmiar balsamu gazą zwilżoną w ciepłej wodzie. W przypadku operacji rany wycinającej o pełnej grubości, najpierw użyj igły o rozmiarze 25, aby wstrzyknąć podskórnie od 0,6 do jednego miligrama na kilogram buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu w środkowej części grzbietu myszy i przetrzyj miejsce operacji w okrężny sposób trzema alternatywnymi sterylnymi wacikami Betadine i nasączonymi alkoholem.

Umieść plastikową folię spożywczą na polu operacyjnym i rozciągnij skórę doogonowo. Gdy skóra wyschnie, użyj sterylnego stempla do biopsji skóry o średnicy sześciu milimetrów, aby wykonać pierwsze nacięcie przez lewy naskórek grzbietowy, a następnie drugie nacięcie na prawym naskórku grzbietowym. Użyj kleszczy, aby namiotować skórę od środka lewego zarysowanego obszaru rany i użyj nożyczek, aby wyciąć warstwy naskórka i skóry właściwej.

Po powtórzeniu nacięcia na prawym zarysowanym obszarze rany w celu utworzenia symetrycznych ran wycinających, należy przemyć obie rany 50 mikrolitrami sterylnej soli fizjologicznej. Gdy miejsce operacji i otaczająca go skóra wyschną, przykryj rany i grzbiet przezroczystym opatrunkiem filmowym i umieść mysz w czystej klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. 24 godziny po operacji ponownie zważyć znieczuloną mysz i wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie 250 mikrolitrów wstępnie podgrzanego sterylnego 0,9% chlorku sodu w obie strony.

Następnie załaduj 100 mikrolitrów luminescencyjnej zawiesiny szczepu P.aeruginosa do 500-mikrolitrowej strzykawki z tuberkulinową nakrętką wyposażoną w igłę o rozmiarze 27 i wstrzyknij 40 mikrolitrów zawiesiny bakterii przez przezroczysty opatrunek foliowy do każdej rany. Upewnij się, że zawiesina bakteryjna jest dobrze wymieszana, a przezroczysty opatrunek jest nienaruszony. Upewnij się, że przekłułeś przezroczysty opatrunek tylko raz ramką igły do góry.

Następnie umieść mysz z powrotem w klatce na stronie grzewczej z monitorowaniem i podaj wysokokaloryczną pastę z suplementem diety umieszczoną między granulkami żywności na podłodze klatki. Umieść pozostały inokulum na płytce agarowej LB i policz kolonie, aby potwierdzić liczbę podanych bakterii. W przypadku obrazowania in vivo zakażonych ran należy postępować zgodnie z dwoma protokołami bezpieczeństwa biologicznego dotyczącymi transportu myszy do i z instrumentu do obrazowania i umieścić znieczuloną mysz w pozycji leżącej w komorze obrazowania.

W oprogramowaniu do obrazowania ustaw czas ekspozycji, binowanie, przysłonę i pole widzenia odpowiednio do eksperymentu. Następnie utwórz obszar zainteresowania w miejscu rany i zmierz średni wykryty strumień w fotonach na sekundę. Aby zmierzyć tło, utwórz obszar zainteresowania na losowym obszarze na platformie obrazowania i odejmij liczbę fotonów tła na sekundę.

Pod koniec eksperymentu, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby wyciąć łożyska ran i umieść każde łóżko w jednym mililitrze sterylnego PBS w 1,5-mililitrowej probówce polipropylenowej. Zmiel tkankę rany nożyczkami i inkubuj kawałki tkanki na wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 300 obrotach na minutę przez dwie godziny. Pod koniec inkubacji należy wirować każdą probówkę przez 10 sekund przed seryjnym rozcieńczeniem ścieków bakteryjnych w PBS i posianiem rozcieńczonych ścieków bakteryjnych na agarze LB w celu ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego.

Ten reprezentatywny obraz uzyskany za pomocą systemu optycznego do obrazowania pokazuje, że model ten skutkuje wykrywalną luminescencją. W tym eksperymencie infekcja osiągnęła szczyt w trzecim dniu po inokulacji i utrzymywała się siedem dni po inokulacji w oparciu zarówno o bioluminescencję, jak i liczbę kolonii. Hodowla bakterii wyizolowanych z rany pokazuje ponadto, że ilościowo określone jednostki tworzące kolonie na ranę korelują z wykrytą luminescencją.

Chociaż natychmiast po wstrzyknięciu następuje początkowa szybka utrata masy ciała, zastrzyki z soli fizjologicznej i dodatkowe odżywianie mogą przywrócić myszy do ich początkowej wagi. Obliczona dawka inokulacji, z której 50% ran zostanie znacznie zakażonych, została określona na około 7,7 razy 10 do drugiej jednostki tworzącej kolonię na mililitr. Dawki większe niż jeden razy 10 do czwartej jednostki tworzącej kolonię na mililitr powodują 100% wskaźnik infekcji.

Po zabiegach ranienia i inokulacji można zastosować różne metody leczenia miejscowego i ogólnoustrojowego w celu zbadania nowych potencjalnych terapii Pseudomonas aeruginosa. Wszystkie prace z Pseudomonas aeruginosa i zakażonymi myszami powinny być prowadzone z zachowaniem środków ostrożności BSL-2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego i stosowania zwierząt przez badacza.