8 lutego 2020
Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły do analizy jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka, które są ważnymi metodami badania neuronalnych mechanizmów plastyczności wzrokowej w okresie krytycznym oraz wpływu określonych genów na rozwój wzrokowy.
Jednooczna deprywacja wzrokowa jest doskonałym protokołem eksperymentalnym do indukowania pierwotnej plastyczności odpowiedzi kory wzrokowej. Zwykle neurony w obuocznym segmencie pierwszorzędowej kory wzrokowej u myszy reagują około dwa razy silniej na stymulację oka przeciwległego niż oka ipsilateralnego. Jednak zszycie oka przeciwległego w okresie krytycznym dla plastyczności dominacji oka powoduje szybką utratę odpowiedzi neuronów V1 na przeciwległą stymulację oka, a także późniejszy wzrost odpowiedzi na oko ipsilateralne.
W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny protokół deprywacji jednoocznej i proponujemy powszechnie stosowaną metodę analizy trendu dominacji oka podczas deprywacji wzrokowej. Umieść narzędzia chirurgiczne w aluminiowym pudełku i sterylizuj je w autoklawie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez pół godziny. Przygotuj 2% roztwór agarozy w czajniku do kąpieli wodnej i utrzymuj go w temperaturze 75 stopni Celsjusza.
Nałóż cienką warstwę maści na oczy na oba oczy. Pod mikroskopem anatomicznym z oświetleniem zszyj powieki. Wykonaj około czterech ściegów.
Utwórz dwa do trzech węzłów gwintu. Nałóż trzy mikrolitry kleju szybkoschnącego 502 na głowę węzła, aby zwiększyć stabilność węzła. Następnie odetnij nić tak krótką, jak najkrótszą.
Kiedy mysz jest w pełni obudzona, umieść ją w oddzielnej klatce. Przed zapisem elektrofizjologicznym należy użyć izofluranu do znieczulenia myszy. Zdejmij szwy i odsłoń gałkę oczną.
Ostrożnie przytnij powiekę. Przepłukać oczy roztworami soczewek kontaktowych i sprawdzić, czy oczy są czyste. Można używać tylko myszy o dobrym stanie gałek ocznych.
Po znieczuleniu myszy umieść mysz na ramce stereotaktycznej. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała przez cały zabieg. Nałóż maść na oczy na powierzchnię oczu, aby była wilgotna.
Usuń włosy z myszy, aby odsłonić jej skórę. Naciąć ośmiomilimetrowy obszar skóry pomnożony przez osiem milimetrów między oboma uszami, aby odsłonić czaszkę i usunąć tkankę skóry głowy. Następnie usuń leżącą nad nią tkankę łączną za pomocą nadtlenku wodoru.
Wywierć otwór w czaszce nad móżdżkiem. Zamocuj małą kostną w otworze jako odniesienie. Wykonaj małą kraniotomię o średnicy jednego milimetra w okolicy lornetki V1.
Ostrożnie usuń fragment czaszki, nie uszkadzając mózgu. Przykryj odsłoniętą powierzchnię kory 2% agarozą, aby zapobiec wysuszeniu. Zamocuj elektrodę wolframową na ramie stereotaktycznej.
Umieść elektrodę wolframową pionowo w obszarze lornetki V1, aby upewnić się, że rejestrowane komórki reagują na oba oczy. Bodziec jest oddalony o 30 stopni w losowym bloku. W każdym pomiarze zaprezentowano łącznie od trzech do pięciu bloków.
Zamaskuj jedno oko nieprzezroczystą plastikową płytką. Umieść wyświetlacz LCD1 w odległości 23 centymetrów od oczu myszy. Powoli przesuwaj mikroelektrodę za pomocą mikromanipulatora olejowo-hydraulicznego.
Zatrzymaj sygnał o wysokim współczynniku szumów sygnału, gdy elektroda zostanie przesunięta do warstwy czwartej i rozpocznij pomiar. Wzmacniamy aktywność skokową o współczynniku 1 000 i filtrujemy ją od 300 do 10 kiloherców, a następnie próbkujemy z częstotliwością 40 kiloherców. Następnie zamaskuj drugie oko i zmierz reakcję przeciwległego oka.
Sygnały mierzone przez pojedyncze elektrody to działania populacyjne. Użyj oprogramowania, aby oddzielić spajki różnych komórek. Najpierw przefiltruj sygnał od 500 do 5 000 herców.
Ustaw dwa kursory, jeden dla dodatnich skoków odchylenia i jeden dla ujemnych skoków odchylenia. Skonfiguruj szablony spajków. Ustaw obszar szablonów w miejscu, w którym pokazuje największe różnice między różnymi klasami spajków.
Użyj analizy głównych składników, aby rozdzielić je na klastry. Klasyfikowanie skoków granicy przy użyciu algorytmu K średnich. Skoreluj orientację z szybkością wystrzeliwania kolców i wykreśl krzywe dostrajania orientacji dla oczu ipsilateralnych i przeciwległych.
Następnie oblicz wskaźnik OD dla pojedynczych komórek, który reprezentuje odpowiedź przeciwną i ipsilateralną Przypisz wynik OD dla każdej komórki zgodnie ze wskaźnikiem OD. Oblicz wskaźnik odchylenia kontralateralnego zgodnie ze wzorem. Ten diagram przedstawia krzywe strojenia orientacji oka ipsilateralnego i kontralateralnego u myszy jednoocznej i bez deprywacji.
Protokół ten umożliwia skuteczną jednooczną deprywację wzrokową i pomiar dominacji oka u myszy pozbawionej i niepozbawionej wzroku w krytycznym okresie. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić ten eksperyment i przeanalizowaliśmy zmianę dominacji oka podczas deprywacji wzrokowej. Podczas eksperymentu ważne jest, aby unikać infekcji w procesie szycia i interakcji podczas rejestracji elektrofizjologicznej.
Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły deprywacji wzrokowej monokularnej oraz analizy plastyczności dominacji ocznej, które są kluczowe dla badania neuronalnych mechanizmów plastyczności wzrokowej w okresie krytycznym. Omówiono również wpływ konkretnych genów na rozwój wzroku.
Monokularna deprywacja wzrokowa wraz z ilościowym pomiarem dominacji ocznej stanowi solidną platformę do badania plastyczności obwodów neuronalnych oraz funkcji genów podczas krytycznych okien rozwojowych. Podejście to umożliwia wysoką pewność walidacji celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w procesach badawczych nad neurorozwojem. Powtarzalne wyniki tej metody wspierają ciągłość translacyjną od wczesnej fazy odkryć po ewaluację w modelach przedklinicznych.
Niniejszy protokół wpisuje się w ciąg procesów od odkrycia do badań przedklinicznych w obszarze neurorozwoju i układu wzrokowego, wspierając zarówno fazę walidacji celu, jak i identyfikacji wiodących cząsteczek.