Name: Pomiar jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka w pierwszorzędowej korze wzrokowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj protokoły jednoocznej deprywacji wzrokowej i analizy plastyczności dominacji oka w korze wzrokowej myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy neuronalne plastyczności wzrokowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81571770, 81771925, 81861128001).

W niniejszym protokole samce myszy C57Bl/6 zostały pozyskane z Instytutu Zwierząt Laboratoryjnych Akademii Nauk Medycznych Syczuanu oraz Prowincjonalnego Szpitala Ludowego w Syczuanie. Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Nauki i Technologii Elektronicznej w Chinach.
1. Jednostronna deprywacja wzrokowa (MD) w 28. dniu po urodzeniu u myszy
<ol>
	<li>Narzędzia chirurgiczne, igłę do szycia (średnica 0,25 mm, średnica nici 0,07 mm) oraz patyczki bawełniane umieścić w aluminiowym pudełku i autoklawować w temperaturze 120 °C przez 0,5 h. Komorę sterylną zdezynfekować 75% etanolem. Narzędzia chirurgiczne wysuszyć w suszarce laboratoryjnej.</li>
	<li>Przygotować 2% roztwór agarozy i umieścić go w kąpieli wodnej w temperaturze 75 °C, aby zapobiec krzepnięciu.</li>
	<li>Do znieczulenia myszy zastosować izofluran zmieszany z tlenem (2% indukcja i 1,2–1,5% podtrzymanie). Myszy unieruchomić w aparacie stereotaksycznym i zastosować urządzenie do regulacji ciepła, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C i zapobiec hipotermii.</li>
	<li>Na oba oczy nanieść cienką warstwę maści do oczu na bazie wazeliny.</li>
	<li>Pod mikroskopem anatomicznym z oświetleniem zaszyć powiekę jednego oka. Przeciągnąć igłę przez obie strony powieki 2x (Rysunek 1A) i wykonać około czterech szwów.</li>
	<li>Zawiązać nić 2–3x, a następnie przyciąć. Na węzeł nanieść 3 μL kleju błyskawicznego, aby zwiększyć jego stabilność. Następnie odciąć nadmiar nici chirurgicznej.</li>
	<li>Wykonać u myszy dostryskę doprzewnowiskową buprenorfiny (1 mg/kg).</li>
	<li>Przenieść mysz na matę grzewczą, aby utrzymać temperaturę jej ciała na poziomie 37 °C i zapobiec hipotermii, oraz monitorować zwierzę aż do odzyskania przytomności.</li>
	<li>Gdy mysz całkowicie się obudzi, umieścić ją w osobnej klatce obserwacyjnej.</li>
	<li>Codziennie sprawdzać powieki, aby upewnić się, że pozostają zamknięte i nie są zainfekowane. Wykluczyć mysz w przypadku stwierdzenia otwarcia powieki.</li>
	<li>Przed rejestracją elektrofizjologiczną znieczulić mysz izofluranem zmieszanym z tlenem (2% indukcja i 1,2–1,5% podtrzymanie).</li>
	<li>Usunąć szwy za pomocą nożyczek okulistycznych, aby odsłonić gałkę oczną. Ostrożnie przyciąć powieki.</li>
	<li>Przepłukać oko roztworem do soczewek i sprawdzić przejrzystość oka pod mikroskopem. Wykluczyć myszy z mętnością rogówki lub oznakami infekcji.</li>
</ol>
2. Kraniotomia w obszarze binokularnym V1 myszy po deprywacji monokularnej w 4. dniu
<ol>
	<li>Po znieczuleniu myszy należy sprawdzić głębokość znieczulenia, obserwując brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Umieścić i unieruchomić mysz w aparacie stereotaksycznym. Dostosować wysokość prętów usznych i wspornika zębowego, aby mózg był w pozycji płaskiej i stabilnej.</li>
	<li>Użyć mata grzewczego w celu utrzymania temperatury ciała.</li>
	<li>Nanieść maść do oczu na bazie wazeliny na powierzchnię oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	<li>Usunąć sierść z głowy myszy, aby odsłonić skórę. Przetrzeć skórę naprzemiennie jodyną i 70% etanolem (3 razy).</li>
	<li>Wyciąć obszar skóry o wymiarach 8 x 8 mm między uszami, aby odsłonić czaszkę, a następnie usunąć tkankę skóry głowy. Następnie usunąć znajdującą się powyżej tkankę łączną za pomocą 30% nadtlenku wodoru.</li>
	<li>Wywiercić otwór o wymiarach 1 x 1 mm w czaszce nad móżdżkiem. W otworze zamocować małą śrubę kostną jako punkt odniesienia.</li>
	<li>Wykonać małą kraniotomię o średnicy 1 mm w binokularnym obszarze V1 w półkuli przeciwległej do oka pozbawionego stymulacji (Rysunek 1B, A-P: lambda -0.51–lambda +1.67 mm; M-L: -2.6– -3.0 mm; D-V: 0–1 mm). Ostrożnie usunąć fragment czaszki, nie uszkadzając mózgu.</li>
	<li>Przykryć odsłoniętą powierzchnię kory 75 μL 2% agarozy w temperaturze 40 °C, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>Zamocować elektrodę wolframową w ramie stereotaksycznej. Umieścić elektrodę wolframową pionowo na powierzchni odsłoniętej kory, w obszarze binokularnym V1, aby upewnić się, że rejestrowane komórki reagują na oba oczy.</li>
	<li>Używać patyczków bawełnianych do usuwania żelu do oczu i nanosić olej silikonowy na oko co 2 h.</li>
</ol>
3. Stymulacja wzrokowa i rejestracja elektrofizjologiczna
<ol>
	<li>Zasłoń jedno oko nieprzezroczystą plastikową płytką. Ustaw monitor LCD w odległości 23 cm od oka myszy.</li>
	<li>Zredukuj stężenie środka znieczulającego do 0,5–0,8%, gdy mysz zostanie w pełni znieczulona.</li>
	<li>Powoli wysuwaj mikroelektrodę za pomocą hydraulicznego mikromanipulatora olejowego. Zatrzymaj go, gdy zaobserwowany zostanie wysoki stosunek sygnału do szumu, a elektroda dotrze do warstwy 4 (Rysunek 1C, głębokość około 250–450 μm). Upewnij się, że współczynnik wzmocnienia jest ustawiony na 1 000, filtr na 300–100 Hz, a częstotliwość próbkowania na 40 Hz.</li>
	<li>Wyświetl na monitorze LED pełnopolową ruchomą kratkę sinusoidalną (Rysunek 1D, 12 kierunków, kontrast 100%, częstotliwość czasowa 2 Hz, częstotliwość przestrzenna 0,04 cykli na stopień).</li>
	<li>Zmierz odpowiedź komórki, stymulując osobno oko ipsilateralne i kontralateralne. Powtórz procedurę łącznie 3–5 razy.</li>
	<li>Zmierz odpowiedzi od pięciu do ośmiu komórek podczas każdego wprowadzenia elektrody. Wykonaj od czterech do sześciu wprowadzeń u każdej myszy.</li>
	<li>Po zakończeniu rejestracji zwiększ przepływ izofluranu do 5% lub więcej, kontynuuj ekspozycję na izofluran przez 1 min, a następnie wykonaj zwichnięcie szyi. 
	UWAGA: Poszczególne punkty wprowadzenia elektrody w strefie binokularnej V1 były oddalone od siebie o co najmniej 200 μm.</li>
</ol>
4. Off-line sortowanie impulsów i analiza danych
<ol>
	<li>Wykrywaj potencjały czynnościowe (spike'i), gdy surowy sygnał przekracza poziom progu. Wyrównaj zarejestrowane potencjały względem pierwszego piku dodatniego lub ujemnego. Użyj oprogramowania do wykrywania potencjałów pochodzących z różnych komórek.</li>
	<li>Ustaw dwa kursory: jeden dla odchylenia dodatniego, a drugi dla ujemnego. Zdefiniuj szablon potencjału (Rysunek 2A). Ustaw obszar szablonu tak, aby obejmował zakres z najistotniejszą zmiennością między różnymi klasami potencjałów.</li>
	<li>Wykorzystaj analizę głównych składowych (PCA), aby rozdzielić je na klastry. Metody klastrowania mogą się różnić w zależności od laboratorium.</li>
	<li>Klasyfikuj potencjały graniczne przy użyciu algorytmu K-średnich.</li>
	<li>Skorelowanie orientacji z częstotliwością wyładowań potencjałów i wykreśl krzywe dostrojenia orientacji dla oka ipsilateralnego i kontralateralnego.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik OD dla pojedynczej jednostki, który reprezentuje stosunek siły odpowiedzi kontralateralnej do ipsilateralnej: 
	<img alt="Wzór na gęstość optyczną, równanie OD ze zmiennymi R_contra, R_ipsi na schemacie naukowym." src="/files/ftp_upload/60600/60600eq1a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Rcontra i Ripsi to odpowiednio optymalna odpowiedź komórki dla oka kontralateralnego i ipsilateralnego, a Rspon to aktywność spontaniczna komórki.</li>
	<li>Przypisz wartości OD w zakresie 1–7 w następujący sposób: od −1 do −0,75 = 1; od −0,75 do −0,45 = 2; od −0,45 do −0,15 = 3; od −0,15 do 0,15 = 4; od 0,15 do 0,45 = 5; od 0,45 do 0,75 = 6; oraz od 0,75 do 1 = 7.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik preferencji kontralateralnej (CBI): 
	<img alt="Równanie CBI do analizy naukowej, wzór ilustrujący metodologię przetwarzania danych." src="/files/ftp_upload/60600/60600eq2a.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> 
	gdzie N to liczba komórek, a nx to liczba komórek z wartościami OD równymi x.</li>
</ol>

<ol><li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monocular+deprivation+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archiv+f%C3%BCr+experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">Effects of monocular deprivation in kittens.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 248 (6), 492-497 (1964).</li>
<li>Daw, N. W., Fox, K., Sato, H., Czepita, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+monocular+deprivation+in+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Critical period for monocular deprivation in the cat visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 67 (1), 197-202 (1992).</li>
<li>Guire, E. S., Lickey, M. E., Gordon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+for+the+monocular+deprivation+effect+in+rats%3A+assessment+with+sweep+visually+evoked+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Critical period for the monocular deprivation effect in rats: assessment with sweep visually evoked potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 81 (1), 121-128 (1999).</li>
<li>Wang, L., Sarnaik, R., Rangarajan, K. V., Liu, X., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+receptive+field+properties+of+neurons+in+the+superficial+superior+colliculus+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visual receptive field properties of neurons in the superficial superior colliculus of the mouse.</a> Journal of Neuroscience. 30 (49), 16573-16584 (2010).</li>
<li>Niell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types%2C+circuits%2C+and+receptive+fields+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell Types, circuits, and receptive fields in the mouse visual cortex.</a> Annual Review of Neuroscience. 38 (1), 413-431 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+specific+interneurons+improves+V1+feature+selectivity+and+visual+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of specific interneurons improves V1 feature selectivity and visual perception.</a> Nature. 488 (8), 379-383 (2012).</li>
<li>Cossell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+excitatory+synaptic+strength+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of excitatory synaptic strength in primary visual cortex.</a> Nature. 518 (2), 399-403 (2015).</li>
<li>Lacaruso, M. F., Gasler, L. T., Hofer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+visual+space+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of visual space in primary visual cortex.</a> Nature. 547 (7), 449-452 (2017).</li>
<li>Metin, C., Godement, P., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+visual+cortex+in+the+mouse%3A+Receptive+field+properties+and+functional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The primary visual cortex in the mouse: Receptive field properties and functional organization.</a> Experimental Brain Research. 69 (3), 594-612 (1988).</li>
<li>Marshel, J. H., Garrett, M. E., Nauhaus, I., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+seven+mouse+visual+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of seven mouse visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1040-1054 (2011).</li>
<li>Gordon, J. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+binocular+responses+in+the+primary+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of binocular responses in the primary visual cortex of the mouse.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (10), 3274-3286 (1996).</li>
<li>McGee, A. W., Yang, Y., Fischer, Q. S., Daw, N. W., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+plasticity+of+visual+cortex+limited+by+myelin+and+Nogo+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Experience-driven plasticity of visual cortex limited by myelin and Nogo receptor.</a> Science. 309 (5744), 2222-2226 (2005).</li>
<li>Sawtell, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-dependent+ocular+dominance+plasticity+in+adult+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-dependent ocular dominance plasticity in adult visual cortex.</a> Neuron. 38 (6), 977-985 (2003).</li>
<li>Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D., Bonhoeffer, T., Hubener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+experience+enhances+plasticity+in+adult+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prior experience enhances plasticity in adult visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 9 (12), 127-132 (2006).</li>
<li>Crozier, R. A., Wang, Y., Liu, C., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deprivation-induced+synaptic+depression+by+distinct+mechanisms+in+different+layers+of+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deprivation-induced synaptic depression by distinct mechanisms in different layers of mouse visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (4), 1383-1388 (2007).</li>
<li>Tagawa, Y., Kanold, P. O., Majdan, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+periods+of+functional+ocular+dominance+plasticity+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiple periods of functional ocular dominance plasticity in mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 380-388 (2005).</li>
<li>Lickey, M. E., Pham, T. A., Gordon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+contrast+visual+evoked+potentials+and+their+plasticity+following+monocular+deprivation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Swept contrast visual evoked potentials and their plasticity following monocular deprivation in mice.</a> Vision Research. 44, 3381-3387 (2004).</li>
<li>Cang, J., Kalatsky, V. A., Lowel, S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+intrinsic+signal+as+a+measure+of+cortical+plasticity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the intrinsic signal as a measure of cortical plasticity in the mouse.</a> Vision Neuroscience. 22 (5), 685-691 (2005).</li>
<li>Khan, I. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+suturing+techniques+for+cystotomy+closure+in+canines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+%26+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different suturing techniques for cystotomy closure in canines.</a> Journal of Animal & Plant Sciences. 23 (4), 981-985 (2013).</li>
<li>Weisman, D. L., Smeak, D. D., Birchard, S. J., Zweigart, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+continuous+suture+pattern+with+a+simple+interrupted+pattern+for+enteric+closure+in+dogs+and+cats%3A+83+cases+%281991-1997%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of a continuous suture pattern with a simple interrupted pattern for enteric closure in dogs and cats: 83 cases (1991-1997).</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 214 (10), 1507-1510 (1999).</li>
<li>Heneghan, C. P. H., Thornton, C., Navaratnarajah, M., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+isoflurane+on+the+auditory+evoked+response+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22BJA%3A+British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Effect of isoflurane on the auditory evoked response in man.</a> BJA: British Journal of Anaesthesia. 59 (3), 277-282 (1987).</li>
<li>Mitzdorf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+source-density+method+and+application+in+cat+cerebral+cortex%3A+investigation+of+evoked+potentials+and+EEG+phenomenal%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomenal.</a> Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiamy szczegółowy protokół MD i pomiaru plastyczności OD za pomocą rejestracji pojedynczej jednostki. Protokół ten jest szeroko stosowany w neuronauce wizualnej. Chociaż protokół MD nie jest skomplikowany, istnieje kilka krytycznych procedur chirurgicznych, których należy dokładnie przestrzegać. Po pierwsze, są dwa ważne detale zapewniające jakość szwów. Szew jest wystarczająco stabilny, jeśli szwy są skoncentrowane w przyśrodkowej części powieki. Ponadto na główkę węzła nakłada się 3 μl kleju, aby zwiększyć stab...

Deprywacja wzroku monokularowego jest doskonałym eksperymentalnym paradygmatem do badania plastyczności V1. Aby zbadać znaczenie doświadczenia wzrokowego w rozwoju neuronalnym, David Hubel i Torsten Wiesel1,2 pozbawili kocięta normalnego widzenia w jednym oku w różnych punktach czasowych i na różne okresy czasu. Następnie zaobserwowali zmiany w intensywności odpowiedzi w V1 dla oczu pozbawionych i zdrowych. Ich wyniki wykazały nienormalnie niską liczbę neuronów reagujących na oko, które zostało zszyte w ciągu pierwszych trzech miesięcy. Jednak reakcje neuronów u kociąt pozostały identyczne pod każdym względem do tych z normalnego dorosłego oka kota, które było zszywane przez rok, a kocięta nie wyzdrowiały. MD u dorosłych kotów nie może indukować plastyczności OD. W związku z tym wpływ doświadczenia wzrokowego na okablowanie V1 jest silny podczas krótkiej, dobrze zdefiniowanej fazy rozwoju, przed i po której te same bodźce mają mniejszy wpływ. Taka faza zwiększonej podatności na bodźce wzrokowe jest znana jako krytyczny okres w korze wzrokowej.
Chociaż mysz jest zwierzęciem prowadzącym nocny tryb życia, poszczególne neurony w myszy V1 mają podobne właściwości do neuronów występujących u kotów3,4,5. W ostatnich latach, wraz z szybkim rozwojem technologii transgenicznej, coraz więcej badań z zakresu neuronauki wizualnej wykorzystuje myszy jako model eksperymentalny6,7,8. W badaniach wizualnych na myszach neuronaukowcy używają mutantów i nokautujących linii myszy, które umożliwiają kontrolę nad genetycznym składem myszy. Chociaż myszy V1 nie mają kolumn OD, pojedyncze neurony w strefie lornetki V1 wykazują znaczące właściwości OD. Na przykład większość komórek silniej reaguje na stymulację kontralateralną niż na stymulację ipsilateralną. Tymczasowe zamknięcie jednego oka w okresie krytycznym powoduje znaczące przesunięcie w rozkładzie indeksu OD9,10,11. W związku z tym MD można wykorzystać do ustanowienia modelu plastyczności OD w celu zbadania, w jaki sposób geny zaangażowane w zaburzenia rozwoju neuronów wpływają na plastyczność kory mózgowej in vivo.
Tutaj przedstawiamy eksperymentalną metodę MD i sugerujemy powszechnie stosowaną metodę (zapis elektrofizjologiczny) do analizy zmiany plastyczności OD podczas deprywacji wzroku monokularowego. Metoda ta jest szeroko stosowana w wielu laboratoriach od ponad 20 lat12,13,14,15,16. Istnieją również inne metody stosowane do pomiaru plastyczności OD, takie jak przewlekły zapis wizualnego potencjału wywołanego (VEP) 17 i wewnętrzne obrazowanie optyczne (IOI)18. Istotną zaletą tej ostrej metody jest to, że jest łatwa do naśladowania, a wyniki są niezwykle wiarygodne.

<table><tbody><tr><td>502 klej</td><td>M& G Chenguang Stationery Co., Ltd.</td><td></td><td></td>AWG97028</tr><tr><td>Karta nabycia</td><td>National Institument</td><td>PCI-6250</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz Agarose</td><td>Biowest</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td></td> System <td>AM</td><td>Model 1800</td><td></td></tr><tr><td>Atropine</td><td>Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd</td><td>A135946-5</td><td></td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny mózgu</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68001</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Cohan-Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązania w zakresie soczewek kontaktowych</td><td>Pekin Dr. Lun Eye Care Products Co., Ltd.</td><td></td><td></td>GM17064</tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Henan Guangderun Medical Instruments Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na cienką igłę</td><td>SuZhou Stronger Medical Instruments Co., Ltd</td><td>CZQ1370</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>53320A</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>53072</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Stryker</td><td>TP 700 T</td><td></td></tr><tr><td>Iluminator</td><td>Motic China Group Co., Ltd.</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Monitor LCD</td><td>Philips (China) Investment Co., Ltd.</td><td>39PHF3251/T3</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>SOPTOP</td><td>SZMT1</td><td></td></tr><tr><td>Nieinwazyjny monitor parametrów życiowych</td> Mikromanipulator hydrauliczny <td>Mouseox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil</td><td>NARISHIGE International Ltd.</td><td>PC-5N06022</td><td></td></tr><tr><td>Żel pod oczy z wazeliną</td><td>Dezhou Yile Disinfection Technology Co., Ltd.</td><td>17C801</td><td></td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>Spike2 Wersja 9</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>54010</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>66 Vision Tech Co., Ltd.</td><td>54002</td><td></td></tr><tr><td>Igła do szwów</td><td>Ningbo Medical Co., Ltd</td><td>3/8 łuk 2,5 * 8</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda wolframowa</td><td>FHC, Inc</td><td>L504-01B</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Huaqing</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka w pierwszorzędowej korze wzrokowej myszy

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Deprywacja wzroku mookularowego jest doskonałym eksperymentalnym paradygmatem do wywołania pierwotnej plastyczności reakcji kory wzrokowej. Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedź kory na przeciwległe oko na bodziec jest znacznie silniejsza niż odpowiedź oka ipsilateralnego w obuocznym segmencie pierwszorzędowej kory wzrokowej myszy (V1). W okresie krytycznym u ssaków zszycie przeciwległego oka spowoduje szybką utratę reakcji komórek V1 na przeciwległą stymulację oka. Wraz z ciągłym rozwojem technologii transgenicznych, coraz więcej badań wykorzystuje myszy transgeniczne jako modele eksperymentalne do badania wpływu określonych genów na plastyczność dominacji oka (OD). W tym badaniu wprowadzamy szczegółowe protokoły deprywacji wzrokowej monokularu i obliczamy zmianę plastyczności OD u myszy V1. Po deprywacji jednoocznej (MD) przez 4 dni w okresie krytycznym, mierzone są krzywe dostrajania orientacji każdego neuronu, a krzywe strojenia neuronów warstwy czwartej w V1 są porównywane między stymulacją oczu ipsilateralnych i przeciwległych. Wskaźnik odchylenia kontralateralnego (CBI) można obliczyć przy użyciu wyniku OD oka każdej komórki, aby wskazać stopień plastyczności OD. Ta eksperymentalna technika jest ważna dla badania neuronalnych mechanizmów plastyczności OD w okresie krytycznym oraz dla badania roli określonych genów w rozwoju neuronalnym. Głównym ograniczeniem jest to, że ostre badanie nie może zbadać zmiany plastyczności neuronalnej tej samej myszy w innym czasie.

Opisane tutaj wyniki eksperymentalne umożliwiają pomyślne pomiary plastyczności MD i OD u myszy po deprywacji oraz bez deprywacji podczas okresu krytycznego (P19–P32). Rysunek 1 przedstawia sposób wykonywania rejestracji pojedynczych jednostek w warstwie 4 obszaru V1 w strefie binokularnej w celu porównania odpowiedzi oka ipsilateralnego i kontralateralnego 4 dni po MD. Rysunek 2 pokazuje sortowanie impulsów (spike sorting) oraz pomiary dostrojenia orientacyjneg...

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły do analizy jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka, które są ważnymi metodami badania neuronalnych mechanizmów plastyczności wzrokowej w okresie krytycznym oraz wpływu określonych genów na rozwój wzrokowy.

Pomiar jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka w pierwszorzędowej korze wzrokowej myszy

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...

Jednooczna deprywacja wzrokowa jest doskonałym protokołem eksperymentalnym do indukowania pierwotnej plastyczności odpowiedzi kory wzrokowej. Zwykle neurony w obuocznym segmencie pierwszorzędowej kory wzrokowej u myszy reagują około dwa razy silniej na stymulację oka przeciwległego niż oka ipsilateralnego. Jednak zszycie oka przeciwległego w okresie krytycznym dla plastyczności dominacji oka powoduje szybką utratę odpowiedzi neuronów V1 na przeciwległą stymulację oka, a także późniejszy wzrost odpowiedzi na oko ipsilateralne.W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny protokół deprywacji jednoocznej i proponujemy powszechnie stosowaną metodę analizy trendu dominacji oka podczas deprywacji wzrokowej. Umieść narzędzia chirurgiczne w aluminiowym pudełku i sterylizuj je w autoklawie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez pół godziny. Przygotuj 2% roztwór agarozy w czajniku do kąpieli wodnej i utrzymuj go w temperaturze 75 stopni Celsjusza.Nałóż cienką warstwę maści na oczy na oba oczy. Pod mikroskopem anatomicznym z oświetleniem zszyj powieki. Wykonaj około czterech ściegów.Utwórz dwa do trzech węzłów gwintu. Nałóż trzy mikrolitry kleju szybkoschnącego 502 na głowę węzła, aby zwiększyć stabilność węzła. Następnie odetnij nić tak krótką, jak najkrótszą.Kiedy mysz jest w pełni obudzona, umieść ją w oddzielnej klatce. Przed zapisem elektrofizjologicznym należy użyć izofluranu do znieczulenia myszy. Zdejmij szwy i odsłoń gałkę oczną.Ostrożnie przytnij powiekę. Przepłukać oczy roztworami soczewek kontaktowych i sprawdzić, czy oczy są czyste. Można używać tylko myszy o dobrym stanie gałek ocznych.Po znieczuleniu myszy umieść mysz na ramce stereotaktycznej. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała przez cały zabieg. Nałóż maść na oczy na powierzchnię oczu, aby była wilgotna.Usuń włosy z myszy, aby odsłonić jej skórę. Naciąć ośmiomilimetrowy obszar skóry pomnożony przez osiem milimetrów między oboma uszami, aby odsłonić czaszkę i usunąć tkankę skóry głowy. Następnie usuń leżącą nad nią tkankę łączną za pomocą nadtlenku wodoru.Wywierć otwór w czaszce nad móżdżkiem. Zamocuj małą kostną w otworze jako odniesienie. Wykonaj małą kraniotomię o średnicy jednego milimetra w okolicy lornetki V1.Ostrożnie usuń fragment czaszki, nie uszkadzając mózgu. Przykryj odsłoniętą powierzchnię kory 2% agarozą, aby zapobiec wysuszeniu. Zamocuj elektrodę wolframową na ramie stereotaktycznej.Umieść elektrodę wolframową pionowo w obszarze lornetki V1, aby upewnić się, że rejestrowane komórki reagują na oba oczy. Bodziec jest oddalony o 30 stopni w losowym bloku. W każdym pomiarze zaprezentowano łącznie od trzech do pięciu bloków.Zamaskuj jedno oko nieprzezroczystą plastikową płytką. Umieść wyświetlacz LCD1 w odległości 23 centymetrów od oczu myszy. Powoli przesuwaj mikroelektrodę za pomocą mikromanipulatora olejowo-hydraulicznego.Zatrzymaj sygnał o wysokim współczynniku szumów sygnału, gdy elektroda zostanie przesunięta do warstwy czwartej i rozpocznij pomiar. Wzmacniamy aktywność skokową o współczynniku 1 000 i filtrujemy ją od 300 do 10 kiloherców, a następnie próbkujemy z częstotliwością 40 kiloherców. Następnie zamaskuj drugie oko i zmierz reakcję przeciwległego oka.Sygnały mierzone przez pojedyncze elektrody to działania populacyjne. Użyj oprogramowania, aby oddzielić spajki różnych komórek. Najpierw przefiltruj sygnał od 500 do 5 000 herców.Ustaw dwa kursory, jeden dla dodatnich skoków odchylenia i jeden dla ujemnych skoków odchylenia. Skonfiguruj szablony spajków. Ustaw obszar szablonów w miejscu, w którym pokazuje największe różnice między różnymi klasami spajków.Użyj analizy głównych składników, aby rozdzielić je na klastry. Klasyfikowanie skoków granicy przy użyciu algorytmu K średnich. Skoreluj orientację z szybkością wystrzeliwania kolców i wykreśl krzywe dostrajania orientacji dla oczu ipsilateralnych i przeciwległych.Następnie oblicz wskaźnik OD dla pojedynczych komórek, który reprezentuje odpowiedź przeciwną i ipsilateralną Przypisz wynik OD dla każdej komórki zgodnie ze wskaźnikiem OD. Oblicz wskaźnik odchylenia kontralateralnego zgodnie ze wzorem. Ten diagram przedstawia krzywe strojenia orientacji oka ipsilateralnego i kontralateralnego u myszy jednoocznej i bez deprywacji.Protokół ten umożliwia skuteczną jednooczną deprywację wzrokową i pomiar dominacji oka u myszy pozbawionej i niepozbawionej wzroku w krytycznym okresie. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić ten eksperyment i przeanalizowaliśmy zmianę dominacji oka podczas deprywacji wzrokowej. Podczas eksperymentu ważne jest, aby unikać infekcji w procesie szycia i interakcji podczas rejestracji elektrofizjologicznej.Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu.

monocular-visual-deprivation-ocular-dominance-plasticity-measurement

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wideookulografia jest bardzo ilościową metodą badania sprawności motorycznej oczu, a także uczenia się motorycznego. W niniejszym materiale opisujemy sposób przeprowadzania wideookulografii u myszy. Zastosowanie tej techniki u myszy zdrowych, leczzonych farmakologicznie lub modyfikowanych genetycznie stanowi potężne narzędzie badawcze do zgłębiania fizjologii leżącej u podstaw zachowań motorycznych.

Wideookulografia u myszy

Przewlekłe nadciśnienie oczne jest wywoływane za pomocą laserowej fotokoagulacji siatki beleczkowej w oczach myszy. Ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) utrzymuje się podwyższone przez kilka miesięcy po leczeniu laserowym. Spadek ostrości wzroku i wrażliwości na kontrast u zwierząt doświadczalnych monitoruje się za pomocą testu optomotorycznego.

Mysi model przewlekłego nadciśnienia ocznego indukowany laserem w celu scharakteryzowania wad wzroku

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Usunięcie oczu, zwane również enukleacją, stanowi użyteczną strategię do badania aspektów plastyczności wizualnej, międzymodalnej i rozwojowej wzdłuż układu wzrokowego ssaków, ponieważ powoduje nieodwracalną częściową (jednooczną) lub całkowitą (obuoczną) utratę wzroku. W tym miejscu opisujemy wysoce powtarzalne i proste podejście do przeprowadzania enukleacji in vivo.

Wysoce powtarzalna i prosta metoda wykonywania enukleacji oka in vivo u myszy po otwarciu oka

Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.

Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów

Aby zbadać wzrok myszy, przeprowadziliśmy nadciągający test. Myszy umieszczono na dużej kwadratowej arenie z monitorem na suficie. Zbliżający się bodziec wizualny konsekwentnie wywoływał u myszy reakcje zamrożenia lub ucieczki.

Wykorzystanie zbliżających się bodźców wzrokowych do oceny wzroku myszy

Prezentowany tutaj jest protokół oceny obuocznych ruchów gałek ocznych i kontrolowanych przez spojrzenie badań przesiewowych centralnego pola widzenia u uczestników z utratą widzenia centralnego.

Ocena obuocznego centralnego pola widzenia i obuocznych ruchów gałek ocznych w warunkach widzenia dychoptycznego

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół do zamykania żył siatkówki za pomocą róży bengalskiej i sterowanego laserowo systemu obrazowania siatkówki z zaleceniami maksymalizacji jego odtwarzalności w genetycznie modyfikowanych szczepach.

Optymalizacja mysiego modelu niedrożności żyły siatkówki w celu ograniczenia zmienności

Tutaj opisujemy standardowy protokół do ilościowego określania odruchu optokinetycznego. Łączy w sobie wirtualną stymulację bębna i wideookulografię, a tym samym umożliwia precyzyjną ocenę selektywności cech zachowania i jego plastyczności adaptacyjnej.

Kwantyfikacja selektywności cech wzrokowych odruchu optokinetycznego u myszy

Prezentujemy rozwój struktury wyświetlania zależnej od spojrzenia, przeznaczonej do badań percepcyjnych i okoruchowych symulujących utratę widzenia centralnego. Ramy te są szczególnie podatne na adaptację do badania kompensacyjnych strategii behawioralnych i okoruchowych u osób doświadczających zarówno symulowanej, jak i patologicznej utraty widzenia centralnego.

Ramy wyświetlania zależne od spojrzenia do badań nad uczeniem się percepcyjnym z symulowaną utratą widzenia centralnego

Przedstawiamy tutaj kompleksową baterię zadań do oceny widzenia binokularnego. Zadania obejmują stereookość obwodową i ruch w głębi, które nie są oceniane przez obecne testy kliniczne. Włączenie tych zadań zapewni dogłębną ocenę binokularności osoby.

Zestaw ilościowych testów widzenia binokularnego dla dorosłych: Protokoły testowania

Poznaj protokoły jednoocznej deprywacji wzrokowej i analizy plastyczności dominacji oka w korze wzrokowej myszy. Ta metoda pozwala badać mechanizmy neuronalne plastyczności wzrokowej.

Pomiar jednoocznej deprywacji wzrokowej i plastyczności dominacji oka w pierwszorzędowej korze wzrokowej myszy

Przeglądaj więcej filmów